蜡样芽孢杆菌NJSZ-13中蛋白酶ATP-α与ClpX的杀线虫活性研究

【目的】阐明蜡样芽孢杆菌NJSZ-13中杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的杀线分子机制,构建杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的原核表达载体。【方法】克隆杀线蛋白酶编码基因atpA与clpX,利用基因工程手段对杀线蛋白酶编码基因进行PCR扩增,并与载体pET-21b连接构建重组载体,提取重组质粒转入蛋白表达载体大肠杆菌BL21(DE3)。利用菌落PCR和测序验证转化效果。加入IPTG诱导蛋白表达,使用Ni-NTA柱进行重组蛋白的纯化,利用SDS-PAGE与Western blot验证ATP-α与ClpX纯化效果并进行杀线活性测定。【结果】菌落PCR验证和测序表明,重组载体中含有蛋白酶编码基因atpA与clpX,且基因序列与参考序列一致,证明目的基因已经成功插入BL21(DE3)表达载体中。SDSPAGE与Western blot验证表明,重组蛋白得到正确诱导与纯化,成功构建杀线蛋白酶ATP-α与ClpX的原核表达载体。杀线活性测定结果表明ATP-α与ClpX均具有较强的杀线效果。ATP-α在72 h达到66.75%的杀线率,ClpX在72 h达到75.46%的杀线率。同时,两个蛋白酶共同作用杀线能力显著增强,24 h便达到66.32%的杀线率,72 h杀线率达到91.01%。【结论】ATP-α与ClpX经原核表达及纯化后具有较高的杀线活性,且两者共同处理松材线虫,杀线效果更强,证明蛋白酶ATP-α与ClpX是重要的杀线因子,为设计和筛选杀线药物提供了新的线索和依据。

灰葡萄孢培养基种类和继代培养对松材线虫致病力的影响

本试验在8种培养基上培养灰葡萄孢Botrytis cinerea,以灰葡萄孢喂饲松材线虫Bursaphelenchus xylophilus,采用3年生黑松Pinus thunbergii作为接种材料,研究松材线虫繁殖力和致病力的变化,同时探究了在PDA-灰葡萄孢上继代培养84代的松材线虫致病力的变化。结果表明,以玉米、小麦和PDA 3种培养基培养的灰葡萄孢喂饲松材线虫,其繁殖力显著高于CDA和4种合成培养基,其中PDA-灰葡萄孢上的松材线虫数量最多,比合成培养基C或D培养的灰葡萄孢上的线虫数量提升了48.94%;接种PDA-灰葡萄孢组松材线虫的黑松病情指数最高,较最低的合成培养基D-灰葡萄孢组高了47.87%。松材线虫在PDA-灰葡萄孢上继代培养至第14代后,继代次数的增加会导致其致病力下降,接种第79代松材线虫后黑松病情指数已为0。因此,为保证松材线虫的致病力不衰退,应使用PDA-灰葡萄孢培养基喂饲松材线虫,且松材线虫继代培养应控制在14代以内。研究结果将为松材线虫的繁殖技术与致病相关机理分析等提供参考。

几种松树挥发物对松材线虫行为的影响

通过室内生测的方法,研究了几种主要的松树挥发物对松材线虫行为的影响。结果表明,α-异松油烯、β-水芹烯、β-蒎烯抑制松材线虫繁殖,其中α-异松油烯、β-水芹烯抑制力较强,β-蒎烯抑制力较弱,而β-月桂烯、反式-石竹烯、莰烯、异长叶烯和α-蒎烯对线虫繁殖没有影响。β-水芹烯和莰烯具有杀松材线虫活性,β-蒎烯和β-月桂烯增强松材线虫活力,而异长叶烯、α-蒎烯、反式-石竹烯对线虫存活没有影响。β-蒎烯、反式-石竹烯、异长叶烯、莰烯对松材线虫具引诱作用,其中β-蒎烯引诱力最强,反式-石竹烯次之,异长叶烯、莰烯引诱力最弱,而α-蒎烯、β-水芹烯、α-异松油烯和β-月桂烯对线虫无引诱作用。并对几种挥发物在松树抗松材线虫病中的作用进行了讨论。

松材线虫伴生细菌与松树萎蔫病关系的初步研究

利用马尾松水培离体松枝作接种材料 ,接种消毒后的松材线虫、线虫虫体上分离到的细菌分离物GD1以及两者的混合体。结果表明 ,单独接种消毒后的松材线虫或细菌分离物GD1均不能使松枝萎蔫 ,只有两者混合接种才能使松枝发病枯死。

松材线虫对黑松几个生理生化指标的影响

8～ 9年生黑松经 4种处理 (接种松材线虫、1 0 0 μg苯甲酸水溶液处理、无菌水处理并环剥主 干中部树皮以及单独无菌水处理 )后 ,研究了其流脂量、蒸腾作用及叶部过氧化物酶同工酶的变化。结果显示 ,接种后 1 2天 ,所有接虫株松脂分泌停止 ;接种后 2 7天 ,接虫株蒸腾作用下降最明显 ,其平均蒸腾强度为 0 .0 1 45 ml· g-1· h-1。黑松叶部共检出 9条过氧化物酶同工酶带 ,其中 c、d带的相伴出现为接虫株和苯甲酸处理株所特有。文后提出 。

松材线虫病致病机理的研究进展

从病理生理学和与病害相关的微生物2个方面论述了松材线虫病致病机理的研究进展;从6个方面对病理生理学进行了阐述,包括水分代谢、活性氧代谢、苯丙烷类代谢、酶、毒素和激素,并指出了该领域今后的研究方向。

苯甲酸和苯乙酸对松材线虫及细菌活性的影响

在离体条件下,测定了苯甲酸(BA)和苯乙酸(PA)对马尾松(Pinusmassoniana)水培枝叶、松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)及对分离自松材线虫虫体和健康马尾松的细菌菌株GD1和GD2的作用。结果显示,BA和PA对马尾松离体松叶、松枝均具有毒性,其中BA的毒性较强;一定浓度的BA能增强松材线虫的活力,低浓度BA和较高浓度PA均能促进松材线虫的繁殖,低浓度PA能促进菌株GD1的繁殖;高浓度BA和高浓度PA均能抑制松材线虫的活力,其中BA的抑制活性较强;高浓度BA能抑制松材线虫的繁殖,高浓度BA和较高浓度PA均能抑制菌株GD1的繁殖,而BA和PA对菌株GD2繁殖的抑制活性较对菌株GD1的强。

不同地理种群的松材线虫对马尾松的致病力差异

本文对我国主要病区及日本的 4个松材线虫地理种群 ,对 4～ 6年生马尾松的致病力进行了研究。结果表明 ,江苏和广东种群对马尾松的致病力较强 ,感病指数皆为 0 .94,而安徽和日本种群的致病力较弱 ,感病指数分别为 0 .75和 0 .6 9。

MS培养基中硝酸铵替换物对植物生长的影响

筛选适合植物培养基的安全实用的含氮化合物来替换原有的管制药品硝酸铵(NH_(4)NO_(3))为氮源,为植物组织培养提供易获得的培养基组分。以本氏烟(Nicotiana benthamiana)和杨树(Populus×euramericana cv.''Nanlin95'')为试验材料,通过研究有机氮源、无机氮源[硫酸铵(NH_(4))_(2)SO_(4)、磷酸氢二铵(NH_(4))_(2)HPO_(4)]替代物对植物幼根的形成、植株的生长、生物量和叶绿素的积累等指标的影响来判断合适的NH_(4)NO_(3)替换物。在硝酸铵替换方案研究中,烟草在(NH_(4))_(2)SO_(4)替代物培养基上的生长与MS培养基无显著差异;而杨树在适宜浓度的(NH_(4))_(2)SO_(4)培养基上的生长优于MS培养基。(NH_(4))_(2)HPO_(4)高压灭菌后会导致培养基浑浊,不适合作为培养基氮源;在有机氮源的MS培养基上,烟草生长较好,但杨树叶片叶绿素的积累会减少,从而影响植物的生长。以本氏烟和杨树为材料的研究结果表明,利用植物组织培养快速生产技术,(NH_(4))_(2)SO_(4)可以作为MS培养基中NH_(4)NO_(3)的替代物。该结果对于利用MS培养的其他植物同样适用,同时对所有利用NH_(4)NO_(3)为氮源的植物培养基也具有重要的参考价值。

松材线虫与其伴生细菌在寄主内的种群动态

利用马尾松水培离体松枝作接种材料 ,分别接种消毒后的松材线虫、松材线虫伴生细菌坚强芽孢杆菌和松材线虫与坚强芽孢杆菌的混合液 ,以研究松材线虫与其伴生细菌在松枝中的种群动态。结果表明 :松材线虫和坚强芽孢杆菌混合接种 ,松枝发病 ,松枝髓部发生褐变 ,褐变的过程是由接种枝发展到主枝 ,再由主枝下部向上部发展 ,而单独接种松材线虫或坚强芽孢杆菌 ,松枝不发病 ;松材线虫和坚强芽孢杆菌混合接种较单独接种松材线虫 ,松枝中的松材线虫繁殖量大、扩散速度快 ;松材线虫在松枝中扩散的过程是 :接种枝→主枝→侧枝→新梢 ,在主枝中由下部向上部扩散 ;松枝髓部褐变过程和松材线虫在松枝中扩散过程相一致 ,松材线虫扩散分布先行于髓部褐变 ;松材线虫和坚强芽孢杆菌混合接种较单独接种松材线虫或坚强芽孢杆菌初期 ,松枝中致病细菌的检测量大 ,从而提出细菌和松材线虫均是松材线虫病不可缺少的致病因素。文后指出寄主主干下部髓部褐变可用作病害的早期诊断。

三种园林苗木根际寄生线虫种类鉴定初报

从江苏省常州地区一苗圃地10种园林苗木根际采集30份土壤样品,分离鉴定其中的寄生线虫,初步发现3种:双宫螺旋线虫Helicotylenchus dihystera(Cobb,1893)Sher,1961、林伯滑刃线虫Aphelenchoides limberiSteiner,1936和喜悦平滑垫刃线虫Psilencus hilarulusde Man,1921。其中花叶玉簪Hosta plantaginea、洒金桃叶珊瑚Aucuba japonicacv.variegata、萱草Hemerocallis fulva和红花继木Loropetalum chinensevar.rubrum为双宫螺旋线虫的新寄主,金边黄杨Euonymus japonicuscv.au-reo-marginatus、浓香茉莉Jasminum sambac和美丽月见草Oenothera biennis为林伯滑刃线虫的新寄主,红花月季Rosa chinensis、熊掌木Fatshedera lizei、美丽月见草、天人菊Gaillardia pulchella、红花继木和金边黄杨为喜悦平滑垫刃线虫的新寄主。同时,林伯滑刃线虫和喜悦平滑垫刃线虫为江苏省新记录种。

2个细菌菌株对松材线虫存活与繁殖的影响

松材线虫病是松树的一种毁灭性病害,至今其致病机理尚未弄清.自从Oku等[1]首次提出该病与细菌有关以来,对于细菌在病害中的作用一直存在很多争议.

松材线虫伴生细菌的分离鉴定及其致病性

从松材线虫虫体上分离到两个细菌菌株:GD1和R,经鉴定,菌株GD1为坚强芽孢杆菌。利用水培马尾松离体松枝作接种材料,接种消毒后的松材线虫(Bx)、GD1、R、Bx+GD1和Bx+R。结果表明,松材线虫和坚强芽孢杆菌混合接种,松枝发病,松枝流脂减少至停止,蒸腾作用降低,单独接种松材线虫或坚强芽孢杆菌,松枝不发病。菌株R对松材线虫病的发生没有影响。提出松材线虫及其伴生细菌均是松材线虫病不可缺少的致病因素。

几种物质对松材线虫的作用

松材线虫病是松树的一种毁灭性病害。本文选用了几种物质 ,采用浸泡生测法和棉球生测法测定了其对松材线虫的作用。结果表明 ,阿维菌素对松材线虫的杀线活性较强 ,米乐尔次之 ,狼牙刺种子粗提物和氯化铵的杀线活性均较弱 ,氯化钙则无杀线活性。阿维菌素和米乐尔对松材线虫繁殖均有较强的抑制作用 ,狼牙刺种子粗提物的抑制作用较弱 ,氯化铵无抑制作用 。

我国松树寄生线虫名录

目前我国松树寄生线虫有40个已知种和一些未定种,这些种分属于3目9科17属,该文从线虫分布和寄主两个方面列出名录。

光照对松材线虫病潜育期的影响

应用相关回归方法 ,分析了黑松接种松材线虫后 ,病害的潜育期与环境中的日平均温度、日平均日照时数的关系。结果显示 ,病害潜育期与日平均温度呈极显著负相关 ,与日平均日照时数呈显著负相关。

松材线虫病病理生理学研究进展

本文从 6个方面综述了松材线虫病病理生理学的研究现状 ,包括水分生理、物质代谢、酶、毒性代谢物、植物激素以及抗性生理 。

江苏省杨树几种滑刃目线虫种类记述

自2008年6～11月,于江苏省镇江市、扬州市、淮安市、连云港市、苏州市和无锡市采集的108份杨树根系、根际土壤和茎部样品中,共鉴定出滑刃目线虫5种,分别是裂片真滑刃线虫(Aphelenchus sparsus)、螺旋滑刃线虫(Aphelenchoides helicus)、林伯滑刃线虫(Aphelenchoides limberi)、哈克滑刃线虫(Aphelenchoides haguei)和柠檬长尾线虫(Seinura citri)。其中,裂片真滑刃线虫、螺旋滑刃线虫、哈克滑刃线虫和柠檬长尾线虫为江苏省新记录种,同时发现杨树为这4种线虫的新寄主。