10-23脱氧核酶抑制细菌β-内酰胺酶基因表达的实验研究

目的:观察10-23脱氧核酶对细菌β-内酰胺酶基因表达的抑制作用。方法:设计并合成针对细菌β-内酰胺酶SHV-5基因的10-23脱氧核酶、反义寡核苷酸和无关对照寡核苷酸,采用电穿孔法将其分别导入表达β-内酰胺酶SHV-5的大肠杆菌中,观察耐药菌在导入脱氧核酶后,在含β-内酰胺类抗菌素培养基中的生长活力及β-内酰胺酶表达量的变化。结果:10-23脱氧核酶导入表达blaSHV-5的大肠杆菌后,在含头孢他啶的培养基中大肠杆菌的生长活力明显低于反义寡核苷酸和无关对照DNA转化的大肠杆菌,导入脱氧核酶的大肠杆菌其β-内酰胺酶表达量也明显低于反义寡核苷酸和无关对照DNA转化的大肠杆菌。结论:10-23脱氧核酶能特异性地抑制细菌β-内酰胺酶基因表达。

结核杆菌Ag85A/GM-CSF嵌合表达质粒的构建及表达

目的 探索对结核病DNA疫苗进行基因修饰的新方法。方法 以结核杆菌H3 7Rv 株基因组DNA为模板 ,通过PCR扩增获得结核杆菌Ag85A抗原蛋白基因的成熟肽编码区 ,以经PHA诱导后的小鼠脾组织总RNA为模板 ,通过RT PCR获得小鼠粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子的cDNA ,将二者定向克隆入质粒pBK CMV中构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转染培养的COS7细胞后检测嵌合目的基因的表达。结果 成功构建了小鼠粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子cDNA与结核杆菌Ag85A抗原基因的真核嵌合表达质粒 ,重组质粒能在COS7细胞中进行稳定表达。结论 本研究首次将细胞因子基因与结核杆菌免疫保护性抗原基因嵌合构建嵌合DNA疫苗 。

结核杆菌Ag85A及ESAT-6双价抗原融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

目的 为结核病新型疫苗研究提供靶基因和靶抗原。方法 采用PCR扩增的方法获得结核杆菌两种免疫保护性抗原Ag85A及ESAT - 6的基因 ,将其定向克隆入真核及原核穿梭表达型载体 pBK -CMV构建含嵌合目的基因的重组质粒 ,转化大肠杆菌后用IPTG进行诱导表达 ,并通过SDS -PAGE和Western -blotting对表达蛋白进行初步分析。结果 1)从结核杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ag85A及ESAT - 6基因。 2 )成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达质粒 pBK - 85A -E6。 3)重组质粒 pBK - 85A -E6经IPTG诱导后能在大肠杆菌中稳定表达 38kDa的融合蛋白。 结论 成功构建了结核杆菌Ag85A及ESAT - 6双价抗原融合表达载体 ,并在大肠杆菌中实现了稳定表达 ,为进一步研究其在结核病基因工程疫苗研制中的应用奠定了基础。

结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A的基因克隆与表达研究

目的 为结核病新型疫苗研制提供靶基因和靶抗原。方法 根据结核杆菌 H 37Rv株免疫保护性抗原 Ag85 A的基因序列自行设计一对寡核苷酸引物 ,以结核杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增获得具有完整开架读码框 (ORF)的 Ag85 A抗原基因 ,并将其正向插入真核和原核穿梭表达型载体 p BK- CMV构建重组质粒 ,重组质粒转入大肠杆菌后 IPTG诱导表达 ,并对其表达产物进行 Western- blotting分析。结果 PCR扩增获得了具有完整开架读码框的 Ag85 A抗原基因 ;构建了 Ag85 A抗原基因真核和原核穿梭表达型载体 ;Ag85 A抗原基因在大肠杆菌中实现了稳定表达。结论 成功地对结核杆菌免疫保护性抗原 Ag85 A进行了基因克隆与表达 。

耐第三代头孢菌素革兰阴性杆菌超广谱β-内酰胺酶及耐药基因分析

目的了解革兰阴性杆菌对第三代头孢菌素耐药的分子机制。方法采用常规琼脂2倍稀释法测定11株(CR01-CR11)临床分离革兰阴性杆菌,对13种β-内酰胺类抗菌药物的敏感性,纸片扩散法检测耐药菌的ESBLs表型,通过PCR扩增检测其耐药基因。结果MIC结果表明,11株病原菌对几种常见的第三代头孢菌素具有明显的耐药性;表型确证实验表明,除CR07外,其余10株均为产ESBLs菌株;酶的水解底物轮廓实验表明,10株产ESBLs株菌所产生的β-内酰胺酶均能高效水解头孢哌酮和头孢孟多,而对头孢他啶水解活性较低。结论10株产ESBLs革兰阴性杆菌的酶活性、等电点及耐药基因在一定程度上揭示了病原菌产ESBLs与其耐药性之间的关系。

新型结核病疫苗研究进展

本文从蛋白质亚单位疫苗、DNA疫苗、重组卡介苗、新型减毒活疫苗和以非致病性分枝杆菌为载体的重组疫苗几方面概括地介绍了目前新型结核病疫苗研制的现状。

结核杆菌多价核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

目的构建包含结核杆菌3种抗原蛋白Ag85A、ESAT-6和CFP-10真核表达质粒的多价DNA疫苗,并对其在小鼠体内的免疫原性进行初步分析。方法PCR扩增获得结核杆菌ag85 a、esat-6和cfp-10基因片段,分别克隆入真核表达质粒VR1020的BamHⅠ位点构建DNA疫苗,以此多价DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内的特异性抗体应答和细胞免疫反应,并与BCG免疫组、质粒VR1020免疫组和生理盐水对照组相比较。结果多价DNA疫苗免疫小鼠后能产生特异性的细胞和体液免疫应答,DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞IFN-γ的表达量显著高于BCG免疫组,而DNA疫苗免疫组小鼠所产生的特异性抗体水平低于BCG免疫组。结论成功构建了结核杆菌多价DNA疫苗,免疫小鼠后检测到特异性细胞和体液免疫应答。

第三代反义核酸技术—肽核酸

肽核酸是一种人工合成的DNA分子的类似物,被称之为第三代反义核酸,是目前反义核酸技术领域研究的前沿和热点。本文简要叙述了肽核酸的分子结构、理化性质和杂交特性以及肽核酸在基因表达调控、分子生物学实验研究和疾病基因治疗研究等方面的应用情况。

超广谱-内酰胺酶SHV-5的基因重组表达及酶活性鉴定

目的对blaSHV-5进行基因重组表达,为建立SHV类β-内酰胺酶抑制剂筛选模型研究奠定基础。方法以产blaSHV-5肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板,自行设计一对寡核苷酸引物,通过PCR扩增获得blaSHV-5基因片断,定向克隆入质粒载体pBK-CM V构建重组质粒,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序鉴定,重组质粒转化大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′后,N itrocefin显色结合SDS-PAGE分析目的基因在大肠埃希菌中的表达及其酶活性。结果PCR扩增获得了大小约为900bp的DNA条带,定向克隆入质粒载体pBK-CM V后筛选到大小约为5.4kb的重组质粒,S acⅠ和E coRⅠ双酶切后可切下大小约900bp的插入片段,DNA测序发现插入片断的基因序列与G enB ank中肺炎克雷伯菌基因序列完全一致,重组质粒转化大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′后可表达分子量约为31500的重组蛋白。重组菌裂解液对n itrocefin显示出较强水解活性。结论超广谱β-内酰胺酶SHV-5在大肠埃希菌XL 1-B lue M RF′中实现了基因重组表达。为进一步进行酶的纯化等相关后续研究奠定了基础。

莱姆病螺旋体重组质粒pBX1的DNA序列分析及其在大肠杆菌中的诱导表达

目的 为莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制提供靶抗原。方法 采用 377型 DNA自动测序仪对莱姆病螺旋体重组质粒 p BX1的插入片段进行 DNA序列测定 ,并通过计算机软件对其进行限制性内切酶酶谱分析。然后将重组质粒 p BX1在大肠杆菌中进行诱导表达 ,并对其表达产物进行免疫印迹分析。结果 1重组质粒 p BX1插入片段大小为 477bp,其核苷酸序列与文献报道的 p83基因全序列相应区段相比较仅有一个碱基的变异 ,2成功绘制了该插入片段的限制性内切酶酶谱 ;3重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后获得了 2 9kd的融合蛋白 ;4Western- blotting分析表明该融合蛋白能与莱姆病多价抗血清呈强阳性印迹反应。结论 该研究成功地对莱姆病螺旋体 83kd抗原蛋白特异性区段进行了基因重组和表达 ,为进一步研究其在莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制中的应用奠定了基础。

医学机能学实验教学改革中素质教育的探讨

在明确素质教育基本内容和基本要求的基础上,从教学内容的优化、教学方式转变、学生综合能力培养、学生学习成绩评定以及教师素质的提高等方面,对医学机能学实验教学改革中的素质教育问题进行了探讨.

莱姆病螺旋体83kD原浆柱蛋白特异性区段的基因克隆与表达研究

目的 为莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制提供靶抗原。方法 根据莱姆病螺旋体 83kD原浆柱蛋白 (p83)特异性区段的基因序列 ,设计一对引物 ,采用PCR技术从莱姆病螺旋体B31株基因组DNA中扩增p83特异性区段的基因片段 ,纯化扩增产物 ,用BamHI和EcoRI双酶切后定向克隆入质粒载体pBK -CMV ;转化大肠杆菌筛选重组克隆。用BamHI和EcoRI双酶切、PCR扩增和DNA序列测定对重组质粒进行鉴定 ,将重组质粒转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达后进行SPS -PAGE和Western -blotting分析。结果 1)从莱姆病螺旋体B31株基因组DNA中扩增出p83特异性区段的基因片段 ;2 )将扩增所得的目的基因片段正向插入pBK -CMV的BamHI和EcoRI位点 ,获得重组质粒pBX1。 3)pBX1在大肠杆菌中诱导表达后获得 2 9kD含 β -半乳糖苷酶氨基末端片段的重组抗原。 结论 成功构建了莱姆病螺旋体 83kD原浆柱蛋白特异性区段的基因重组表达载体 ,并在大肠杆菌中获得了稳定的表达 。

DNA免疫法制备抗Prohibitin多克隆抗体的实验研究

Prohibitin（PHB）是近年来发现的一种具有多种生物学功能的蛋白分子,可参与细胞周期调控、蛋白质折叠、转录调节等,PHB与肿瘤发生发展的关系存在两种截然不同的观点,PHB最初被认为是肿瘤发生和细胞增殖的负调节因子,但大量研究发现,PHB在多种肿瘤组织中高表达,有研究证明PHB还具有抗凋亡作用,其确切的分子功能尚有待于进一步深入研究。

莱姆病螺旋体外膜蛋白分子生物学及免疫学研究进展

莱姆病 (Lymedisease)螺旋体是引起人畜莱姆病的病原体 ,本文从莱姆螺旋体外膜蛋白的组成、生化结构特征、编码基因及其遗传学特性、致病性和免疫性以及外膜蛋白克隆与表达研究等方面归纳总结了近年来的研究成果 ,并简要介绍了这些研究成果在莱姆病原体分类鉴定 ,莱姆病诊断以及莱姆病疫苗研制中的应用。

病理生理学理论课教学中的哲学思考

分析了在病理生理学理论课教学中包含的哲学原理，结合病理生理学的基本知识，初步探讨这些哲学原理对于更好地理解和掌握病理生理学知识、提高学生分析和解决问题的能力的重要性。

产ESBLs液化沙雷氏菌临床分离株的表型和基因型分析

目的探索液化沙雷氏菌临床分离株CR04对第三代头孢菌素耐药的分子机制。方法采用琼脂二倍稀释法对临床分离的液化沙雷氏菌CR04株进行MIC检测,提取耐药菌β-内酰胺酶,并测定其酶活性。双纸片法筛选及确证实验鉴别耐药菌的ESBLs表型,进行结合传递实验并提取耐药菌质粒,进一步根据常见的质粒介导的β-内酰胺酶基因序列设计两对寡核苷酸引物,以耐药质粒为模板进行PCR扩增,并对其扩增产物进行DNA序列测定和同源性分析。结果头孢他啶对液化沙雷氏菌CR04株的MIC为512μg/ml,其酶活性为837.9U,双纸片法筛选及确证实验证明为产ESBLs耐药菌,结合传递实验表明产酶基因能传递给受体菌,从耐药菌中提取出大小约为10kb的质粒,以质粒DNA为模板进行PCR扩增,对扩增产物DNA测序结果进行分析表明,其核苷酸序列与已知的β-内酰胺酶blaSHV-5、blaSHV-1、blaSHV-2、blaSHV-7、blaSHV-8、blaSHV-12、blaSHV-24、blaSHV-34基因高度同源,其所推导的氨基酸序列与已知的β-内酰胺酶blaSHV-5、blaSHV-1、blaSHV-2、blaSHV-7、blaSHV-8、blaSHV-12、blaSHV-24、blaSHV-34相比较至少有30个氨基酸残基的差异。结论对临床分离的第三代头孢菌素耐药性液化沙雷氏菌CR04株进行详细的表型和基因型分析。

临床分离耐药摩氏摩根菌的β-内酰胺酶表型和基因型分析

目的探讨临床分离耐药摩氏摩根菌3-87耐药的分子机制。方法采用常规琼脂二倍稀释法对摩氏摩根菌3-87进行15种抗菌药的M IC测定;超声破碎法提取β-内酰胺酶;并用n itrocefin做定性检测,用紫外分光光度计检测酶活性;超薄层等电聚焦测定β-内酰胺酶等电点和酶抑制实验;ESBL s表型鉴定;Am pC酶的检测;纸片协同法筛选产金属β-内酰胺酶菌株;以摩氏摩根菌3-87质粒DNA为模板扩增blaSHV、blaTEM和blaCTX-M基因,以基因组DNA为模板扩增ampC结构基因;ampC结构基因扩增产物的DNA序列测定及同源性分析。结果摩氏摩根菌3-87对10种β-内酰胺类抗生素、2种氟喹诺酮类抗菌药耐药,对哌拉西林/三唑巴坦和头孢哌酮/舒巴坦、氨基糖苷类抗生素阿米卡星敏感。产酶活性为3727.5U的β-内酰胺酶。产生的pI7.3、8.2及9.6的三种β-内酰胺酶分别能被氯唑西林、克拉维酸、EDTA部分抑制。β-内酰胺酶表型鉴定试验结果显示菌株产ESBL s、Am pC酶及金属β-内酰胺酶三种β-内酰胺酶。blaCTX-M基因引物扩增出阳性扩增条带。ampC结构基因引物扩增阳性扩增带,对扩增产物进行序列分析与已报道的摩氏摩根菌ampC结构基因的核苷酸序列高度同源,推导的氨基酸序列发生了1个氨基酸残基的变异。结论临床分离耐药摩氏摩根菌3-87呈多重耐药,其对β-内酰胺类抗生素耐药的机制是产生了ESBL s、Am pC酶及金属β-内酰胺酶。

中国强毒力赖型钩端螺旋体外膜蛋白基因的克隆表达及对大肠杆菌活力的影响

目的 :构建表达致病性赖型 0 17株钩端螺旋体OmpL1外膜蛋白的真核 -原核穿梭表达载体 ,并在原核细胞中表达出目的蛋白。方法 :用PCR方法从 0 17株钩体基因组中钓出OmpL1蛋白基因 ,酶切纯化后与质粒pBK -CMV连接 ,通过电泳、限制性内切酶分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒。重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后提取总蛋白以SDS -PAGE检测表达情况 ,同时监测目的蛋白表达前后各时段宿主菌OD6 0 0值的变化。结果 :筛选出 5株带重组质粒菌 ,其中有 4株能在大肠杆菌中表达 37kD的特异蛋白 ,而且随着该外源蛋白的表达 ,宿主菌生长各时段的OD6 0 0值下降。结论 :成功地构建了钩体OmpL1蛋白的穿梭表达质粒 ,并在大肠杆菌中表达出OmpL1融合蛋白 ,该异源蛋白的表达导致宿主菌的活力降低。本工作为OmpL1蛋白用于钩体病诊断。

耐头孢他啶阴沟肠杆菌TEM-28V β-内酰胺酶的特性研究

目的研究耐头孢他啶阴沟肠杆菌TEM-28Vβ-内酰胺酶的特性。方法用KB纸片扩散法和等电聚焦(IEF)对细菌β-内酰胺酶类型进行初步判断;碱裂解法提取质粒并进行PCR扩增测序;饱和硫酸铵反抽提,并经SephadexG-75凝胶过滤和DE-52阴离子交换层析法纯化β-内酰胺酶;SDS-PAGE法测定分子量和紫外分光光度法测定酶动力学参数。结果6株临床分离菌均对头孢他啶耐药。IEF显示,每株菌产生一种或两种β-内酰胺酶,等电点(pI)分别为5.5、5.6和8.7。根据基因分析推测,pI为5.6的酶的氨基酸序列与TEM-2同源性为100%。pI为5.5的酶与TEM-28比较存在4个氨基酸突变,其分子量为28.77ku;酶动力学分析证实,TEM-28V能水解头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南,不能水解亚胺培南,对舒巴坦和三唑巴坦的IC50分别为107和220nmol/L。结论TEM-28V可能为TEM-28变异型超广谱β-内酰胺酶。