广西H9N2亚型禽流感病毒疫苗候选株的筛选

【目的】筛选出免疫原性更优的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗候选株用于新型疫苗研发,为加强对H9N2亚型AIV的防控提供技术支持。【方法】以2000—2020年广西地区分离获得的36株H9N2亚型AIV分离株为试验材料,依据HA基因遗传进化分析选择12株不同年份、不同地域及不同宿主来源的H9N2亚型AIV代表株,与目前使用的商品化H9亚型AIV疫苗株(SS株)进行交叉血凝抑制试验(HI)及抗原性分析,根据抗原分析结果选择其中具有不同抗原差异的代表株制备油乳剂灭活疫苗,并分别与商品化H9亚型AIV疫苗(SS株)进行交叉免疫保护试验。【结果】在36株H9N2亚型AIV广西分离株中有31株属于Y280-Like(9.4.1),其中26株属于分支I、5株属于分支II,另外5株属于G1-Like(h9.4.1),与我国常用疫苗株分属于不同进化分支。12株H9N2亚型AIV广西代表性分离株灭活后的HA效价≥7 log2,病毒灭活效果良好,可用于制备油乳剂灭活疫苗,且制备的油乳剂灭活疫苗稳定性和安全性良好。根据交互HI抗体滴度计算出各毒株间的抗原相关值(R),结果发现A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株(简称C227株)与其他毒株的抗原性无明显差异,对应的R在0.72~0.93间波动;疫苗交叉保护试验结果也表明,C227株制备的油乳剂灭活疫苗对不同毒株的免疫保护率均高于80%,且免疫保护效果优于A/chicken/Guangxi/CX/2013(H9N2)株(简称CX13株),说明C227株更适合作为H9N2亚型AIV灭活疫苗的候选株。【结论】基于抗原性分析和免疫原性测定筛选出的A/chicken/Guangxi/C227/2015(H9N2)株对广西地区绝大部分H9N2亚型AIV流行株的免疫保护效果良好,可作为疫苗候选株用于研制新型H9N2亚型AIV疫苗。

三种贝类原虫多重PCR检测方法的建立

根据基因库中单孢子虫、派琴虫和马尔太虫的基因序列,分别设计了3对特异性引物,通过对多重PCR扩增条件的优化,建立了可同时检测鉴别这3种原虫的多重PCR方法。用该技术对同一样品中的单孢子虫、派琴虫和马尔太虫模板进行扩增,结果均同时得到3条大小与试验设计相符的244 bp(单孢子虫)、596 bp(派琴虫)和478 bp(马尔太虫)的特异性扩增带,对其他贝类病原核酸的扩增结果为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到10 pg的单孢子虫、派琴虫和马尔太虫DNA,提示该技术适用于这3种原虫的临床快速检测和鉴别诊断。

鸭Ⅰ型肝炎病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

为建立一种快速检测鸭Ⅰ型肝炎病毒(DHV I)的方法,本研究根据基因库中DHV Ⅰ基因的保守序列,设计特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了DHV I的RT-LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达10fg,高于常规PCR方法 100倍;全部反应可在1 h内完成;可以通过肉眼观察颜色直接判定结果;对其它鸭常见病原体的检测结果均为阴性。实验结果表明建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于DHV Ⅰ感染的快速检测。

贝类单孢子虫荧光定量PCR检测方法的建立

根据基因库中单孢子虫的基因保守序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了检测单孢子虫的荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫的检测敏感性达到40拷贝数,比常规PCR敏感性高100倍;对派琴虫、折光马尔太虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果全为阴性。表明该研究建立的单孢子虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床单孢子虫感染的快速检测。

番鸭细小病毒荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为建立一种快速检测番鸭细小病毒(MDPV)的方法,本研究根据GenBank中MDPV的REP基因序列,设计一对特异性引物和一条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了检测MDPV的荧光定量PCR方法。检测结果表明,该方法检测敏感性达到20 copies,比常规PCR灵敏度高100倍;而且该方法对鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭副粘病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等的检测均为阴性,具有良好的特异性;该方法的批内和批间的检测变异系数均小于2%。对广西地区鸭群收集的118份病料进行检测,其MDPV阳性率为11.02%。结果提示广西地区的鸭群中MDPV的感染比较普遍,建立的荧光定量PCR方法可以用于MDPV的临床快速检测。

广西PRRSV、PCV、CSF的混合感染及PRRSV分子病原学研究

为了弄清2007年发生于广西一些县市猪场的高致病性猪繁殖与呼吸综合征和其他疾病的混合感染情况，从广西7个县市发生高致病性猪繁殖与呼吸综合征的猪场采集病料，进行猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV）及猪瘟病毒（CSF）检测，并对检测的PRRSV进行分子病原学分析。结果显示，经PCR检测，86份样品中有60份为PRRSV阳性，36份为PCV阳性，2份为CSF阳性，说明发生于广西猪群的PRRSV与PCV共感染情况比较严重。通过PRRSV ORF5基因序列比较分析发现，来自广西7个县市不同猪场的PRRSV高度同源，核苷酸序列同源性为98．5％-99．8％，推导编码的氨基酸序列同源性为98．0％～100．0％；与VR2332和LV株的核苷酸序列同源性分别为88．7％-89．7％和62．2％-63．1％，氨基酸序列同源性分别为88．6％～89．6％和60．5％～61．3％，表明7个县市不同毒株的ORF5基因区域变异不大，均属美洲型。

贝类单孢子虫PCR检测方法的建立

根据基因库中单孢子虫的基因保守序列,设计了1对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立了检测贝类单孢子虫的PCR方法。用该方法对单孢子虫模板进行扩增,得到与试验设计相符的244 bp的特异性条带,而对派琴虫、折光马尔太虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的扩增结果全为阴性。敏感性试验结果表明,该方法最低能检测到100 fg的单孢子虫DNA。

广西高致病性PRRSV Nsp2基因的克隆、序列分析和抗原表位预测

根据猪繁殖与吸吸综合征病毒（PRRSV）VR2332 Nsp2基因序列合成特异性引物，对广西分离的高致病性PRRSV进行RT-PCR扩增，将扩增出的796bp片段插入pMD18-T载体中进行序列测定和分析，并用DNA Star软件对Nsp2基因推导的氨基酸序列进行了表位分析。结果显示，广西3个县、市的PRRSV分离株Nsp2基因第483位和第532位～第560位氨基酸发生缺失，核苷酸序列之间的同源性为97．0％～97．49／6，推导编码的氨基酸序列之间的同源性为93．6％～94．7％；与PRRSV VR2332株、MLV株和CH-1a株核苷酸之间的同源性分别为79．0％～79．2％、78．8％～78．9％和88．2％～89．3％；氨基酸之间的同源性分别为59．4％～60．2％、59．4％～60．2％和70．9％～81．6％，表明广西3个县、市的PRRSV分离株Nsp2基因与VR2332株、MLV株和CH-1a株比较变异较大。表位分析表明，由于博白株的Nsp2基因的第532位～560位氨基酸的缺失，与VR2332株比较，其亲水性、抗原指数均发生了大的变化。

贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重PCR检测方法的建立

根据基因库中单孢子虫和折光马尔太虫的基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别这2种原虫的二重PCR。对同一样品中的单孢子虫和折光马尔太虫模板DNA进行扩增,得到2条大小与试验设计相符的244 bp(单孢子虫)和478 bp(折光马尔太虫)的特异性扩增带,而对派琴虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测,结果均为阴性。敏感性试验表明,该技术最低能检测到10 pg的单孢子虫和折光马尔太虫DNA。

鸭Ⅰ型肝炎病毒荧光定量RT-PCR方法建立及初步应用

根据GenBank中鸭Ⅰ型肝炎病毒的基因序列,设计合成一对引物和一条Taq-Man探针。进行优化后,建立了能够检测鸭Ⅰ型肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性好,检测敏感性达到20个模板拷贝数,比常规PCR灵敏度高100倍;该方法特异性强,对番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鹅细小病毒等6种病原体的检测全为阴性。对广西地区鸭群收集的118份病料进行检测,结果阳性率为1.69%。结果提示:在广西地区的鸭群中,存在鸭Ⅰ型肝炎病毒的感染,建立的荧光定量RT-PCR方法可用于鸭Ⅰ型肝炎病毒的临床快速检测。

贝类折光马尔太虫荧光定量PCR检测方法的建立

根据基因库中折光马尔太虫的基因保守序列,设计合成了一对引物和一条TaqMan探针,建立检测折光马尔太虫的荧光定量PCR方法,将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR检测对比,所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达40个拷贝/μl,比常规PCR灵敏度高100倍,对派琴虫、单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果为阴性。结果显示研究建立的折光马尔太虫荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上折光马尔太虫感染的检测。

贝类单孢子虫和折光马尔太虫二重荧光定量PCR方法的建立

根据GenBank中单孢子虫和折光马尔太虫基因序列,用Primer Express2.0软件设计了两对引物和两条TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测单孢子虫和折光马尔太虫的二重荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫和折光马尔太虫的检测敏感性达到40个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对单孢子虫和折光马尔太虫不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测到这两个原虫。该方法对派琴虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测,结果全为阴性。研究建立的单孢子虫和折光马尔太虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于贝类单孢子虫和折光马尔太虫感染的检测。

禽呼肠孤病毒σNS非结构蛋白基因的克隆和表达

采用RT-PCR技术扩增了禽呼肠孤病毒(ARV)S1133株与广西分离株R2 σNS非结构蛋白基因,将σNS基因克隆到质粒表达载体pGEX-4T-1上,获得的重组质粒经PCR、酶切鉴定以及测序分析,σNS基因的插入位置、大小和阅读框均正确,将阳性克隆命名为pGEX-S1133-σNS和pGEX-R2-σNS.构建好的重组质粒经37 ℃ 1 mmol/L IPTG诱导、SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀,显示目的蛋白以包涵体方式表达,其蛋白质分子质量约为66.2 ku,约占菌体总量的31.5%～34.8%.Western-blotting分析表明,目的蛋白能够与ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有较好的抗原性.

对虾IHHNV荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)保守基因序列(AF218226),设计合成了1对引物和1条TaqMan探针,建立了检测IHHNV的荧光定量PCR技术。将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR对比。结果显示,所建立的荧光定量PCR方法灵敏度可达2个拷贝,比常规PCR灵敏度高1000倍。对保存的15份经常规PCR检测为IHHNV阳性的DNA样品进行荧光定量PCR检测,结果都为阳性,检测的病毒含量为2.15×107～4.21×104拷贝/μL。用该方法对不同浓度的样品进行了重复检测,表明该方法具有良好的重复性,可满足IHHNV的临床诊断需要。

贝类派琴虫PCR检测方法的建立及初步应用

根据派琴虫的基因保守序列设计了特异性引物,对派琴虫的DNA进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序。结果表明,扩增大小为596bp,与预期扩增序列同源性为99.8%。该PCR方法检测灵敏度高,最低可检测1pg的派琴虫DNA;特异性强,对荧光假单胞菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、葡萄球菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、诺瓦克样病毒等贝类病原体的扩增均为阴性。用该PCR技术对广西沿海的104份牡蛎、49份贻贝和20份文蛤病料进行检测,阳性率分别为14.6%、10.6%和15.0%。结果显示,派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的PCR方法可用于贝类派琴虫的临床快速检测。

鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒二重RT-PCR方法的建立

根据基因库中鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的基因序列,分别设计了两对特异性引物,通过对二重RT-PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时鉴别检测鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重RT-PCR方法。该方法对同一样品中的鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒模板进行扩增,结果均同时得到2条大小与实验设计相符的202bp(鸭Ⅰ型肝炎病毒)和474bp(番鸭细小病毒)的特异性扩增条带,对鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到100fg的鸭Ⅰ型肝炎病毒RNA和番鸭细小病毒DNA。研究建立的鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒感染的检测。

禽呼肠孤病毒σNS基因的克隆及其功能分析

采用RT-PCR技术对8株禽呼肠孤病毒(ARV)σNS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与pMD18-T载体连接。测序结果表明,所构建的克隆质粒中均含有相应的σNS蛋白基因,大小为1 107bp。经DNAStar软件分析,除R1株外,其他ARV毒株的σNS基因核苷酸及其推导氨基酸序列与标准毒株S1133和1733株的同源性很高。Antheprot 5.0蛋白分析软件的分析结果表明,σNS蛋白无跨膜区,拥有较多的疏水区和抗原位点,可作为诊断候选蛋白。

贝类折光马尔太虫PCR检测方法的建立

根据基因库中折光马尔太虫的基因保守序列,设计了1对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,研究建立了检测贝类折光马尔太虫的PCR方法。该方法对折光马尔太虫模板进行扩增,得到与试验设计相符的478bp的特异性扩增带,而对派琴虫、单孢子虫、嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等病原体的扩增,结果全为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到1pg的折光马尔太虫DNA。用该PCR对广西沿海的119份牡蛎病料进行检测,折光马尔太虫的阳性率为1.68%,结果提示了中国南方沿海的养殖贝类中存在折光马尔太虫的感染,建立的PCR方法可以用于贝类折光马尔太虫的临床快速检测。

番鸭细小病毒与鸭圆环病毒二重PCR方法的建立

根据基因库中鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的基因序列,分别设计了两对特异性引物,通过对二重PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时鉴别检测鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的二重PCR方法。用该方法对同一样品中鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的模板进行PCR扩增,结果均得到了与实验设计相符的351bp(鸭圆环病毒)和474bp(番鸭细小病毒)的扩增条带,而对鸭I型肝炎病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。敏感性测定结果表明:该二重PCR技术最低能检出100fg的鸭圆环病毒和番鸭细小病毒DNA模板。研究建立的鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的二重PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭圆环病毒和番鸭细小病毒感染的检测。

贝类派琴虫和单孢子虫双重PCR检测方法的建立

根据基因库中派琴虫和单孢子虫的基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对双重PCR扩增条件的优化,建立了可同时检测鉴别这2种原虫的双重PCR。对同一样品中的派琴虫和单孢子虫模板进行扩增,结果均同时得到2条大小与试验设计相符的596bp(派琴虫)和244bp(单孢子虫)的特异性扩增带,对其他贝类病原核酸的扩增结果为阴性。敏感性试验结果表明,最低能检测到10pg的派琴虫和单孢子虫DNA。用该双重PCR对广西沿海的104份牡蛎、49份贻贝和20份文蛤病料进行检测,派琴虫的阳性率分别为14.6%,10.6%和15%,而未检出单孢子虫,结果提示派琴虫广泛存在于中国南方沿海的养殖贝类中,建立的PCR方法可以用于贝类派琴虫和单孢子虫的临床快速检测。