中国帕利亚姆血清群中山病毒的分离及全基因组序列分析

旨在获取中国帕利亚姆血清群中山病毒(Chuzan virus, CHUV)毒株的全基因组序列并分析其遗传特征。应用BHK-21、Vero、MDBK细胞对云南省江城县采集的152份健康黄牛血液样品盲传分离病毒,针对出现细胞病变样品,采用CHUV VP7蛋白基因片段进行RT-PCR扩增和测序,并对阳性样品进行全长扩增及高通量测序,获得的全基因组序列进行遗传进化分析。结果:1份血液样品可致BHK 21、Vero、MDBK细胞病变;病毒基因组为10节段的“3-3-3-1”带型;病毒基因全长18 914 bp,各基因节段长度在728 bp(Seg-10)~3 930 bp(Seg-1)之间,编码6 072个氨基酸残基,编码蛋白在211(NS3蛋白)~1 295(VP1蛋白)个氨基酸残基之间;通过对保守基因Seg-1,Seg-3、Seg-7的核苷酸系统发育分析,显示与中国本土CHUV亲缘关系最近,为98.17%~99.65%,形成一簇;变异基因Seg-2的核苷酸序列同样与中国本土CHUV毒株相似度最近,为98.76%~99.57%。本研究表明中国CHUV毒株的Seg-1、Seg-3和Seg-7形成了独特的地域型,为深入揭示我国CHUV的致病性和病原学特征提供了基础数据。

口蹄疫病毒通用型RT-RAA-LFD快速检测方法的建立

为建立一种操作简便、有效的口蹄疫病毒(FMDV)核酸通用型检测方法,以FMDV 3D基因为靶基因,设计标记引物及探针,建立了一种新的检测FMDV的反转录-重组酶介导链置换核酸扩增结合侧流层析试纸检测(RT-RAA-LFD)方法。该方法操作简便,耗时短,40℃35 min内即可完成检测,通过肉眼观察可判定结果;具有较好的覆盖面,能够检出我国O型、A型FMDV主要流行拓扑型病毒,与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等其他猪病病原无交叉反应;对RNA标准品的最低检测限为10^(-7)拷贝/μL,敏感性较高。利用建立的FMDV RT-RAA-LFD方法对5份临床样品进行检测,其结果与RT-PCR结果一致。结果表明,本研究建立的FMDVRT-RAA-LFD方法具有快速、直观、特异强、重复性好等优点,适合在基层兽医防疫部门和养殖场推广应用。

牛源新型环状病毒RT-qPCR方法的建立和应用

目前世界范围内仅分别从日本西南的与那国岛(2015年)及中国云南省景洪市勐罕镇(2019年)的哨兵动物牛上分离到过新型环状病毒Yonaguni orbivirus(YONOV),但尚缺乏该病毒核酸的特异性检测方法。该研究对比我国分离的YONOV毒株JH2019C603和日本毒株(ON-7/E/15)的基因序列,选择编码非结构蛋白3(Non-structural protein 3,NS3)的Segment-10(Seg-10)节段的保守区设计引物和探针,并分别进行了特异性、灵敏度、重复性和临床血液样品的测试,建立了牛YONOV的RT-qPCR和RT-PCR检测方法。结果显示,两种方法能特异性扩增YONOV核酸片段,对其他环状病毒无有效扩增;RT-qPCR和RT-PCR检出YONOV核酸浓度的下限分别为11.5 copies/μL和115.0 copies/μL;两种方法均能检测出毒株或动物临床血样中的YONOV核酸,并且能在动物感染并产生中和抗体前1周检测出病毒核酸,因此更适用于病毒感染动物的早期诊断。RT-qPCR因其更高的灵敏度和实效性,能用于大量临床样品的快速检测,而RT-PCR的扩增产物可以进行测序,获取待测毒株的基因信息,两种检测方法相互辅助,可以为YONOV的核酸检测及动物感染该病毒的诊断及流行病学研究提供技术支撑。

阿卡斑病毒培养特性和灭活疫苗免疫效果评估

为制备一种阿卡斑病毒灭活疫苗并初步评价其免疫效果,本研究应用组织半数感染量(TCID_(50))测定的方法对阿卡斑病毒CX-01株在HmLu-1、Vero、BHK-21细胞上的扩繁规律进行判定,研究病毒在终浓度0.002 mol/L的BEI灭活剂、37℃条件下的灭活规律,然后应用ISA 206佐剂乳化制备疫苗,通过小鼠模型评估抗原中的添加剂蔗糖、海藻糖和左旋咪唑对免疫效果的影响。结果:HmLu-1细胞培养病毒效价最高为10^(6.75)TCID_(50)/mL,优于Vero和BHK-21细胞;终浓度为0.002 mol/L的BEI灭活剂处理5 h即可完全灭活病毒,为确保对阿卡斑病毒的灭活完全彻底,在BEI灭活剂用量和灭活条件不变的前提下,选择最优的灭活时间为8 h;添加5%蔗糖、5%海藻糖、1%左旋咪唑的疫苗组免疫效果最好,平均中和抗体滴度为18.0。本研究结果对阿卡斑病毒的培养和灭活疫苗的制备具有一定的借鉴意义。

2022年云南省边境地区牛蓝舌病病毒及阿卡斑病毒抗体检测

为了解云南省边境地区牛蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)与阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)的流行与分布现状,2022年在云南省9个边境县(市)采集1 820份牛血清样本,应用c ELISA方法进行BTV与AKAV抗体检测,并对检测结果利用IBM SPSS Statistics 22、Excel 2007等软件进行区间、群间和时间的分类统计分析。结果显示:共检出BTV阳性样品1 207份,样品阳性率为66.32%(1 207/1 820);检出AKAV阳性样品350份,样品阳性率为32.17%(350/1 088)。各县(市、区)的BTV样品阳性率为43.50%~93.00%,AKAV为12.90%~50.00%,不同地区间的差异有统计学意义(P <0.01);黄牛和西门塔尔牛的BTV和AKAV抗体样品阳性率均高于水牛,入境牛BTV抗体阳性率显著高于本土牛,两组数据差异均有统计学意义(P <0.01);规模养殖场的BTV和AKAV抗体阳性率和散养户差异无统计学意义(P> 0.05);7-8月的BTV和AKAV抗体阳性率显著高于5-6月(P <0.01)。结果表明:BTV和AKAV在云南省边境地区已广泛存在,其感染有加重趋势;病原通过境外牛传入国内的风险不断增加,防控形势较为严峻。因此,云南省应继续加强边境地区BTV、AKAV等虫媒病毒的监控,并制定实施相应防控措施,以保障国内畜牧业健康发展。

2018-2020年云南省边境地区猪群PRRSV抗体检测与分析

为了解和对比云南边境地区和其他地区2018-2020年猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)免疫保护水平,疫情发生风险,2018-2020年在云南与缅甸、老挝、越南接壤的14个边境县和其他地区的规模场、散养户采集猪血清,应用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ELISA抗体检测方法进行病毒抗体检测。检测结果显示:2900份猪血清样品中,阳性样品2179份,群体阳性率为75.14%(2179/2900),S/P平均值为1.0510±0.7484,变异系数为70.77%。各县PRRSV抗体阳性率在50%~90%之间,并且不同地区存在差异。抗体阳性率最高为孟连91.33%(274/300)。不同阶段猪群PRRSV平均抗体水平存在差异,哺乳仔猪抗体阳性率最低为48.14%(297/617),育肥猪抗体阳性率最高87.30%(949/1087)。入境猪群和境内猪群抗体阳性率差异显著(P<0.01),养殖场,屠宰场,交易市场猪群PRRSV抗体阳性率要高于自然散养户。本研究结果表明:猪群PRRSV抗体水平在云南边境地区整齐度不高,且地区间存在差异,入境猪群有传播疫情的风险,因此可依据边境地区的养殖特点,制定科学合理的免疫措施及时控制疫病流行,同时继续加强云南省边境地区的PRRSV防控工作。

我国牛羊中山病血清学调查

为了解中山病在我国的流行和分布情况,本研究采用竞争ELISA检测方法,对2016-2018年我国吉林、辽宁、内蒙古、河北、新疆、西藏、湖北、重庆、四川、贵州、云南、广西和广东13个省级区划的8 232份牛羊血清进行检测。结果显示,有12个省级区划检测出抗体阳性,且阳性率有明显的地域性和季节性,由北向南逐渐升高(0~74.03%),秋季阳性率(2.50%~60.00%)明显高于春季(0~10.00%)和夏季(2.22%~35.00%)。乌兰察布、哈密、河池和曲靖等4个采样点的牛羊血清检测发现,牛血清抗体阳性率均高于山羊和绵羊血清。以上结果表明中山病在我国的流行已具有广泛性,流行分布状况与其媒介昆虫的活动有密切关系,并且牛比羊更易被该病毒感染,同时本研究的试验数据将有助于我国更好地了解和防控中山病。

我国牛羊流行性出血病血清抗体调查

为了解流行性出血病(EHD)在我国的流行和分布情况,本研究采用竞争ELISA试验方法,对2015年～2017年我国吉林、河北、西藏、重庆、云南等15个省区的6 413份牛羊血清样品进行检测。结果显示,未发现绵羊EHDV阳性血清,山羊EHDV血清阳性率较低(0～4%),而牛血清EHDV阳性率有明显的地域性和季节性,由北向南逐渐升高(0～65.83%),表明EHD在我国的流行已具有广泛性;秋季阳性率(61.11%～65%)明显高于春季(10%～16.67%)和夏季(29%～32%),表明该病的流行分布状况与其媒介昆虫的活动有密切关系。本研究是我国首次大规模的EHD血清学调查,对有效防控该病提供了重要的实验数据。

1株分离自云南省师宗县库蠓的新型西藏环状病毒

西藏环状病毒(Tibet orbivirus, TIBOV)为环状病毒属的新成员,病毒于2009年首次从我国西藏墨脱县采集的圆斑按蚊中分离,目前,对该病毒的认识仍十分有限。本研究对1株分离自我国云南省师宗县库蠓的新型TIBOV毒株YNSZ/V290/2019进行了鉴定,结果表明,病毒可在C6/36与BHK-21细胞上引起明显的细胞病变,电镜下观察,病毒粒子呈球形,直径55~75 nm,具有环状病毒属病毒典型形态特征。电泳结果显示,病毒基因组为十节段双链RNA,呈现“3-3-3-1”的电泳带型特征。对环状病毒属病毒高度保守的基因节段及其编码蛋白(Seg-3/T2)的序列分析显示,YNSZ/V290/2019为TIBOV的成员,与其他TIBOV毒株的核酸与氨基酸序列相似度分别为80.90%~81.70%与97.20%~97.30%。对决定环状病毒属病毒血清型的基因节段及其编码蛋白(Seg-2/OC1)的序列分析显示,YNSZ/V290/2019与已知TIBOV毒株的核酸与氨基酸序列相似度分别为26.90%~30.60%与28.50%~33.20%,表明该毒株可能是一种新血清型的TIBOV。对采集于师宗县牧场的40份黄牛与68份山羊血清进行血清中和试验,结果显示,新型TIBOV在牛、羊的阳性率分别为22.50%与4.41%。新型TIOBV在我国的发现,丰富了我国虫媒病毒的研究,为深入研究我国TIBOV的分布、致病性、感染宿主范围与诊断试剂的开发提供了基础。

中山病多克隆抗体竞争ELISA检测方法的建立

为建立一种简便、快速的中山病血清抗体监测方法,本研究采用纯化的中山病病毒(CHUV)包被ELISA反应板,兔抗CHUV多克隆抗体作为竞争抗体,建立了检测CHUV抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。结果显示:抗原最佳包被浓度为4.12μg/m L,竞争抗体最佳使用浓度为1∶12 000倍。特异性试验显示该C-ELISA方法仅能检测CHUV抗体,其它相关病毒阳性血清检测结果均为阴性。对已知阳性样品的检测结果表明,本研究建立的C-ELISA方法敏感性高于血清中和试验和琼脂扩散试验。分别用C-ELISA、RT-PCR和病毒分离试验对监控动物每周采集的血清和抗凝血样品进行检测,ELISA结果与其它两种方法检测结果对应一致。本研究建立的C-ELISA为CHUV抗体的检测提供了一种快速、方便、可靠的方法。

中山病病毒qRT-PCR与RT-PCR检测方法的建立及应用

中山病病毒(CHUV)是一种严重危害犊牛神经系统的虫媒病毒,自2012年首次从我国云南师宗分离后,相继在广西与广东等地区也分离到该病毒。为建立CHUV的检测方法,本研究根据CHUV编码VP2蛋白的Seg-2基因序列设计引物和探针,通过条件优化建立了检测CHUV的荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)和常规RT-PCR法。利用建立的qRT-PCR和RT-PCR分别检测CHUV、流行性出血病病毒、阿卡斑病毒、蓝舌病病毒和牛流行热病毒,结果显示除了均能检测CHUV以外,两种方法对其他病毒均无特异性扩增;利用两种方法对质粒标准品pLB-CHUV/V144/Seg-2(1×10^(0)拷贝/μL~1×10^(9)拷贝/μL)进行检测,结果显示两种方法的检测下限可分别达到10拷贝/μL(qRTPCR)与100拷贝/μL(RT-PCR);重复性试验结果显示,qRT-PCR的批内和批间变异系数均小于1%。利用这两种方法分别检测2019年5月~11月隔周采集3头感染CHUV哨兵牛的各25份共计75份的血液样品并计算二者的符合率;同时利用C-ELISA方法检测3头牛对应血清样品的CHUV抗体。结果显示,qRT-PCR检测到30份阳性样品,45份阴性样品;RT-PCR检测到22份阳性样品,53份阴性样品。两种方法的总符合率为89.33%;相比较于C-ELISA方法,qRT-PCR方法能在动物感染CHUV的早期(约早2周)检测出病毒核酸,更适用于检测病毒载量较低的血液样品,而RT-PCR的扩增产物可以通过测序了解待测病毒的遗传信息。本研究建立的两种检测方法可以互补使用,为CHUV的早期检测和流行病学研究等提供了快速、方便、可靠的技术支撑。

2019年云南省景洪市哨兵动物多种虫媒病毒的分离鉴定

本研究旨在了解云南省景洪市虫媒病毒的流行情况。2019年在景洪市勐罕镇设立了3头哨兵动物牛,定期采血进行虫媒病毒的分离与鉴定,共获得7株病毒分离物。经病毒核酸的RT-PCR鉴定,分离到2株血清型分别为6型和7型流行性出血热病毒(epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV),2株血清型分别为4型和5型的蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV),1株帕利亚血清群病毒(palyam serogroup virus,PALV)中的D’Aguilar virus(DAV)血清型病毒和2株未鉴定出的环状病毒。经病毒Seg-2、Seg-3序列ORF区的比对和进化分析显示,7株病毒的地域型均为Eastern型,与日本、澳大利亚和印度毒株具有最近的亲缘关系。3头哨兵动物的血液和血清,经病毒核酸及血清中和试验检测,证明3头动物均被相应的病毒感染。动物感染病毒后,血清中的特异性抗体迅速上升,3~4周后达最高点并能够在该水平维持较长时间,而血液中病毒核酸含量2~4周到达最高点后则呈迅速下降趋势。本研究报道了景洪虫媒病毒的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性,研究结果为进一步了解当地的牛虫媒病毒提供数据支撑,同时3头牛分离获得7株病毒,提示当地可能还存在更多种类的虫媒病毒。

猪群混合感染伪狂犬病毒及乙型脑炎病毒的鉴定与分离

云南省文山市某规模化猪场2015年7-8月频繁发生以种公猪一侧睾丸肿大,母猪流产、产死胎、木乃伊胎及弱仔为主要临床症状的繁殖障碍疫情.为了查明病因,对送检流产胎猪进行病理解剖,采集胎猪及胎盘病料进行猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型及美洲型毒株、猪细小病毒、伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒、猪流产衣原体、布氏杆菌及弓形虫PCR和real-time PCR检测,同时应用猪肾原代细胞及BHK-21传代细胞进行病毒分离鉴定以及细菌分离鉴定.检测结果显示,从流产胎猪内脏器官、大脑及胎盘组织扩增出乙型脑炎病毒prM基因及伪狂犬病毒gE基因目的条带.序列分析结果显示,扩增的乙型脑炎病毒prM基因序列与NCBI GenBank中的参考毒株（Accession no.AB594829.1）序列同源性达99%;伪狂犬病毒gE基因核苷酸序列与NCBI GenBank中的参考毒株（Accession no.KT936475.1）序列同源性达100%.应用BHK-21传代细胞盲传分离获得1株可致细胞病变（cytopathic effect,CPE）的病毒株,鉴定为乙型脑炎病毒,并命名为JEV-2015-WS-YN.由此推测,引起此次猪群繁殖障碍极有可能为日本乙型脑炎病毒和伪狂犬病毒共同感染造成.

感染16型蓝舌病病毒后绵羊部分细胞因子消长特点研究

本试验旨在探明绵羊感染16型蓝舌病病毒(Bluetongue virus type 16,BTV16)后细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的消长特点。用实时荧光定量PCR检测方法对感染BTV16后3只绵羊上述4种因子mRNA进行检测,同时设立阴性对照绵羊,并以0 d mRNA为基准,计算mRNA的相对表达量,同时检测病毒抗体效价、测量绵羊体温。结果显示,接种BTV16的3只绵羊均不同程度产生抗体和体温症状,4种细胞因子的mRNA在接种病毒2~4 d内均出现显著上升,其中IFN-γ峰值在2.58~27.84倍之间,IL-2峰值在5.24~17.19倍之间,IL-4峰值在2.16~3.43倍之间,IL-10峰值在15.78~48.77倍之间,个体上升幅度存在显著差异,4种细胞因子均在高水平持续6 d左右后逐渐下降。对照绵羊上述参数在正常范围内波动。本研究阐明了接种BTV16后绵羊细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10在转录水平上的消长特点,为进一步深入开展BTV感染特征、宿主机体免疫机制研究提供参考。

口蹄疫病毒群特异性RT-LAMP检测技术的建立及试用

为实现对口蹄疫病毒(FMDV)感染的现场快速检测,本研究于GenBank下载全球具有代表性的107条血清O型、A型和Asia-1型FMDV基因组序列,截取并比对FMDV高度保守的3D(RNA聚合酶)基因序列,设计17套环介导等温扩增引物,并对反应体系和反应条件进行优化,建立FMDV群特异性RT-LAMP技术。该技术在反应前用石蜡密封PicoGreen染料,实现了免开盖可视化判定检测结果;该技术对PRV、PRRSV、AKAV、BTV-1、BTV-16、EHDV、CHUV等偶蹄动物病毒未见非特异性扩增;最低可检测3.4×10;ng/μL的病毒RNA,灵敏度是RT-qPCR技术的10倍,是一步法RT-PCR的100倍;尝试应用RT-LAMP对94份RNA临床样品进行检测比对,该检测方法与RT-PCR方法和RT-qPCR方法对临床样品检测的符合率均为82.8%。本研究建立的FMDV群特异性RT-LAMP快速核酸检测技术,具有准确性高、快速简便的优点,可用作家畜FMDV早期感染的现场诊断技术。

蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒三重RT-qPCR检测方法的建立及应用

【目的】建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)及帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)快速筛查和诊断的三重RT-qPCR检测技术。【方法】选择BTV的NS3、EHDV的NS1以及PALV的VP7基因作为靶基因,设计3组特异性引物和探针,建立3种病毒的三重RT-qPCR检测方法。对检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行验证,同时使用我国分离的BTV、EHDV与PALV不同血清型毒株和对应的阳性血液样本,与24个BTV血清型及6个EHDV血清型参考毒株对该三重法的检测效果进行验证。【结果】三重RT-qPCR的扩增效率均可达90%以上,对3种病毒核酸拷贝数的检测下限均为10μL-1级别,与单重法的检测灵敏度相当;与阿卡斑病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行热病毒之间无交叉反应;Ct值批内、批间变异系数均在2%以内;可检测出24种BTV血清型、6种EHDV血清型与3种PALV血清型,具有群特异性;可有效检测血液中的病毒核酸,检测结果与单重法一致。【结论】本研究建立的BTV、EHDV与PALV三重RT-qPCR具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于临床样本中对3种病毒的同时诊断与筛查。

2017—2018年云南省边境地区阿卡斑病毒抗体检测

为了解云南边境地区近年来阿卡斑病毒(Akabanne disease virus,AKAV)流行情况,2017—2018年连续2年在云南省与缅甸、老挝、越南接壤的12个边境县采集牛血清,应用cE LISA方法进行AKAV抗体检测。结果显示:2017—2018年共检测牛血清样品1 860份,检出阳性样品108份,阳性率为5.8%,显示这些地区存在一定的AKAV感染;各县AKAV抗体阳性率在0～24.4%之间,差异较大,其中抗体阳性率最高的为富宁县,2017年和2018年的阳性率分别为24.4%和20.0%,而瑞丽连续2年未检出抗体阳性;黄牛AKAV抗体阳性率(6.6%)高于水牛(4.7%),差异显著(P<0.05);入境牛抗体阳性率(6.5%)高于境内牛(3.0%),差异显著(P<0.05);养殖场(9.0%)、交易市场(8.4%)、屠宰场(7.6%)的牛AKAV抗体阳性率高于村寨散养户(2.5%),差异极显著(P<0.01)。结果表明,AKAV在云南边境地区存在一定的流行,其流行趋势受入境动物影响。结果提示,应继续加强云南省边境地区AKAV等虫媒病毒病的监控,及早发现和控制该病流行。

云南省边境地区哨兵牛芒市病毒的分离与鉴定

【目的】掌握云南省边境地区动物虫媒病毒的多样性分布和传播风险。【方法】在云南省景洪市设立哨兵牛3头,每周1次采血进行虫媒病毒的监测与分离。通过电镜观察、基因组琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR与克隆测序对分离病毒进行鉴定,采用实时荧光定量RT-PCR与血清中和试验对病毒在动物上的感染进行回溯分析。【结果】2019年,在监测期第13周,从1头哨兵牛的血液中分离出1株致C6/36细胞病变的病毒(V301/YNJH/2019),电镜观察可见直径约70 nm、呈二十面体对称结构的病毒粒子,琼脂糖凝胶电泳显示病毒基因组为双链RNA,RT-PCR鉴定分离毒株为芒市病毒(MSV)。测序显示,分离毒株的基因节段Seg-4和Seg-7长度为2055和1122 bp,编码病毒的外层衣壳蛋白VP4(628 aa)和VP7(298 aa),基因节段Seg-2和Seg-9长度为3055和1076 bp,编码病毒的内层衣壳蛋白VP2(956 aa)和VP9(283 aa);分离毒株与云南省芒市分离的MSV/DH13M041毒株具有最近的亲缘关系,核酸序列相似度在97.4%(Seg-9)~98.5%(Seg-2)之间,氨基酸序列相似度在96.4%(VP9)~98.4%(VP2)之间。病毒感染的回溯分析显示,监测期的第11周,牛血液中病毒核酸检测呈阳性,病毒核酸含量在第13周达到高峰,随后快速降低,在第18周转为阴性;感染哨兵牛在监测期的第13周已产生特异性中和抗体(1∶14),在第16~18周处于高峰(1∶226),至监测结束的第24周降低为1∶57。【结论】本文从牛体中分离到了MSV,表明牛是MSV的易感动物之一,病毒在感染牛上呈“一过性感染”的特征。研究结果为进一步开展MSV的检测诊断、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。

我国牛羊蓝舌病血清学调查

为了解蓝舌病(BT)在我国的流行和分布情况,本试验采用竞争酶联免疫吸附法(C-ELISA)对我国重庆、新疆、西藏、湖北、河北、广西、贵州、内蒙古、吉林、辽宁、四川、云南共12个省区的19237份血清进行检测。结果显示,被调查地区均存在蓝舌病病毒(BTV)的流行,平均阳性率为4.33%~38.14%,且血清阳性率具有明显的地域性和季节性,低纬度地区的血清阳性率普遍高于高纬度地区(4.33%~38.14%),以第3季度(7~9月)阳性率最高(23.3%~46.7%),第1季度(1~3月)阳性率最低(0~13.3%),说明BTV的流行与虫媒的活动密切相关。本试验开展的BTV血清学调查,明确了蓝舌病在被调查地区的流行情况,也为蓝舌病的监测和预防提供了可靠参考。

云南省蓝舌病病毒血清7型毒株的分离与基因组序列分析

2014年,我国广东省的哨兵牛上分离出蓝舌病病毒血清7型(BTV-7)毒株,但该血清型病毒在我国的流行情况尚不清楚,本研究旨在分离我国流行的BTV-7型毒株并掌握其遗传特征。作者在云南省景洪市勐罕镇设立哨兵牛,每周定时采血,并接种C6/36、BHK-21细胞分离虫媒病毒,通过病毒蚀斑试验与增殖曲线分析病毒在细胞上的感染特性,采用高通量测序获取分离毒株的全基因组序列,通过qRT-PCR与血清中和试验对哨兵牛血液中的病毒核酸与中和抗体变化进行回溯分析。结果表明:2020年5月,分离到1株能引起BHK-21细胞发生细胞病变的病毒(毒株号V303/YNJH/2020),经鉴定为BTV-7型。分离毒株的基因组全长19154 bp(GenBank收录号MW046280至MW046289),与广东省2014年分离的BTV-7型GDST008毒株具有最近的亲缘关系,基因节段1至6,基因节段9与10的核酸与编码蛋白氨基酸序列(nt/aa)相似度分别大于98%、99%;V303/YNJH/2020毒株的基因的节段7和基因节段8属Western地域型,与广东GDST008毒株对应基因节段的nt/aa序列相似度仅为71.5%/81.6%、79.6/%84.4%。病毒蚀斑与增殖曲线比较显示,V303/YNJH/2020在BHK-21细胞的增殖能力明显强于GDST008。回溯分析显示,感染V303/YNJH/2020的哨兵牛未出现临床症状,血液中的病毒核酸持续存在长达12周;在病毒感染后第4~9周,血液中的中和抗体滴度水平维持在1∶256。云南省2020年分离的BTV-7型V303/YNJH/2020毒株与广东省分离的BTV-7型GDST008毒株具有最近的亲缘关系,在BHK-21细胞上的增殖能力强于GDST008毒株;V303/YNJH/2020虽未引起感染动物的临床症状,但病毒核酸与中和抗体在感染动物血液中长时间存在。研究结果为开展BTV-7型在我国的演化规律、病毒变异以及致病性等方面的研究奠定了基础。