细胞周期检测点的流式细胞术分析

背景与目的:真核细胞的细胞周期运行遵循着严格的时相次序,这种精密的延缓和强制的次序,由细胞监控机制——检测点来完成,检测点功能的丧失会导致肿瘤的发生。传统的细胞周期检测点分析多数基于群体细胞DNA直方图的流式细胞术。本研究以晚G1期检测点为模式,建立一种新的细胞周期检测点分析方法——Cyclins/DNA双参数流式细胞术,并评价应用该方法进行细胞周期检测点分析的可行性和优越性。方法:将紫外线照射诱导后的人类急性淋巴细胞型白血病细胞株(MOLT-4)于不同时间点收获固定,分两组进行流式细胞仪检测:一组用DNA直方图法,Modifit软件分析计算G0/G1期细胞总数;另一组应用CyclinE/DNA双参数流式细胞术对G1晚期细胞CyclinE的荧光强度、阈值及G0/G1各亚期细胞数量进行定量分析,并比较两组实验结果。结果:用DNA直方图法观察到紫外线照射后0～4hG0/G1期细胞总数基本不变(5300～5500),6h后开始上升(6241,12.6%)。而用CyclinE/DNA双参数法观察到:(1)G1晚期细胞的CyclinE荧光强度于照射后短时间内便开始变化,1h上升为341.2(对照295.1,15.6%),6h上升为577.6(95.7%),此时CyclinE阈值上升到5.4(0h为2.0);(2)G0/G1各亚期细胞数目变化趋势不明显:G1晚期细胞数6h时略为减少(此时凋亡率为5.61%),G1早期细胞数缓慢上升。结论:CyclinE/DNA双参数流式细胞术将CyclinE的荧光强度及表达阈值定量化,对于细胞晚G1期检测点的检测比传统的DNA直方图法更为敏感和精确。

细胞周期素E表达阈值的定量分析

背景与目的:细胞周期素(cyclins)表达阈值的分析是细胞周期运行机制研究的一个重要方面,但目前尚缺乏一种较为科学且统一的定量计算方法。本研究试图对细胞周期素E(cyclinE)的表达阈值进行标准化定量分析。方法:用cyclinE/DNA双参数流式细胞术对人类急性淋巴细胞性白血病细胞株(MOLT-4细胞)在不同的光电倍增管(Photomultipliertubes,PMT)电压下进行检测;另取MOLT-4细胞经咖啡因(caffeine)和放线酮(cycloheximide,CHX)分别处理后用同样方法在同一电压下进行检测;最后对MOLT-4细胞和另外一种人类急性淋巴细胞性白血病细胞株(JURKAT细胞)在同一电压下进行检测,分析以上3组实验所得的CyclinE/DNA二维等高图,用公式B2/A×C(A,B,C分别为cyclinE/DNA二维等高图上cyclinE荧光强度的最低值,阈值和最高值)定量计算cyclinE表达阈值。结果:用公式B2/A×C计算出MOLT-4细胞cyclinE的表达阈值在不同电压下保持恒定;经咖啡因处理后阈值下降,经放线酮处理后阈值不变;同时计算出JURKAT细胞cyclinE表达阈值比MOLT-4细胞明显要低。结论:公式B2/A×C适用于细胞cyclinE表达阈值的定量计算。

MOLT-4细胞凋亡不同阶段活性Caspase-3在细胞内的空间位相移行

背景与目的:在细胞凋亡过程中,位于细胞浆中的Caspase-3酶原是由什么方式引起细胞形态序贯性变化的问题还没有完全阐明,本研究旨在探讨放射诱导的MOLT-4细胞凋亡不同阶段活性Caspase-3在细胞内的空间分布、细胞形态的变化以及二者的关系。方法:10GyX射线照射诱导MOLT-4细胞。亚G1峰法和凝胶电泳检测凋亡细胞中DNA变化。膜联蛋白V标记细胞膜,带荧光素的Caspase抑制剂(fluorochromeinhibitorofcaspase,FLICA)标记活性Caspase,并用流式细胞仪检测。应用共聚焦显微镜观察MOLT-4细胞凋亡形态及活性Caspase-3在细胞内的分布。免疫印迹检测Caspase-3的表达。结果:X射线10Gy照射后,MOLT-4细胞出现细胞膜翻转、凋亡小体等典型的细胞凋亡特征。其凋亡过程中Caspase-3激活,4h其活性明显增加。在细胞内,活性Caspase-3由靠近细胞膜的胞浆面向细胞浆、胞核移行,与细胞凋亡的形态学变化相吻合,在时间上早于细胞膜翻转。结论:X线照射后MOLT-4细胞中Caspase-3激活,且其亚细胞分布与细胞凋亡的形态学变化相吻合。活性Caspase-3在凋亡细胞中空间位相的移行是放射诱导的细胞凋亡机制之一。

膜受体介导的细胞凋亡与细胞周期的关系

背景与目的:线粒体介导的细胞凋亡大部分与细胞周期相关,但膜受体介导的细胞凋亡是否与细胞周期有关尚不清楚。本研究旨在观察膜受体介导的人类细胞凋亡与细胞周期特异性,阐明膜受体介导的细胞凋亡与细胞周期的关系。方法:用肿瘤坏死因子-α、抗Fas抗体分别处理指数生长期的Molt-4、Jurkat以及健康人外周血淋巴细胞;应用AnnexinV/PI和API等方法,通过流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期特异性。结果:处于静止期的外周血淋巴细胞对凋亡诱导剂不敏感,凋亡率是6%～8%。Molt-4、Jurkat细胞以及加入植物血凝素刺激的外周血淋巴细胞经肿瘤坏死因子-α、抗Fas抗体诱导后出现了明显的细胞凋亡,凋亡率是15%～28%。膜受体介导的细胞凋亡主要发生在细胞周期的早G1期。结论:膜受体介导的细胞凋亡与细胞周期相关,具有细胞周期特异性。

抗癌药物诱导Molt_4细胞凋亡的周期时相性分析

[目的]应用流式细胞术 (FCM)分析抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的周期特异性。[方法]将喜树碱、紫外线和槐耳清膏诱导的Molt-4细胞分别用Sub_G1 法和PA法 (FITC_AnnexinⅤ和PI标记法 )检测细胞凋亡。[结果]Sub_G1法可简便地检测晚期凋亡细胞 ,PA法可检测早期凋亡细胞 ,并可较准确分析细胞凋亡的周期时相性。[结论]结合Sub_G1 法和PA法可简便、有效筛选出细胞周期特异性抗肿瘤药物 ,为抗癌新药的开发和研制提供技术平台。

TNF-α诱导Molt-4细胞Bcl-2蛋白磷酸化的周期特异性

目的以肿瘤坏死因子-α诱导的Molt-4细胞凋亡为模式,观察Bcl-2蛋白磷酸化有无细胞周期特异性,探讨膜受体途径介导的细胞凋亡的周期特异性发生机制。方法TNF-α诱导Molt-4细胞凋亡,API法检测细胞凋亡的细胞周期特异性。流式细胞仪分选各个细胞周期时相的细胞群,蛋白免疫印迹检测Bcl-2蛋白的细胞周期特异性表达。结果TNF-α诱导Molt-4细胞凋亡主要发生在细胞周期的G1期。Bcl-2蛋白在TNF-α诱导后表达增加,G1期Molt-4细胞中bcl-2部分磷酸化,在时间上与凋亡发生的时间一致。结论加入TNF-α培养的Molt-4细胞Bcl-2蛋白磷酸化失活与细胞凋亡的细胞周期时相一致,具有细胞周期特异性。

紫杉醇诱导急性白血病细胞S期特异性凋亡

背景与目的:化疗药物的细胞周期特异性是临床设计化疗方案的重要依据。一般认为,紫杉醇为G2/M期特异性化疗药物。但是近来的相关研究却表明,药物在体内的细胞周期特异性可能与体外不同。本研究旨在观察紫杉醇作用于不同生长状态下白血病细胞的细胞周期特异性有无改变。方法:利用流式细胞分析技术,对紫杉醇作用于人急性淋巴细胞性白血病细胞株Molt-4以及作用于17例急性白血病细胞所诱导的凋亡效应进行了观察。结果:紫杉醇诱导在对数生长状态下的Molt-4细胞株G2/M期特异性凋亡,在高密度状态下培养的Molt-4细胞为G0/G1期特异性凋亡,而在临床标本中诱导S期特异性凋亡。结论:紫杉醇在不同模型诱导不同的细胞周期特异性凋亡。与一般认为的不同,紫杉醇引起患者白血病细胞S期特异性凋亡。这些不同很可能与细胞处于不同的生长状态有关。

Cyclins非时相性表达和MDR1与胃肠道恶性肿瘤分期的研究

目的：研究胃肠道恶性肿瘤的4种主要Cyclins的表达规律，以此为依据对恶性肿瘤进行分型，并结合肿瘤标本中MDR1（多药耐药基因）的表达情况，与肿瘤TNM分期进行相关性研究。方法：使用流式细胞术分析新鲜手术获取的肿瘤标本的CyclinD1，E，A，B1及与MDR1表达情况，再记录术后病理报告进行TNM分期。结果：根据4种主要Cyclins的表达情况对恶性消化道肿瘤分为Ⅰ～Ⅳ型cyclin非时相性表达类型，此Ⅰ～Ⅳ型细胞周期类型与TNM分期有一致性（Kappa值为0．599，P〈0．01），Ⅰ～Ⅳ型细胞周期类型中MDR1的表达水平逐渐增高（Spearman相关系数0．495，P〈0．01）。结论：根据4种主要Cyclins（Cyclin D1，E，A，B1）的表达情况对胃肠肿瘤进行的分型具有与TNM分期相同的意义，可以说是对“分子分期”的一种探索。在消化道肿瘤中，MDR1与肿瘤细胞周期破坏类型有关，对治疗具有指导意义。

胃癌细胞凋亡与增殖的平衡与相关基因的关系

目的: 探讨在肿瘤细胞中凋亡与增殖平衡的变化(apoptotic index/proliferative index,AI/PI)以及与相关基因的关系. 方法:取普外科手术切除的标本68例,其中胃正常组10例,癌旁组10例,胃癌标本48例.术前均未接受过化疗或放疗.男32例,女16例.年龄24-74(平均54.4)岁. 术前内镜活检病检诊断,术后病理诊断证实.标本均经中性甲醛(40 g/L)固定,常规石蜡包埋,作4μm厚连续切片.应用流式细胞仪,分别定量分析细胞的凋亡群体和增殖群体;免疫组化方法检测survivin,Fas与FasL基因表达的变化;共聚焦显微镜对细胞增殖进行形态学观察. 结果:在从胃正常组,癌旁组到肿瘤组细胞的演进过程中,AI/PI分别为0.46±0.14,0.35±0.12,0.23±0.11. 胃正常组,癌旁组和肿瘤组细胞相互之间,差异有显著性(F=19.453,P=0.000<0.01).胃癌细胞的AI/PI经频数分布表分析和检验均服从正态分布.胃癌细胞AI/PI 范围0.05-0.46.中位数和均数±标准差分别为0.245和0.23±0.11.Skewness的值为0.067,Kurtosis的值为-0.868. 胃癌细胞随着恶性进展,AI/PI总体呈下降的趋势, 与淋巴转移和远处转移相关(P<0.05).survivin,Fas与Fasl,基因表达阳性染色主要定位于肿瘤细胞胞质或胞膜中,为粗细不一的棕黄色颗粒.在48例胃癌中survivin,Fas与FasL的阳性表达率分别为56.2%,43.8% 和60.4%.AI/PI的中位数为0.245,将胃癌分为>0.245 组和<0.245组.结果显示相应的两组组织切片中survivin 阳性表达率增加(X2=6.857,P<0.01),而Fas的阳性表达率降低(x2=4.148,P<0.05)和FasL的阳性表达率增加(x2=4.269,P<0.05),.共聚焦显微镜显示肿瘤组织中Ki- 67高表达. 结论:AI/PI总体呈下降的趋势,可能与survivin基因表达上调,Fas基因表达下调有关.

一种新的双向电泳蛋白样品制备方法

目的探讨双向凝胶电泳(2-DE)样品裂解液对蛋白质分离和双向凝胶电泳结果的影响。方法以MOLT-4细胞为例,采用3种溶解性能不同的裂解液提取细胞中的蛋白质组,并分别进行双向聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果通过对2-D PAGE图谱的比较分析,发现采用8 mol/L Urea,2 mol/L Thiourea,4%CHAPS,1%NP-40,4%TritonX-100,65 mmol/L DTT,0.5 mmol/L PMSF,0.5%pharmalyte 3-10,能获得质量较高的2-DE图谱。结论采用高浓度脲、三去污裂解液有利于获得优质的蛋白质样品,从而提高蛋白质提取率和双向电泳分辨率等。

Chk1/2反义寡核苷酸对顺铂诱导的A549细胞生物学行为的影响

目的观察顺铂作用下A549细胞的细胞周期变化规律和Chk1、Chk2(Chk1/2)反义寡核苷酸(AsODN)对顺铂(DDP)诱导的A549细胞生物学行为的影响。方法流式细胞术SubG1法检测DDP作用下A549细胞周期和凋亡的动力学变化;蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测转染Chk1/2AsODN后Chk1/2蛋白的表达;流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC法和SubG1法检测转染Chk1/2AsODN后DDP作用下的细胞周期和凋亡变化。结果10μmol/LDDP作用12h后A549细胞出现明显的S期阻滞,Chk1/2AsODN对A549细胞中Chk1/2蛋白表达有明显抑制作用,转染Chk1/2AsODN可显著增加DDP诱导下A549细胞的凋亡率约200%～300%,而联合转染Chk1/2AsODN与单转染相比,凋亡无明显增加(P>0.05)。转染Chk1/2AsODN引起化疗增敏的机制是通过解除S期阻滞这种肿瘤细胞的自我保护机制实现的。结论Chk1/2可作为肺癌化疗药物增敏治疗的有效靶点,灭活Chk1/2基因可以显著增强肿瘤细胞化疗的敏感性。

应用Sub-G1法和PA法分析HL-60细胞自发凋亡的周期特异性

分别用Sub G1法和PA法对人类早幼粒细胞急性白血病细胞株 (HL 6 0 )的自发凋亡进行检测 ,发现HL 6 0细胞自发凋亡时 ,在DNA直方图上 ,G1峰前出现亚G1峰 (Sub G1峰 ) ,G1期细胞增加 ,S期和G2 /M期细胞减少。同时G1期细胞发生自发凋亡 ,而S期 ,G1期细胞少有凋亡发生。

胃肠道恶性肿瘤Cyclins表达分型与MDR1及TNM分期的关系

目的:研究胃肠道恶性肿瘤的4种主要Cyclins (Cyclin D1,E,A,B1)的表达规律,以此为依据对恶性肿瘤进行分型,并结合肿瘤标本中 MDR1(多药耐药基因1)的表达情况,与肿瘤 TNM分期进行相关性分析．方法:采用流式细胞术分析新鲜手术获取的 62例肿瘤标本(胃癌32例,结直肠癌30例)的 Cyclin D1,E,A,B1及MDR1表达情况,再记录术后病理报告进行TNM分期．结果:根据4种主要Cyclins的表达情况对恶性消化道肿瘤分为Ⅰ-Ⅳ型Cyclin非时相性表达类型,此Ⅰ-Ⅳ型细胞周期类型与TNM分期具有一致性,Kappa系数等于0．599(P<0．01)．Ⅰ- Ⅳ型细胞周期类型中MDR1的表达水平逐渐增高,等级相关系数rs为0．495(P<0．01)．结论:根据Cyclins的表达情况对消化道恶性肿瘤进行的分型具有与TNM分期相同的意义．在消化道肿瘤中,MDR1与肿瘤细胞周期素表达类型有关,对治疗具有指导意义．

流式细胞术检测临床实体瘤细胞周期蛋白表达的方法研究

目的探讨cyclin/DNA双参数流式细胞术及流式细胞术分选后的免疫沉淀蛋白质印迹技术和共聚焦显微镜技术检测临床实体瘤细胞周期蛋白表达的可行性、科学性和优越性,为肿瘤的细胞周期分析提供科学有效的技术支持。方法运用cyclin/DNA双参数流式细胞术及流式细胞术分选后的免疫沉淀蛋白印迹技术和共聚焦显微镜技术检测临床实体瘤细胞周期蛋白的表达,并与传统的免疫组织化学切片法进行比较。结果流式细胞术可以准确地对细胞周期蛋白在临床实体瘤中的表达进行定性、定量、定位的分析,较为系统地反映了细胞周期蛋白在临床实体瘤中的表达特性和肿瘤的生物学特性。结论Cyclin/DNA双参数流式细胞术及流式细胞术分选后的免疫沉淀蛋白质分析技术和共聚焦显微镜技术是一种科学有效的检测临床实体瘤细胞周期破坏特性的技术和方法。

抑癌基因DAB2IP在结直肠癌中的表达及临床意义

目的:探讨抑癌基因DAB2IP在结直肠癌中的表达及临床意义。方法:采用免疫组织化学方法对103例结直肠癌组织、正常黏膜和转移淋巴结组织进行蛋白检测。结果:DAB2IP在正常黏膜中的表达远高于结直肠癌组织和转移淋巴结组织(P<0.05),其表达水平与淋巴结转移、远处转移、淋巴结转移度、临床Dukes分期、CEA和生存时间相关(P<0.05),DAB2IP是结直肠癌重要的预后因素(P<0.05)。结果:DAB2IP下调可能导致结直肠癌的发生、浸润转移和生存时间减少。

无感染性休克的腹膜炎患者肠系膜血管K_(ATP)通道表达减少

目的探讨KATP通道在确诊无感染性休克的腹膜炎患者肠系膜血管中的表达。方法收集16例腹膜炎患者和14例非腹膜炎患者的肠系膜动脉血管,检测其KATP通道的mRNA表达。结果腹膜炎组(n=16)Kir 6.1mRNA相对表达量为(0.358±0.150),SUR2BmRNA相对表达量为(0.324±0.211);非腹膜炎组(n=14)Kir 6.1mRNA相对表达量为(1.125±0.554),SUR2BmRNA相对表达量为(1.058±0.338);无感染性休克发生时,腹膜炎组KATP通道表达较非腹膜炎组减少,差异有统计学意义(P<0.01)。结论在单纯腹膜炎到脓毒血症的发展过程中,血管KATP的表达水平是变化的,该研究可能为寻找治疗腹膜炎感染性休克的时间窗提供了线索。

细胞周期特异性细胞凋亡的形态学观察

目的观察喜树碱诱导Molt-4细胞凋亡形态的细胞周期时相性变化,建立一种新的细胞周期特异性细胞凋亡分析方法。方法以凋亡诱导剂喜树碱(终浓度为0.15μmol/L)影响下的Molt-4细胞为检测对象,应用流式细胞术分析细胞凋亡及细胞周期的变化;用琼脂糖凝胶电泳的方法探测断裂的DNA片段存在,进一步证实细胞凋亡的存在;碘化丙啶(PI)染色后,再应用流式分选术结合激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microsope,LSCM)观察各期细胞形态从而对已凋亡细胞进行形态学确认。结果①琼脂糖凝胶电泳可见清晰的DNA梯形条带(DNAladder);②喜树碱导致Molt-4细胞周期的S期水平明显下降,并伴随有一明显的细胞凋亡峰;③只在S期细胞中可见到已凋亡细胞。以上说明喜树碱可以诱导Molt-4细胞凋亡,并细胞凋亡发生在细胞周期中的S期,与传统的结论一致。结论通过DNA直方图分选后细胞凋亡形态学分析可以对细胞凋亡的细胞周期特异性进行检测。这种方法使细胞周期特异性凋亡的分析更加可靠全面。

咖啡因对喜树碱诱导Molt-4细胞凋亡的影响

背景与目的:有报道认为咖啡因(caffeine)可以作用于细胞周期检测点,从而影响细胞周期的进程,而这种效应对于肿瘤细胞凋亡的影响尚存在争议。本研究探讨咖啡因对喜树碱诱导Molt-4细胞凋亡的作用及其对细胞周期检测点的效应。方法:用喜树碱诱导细胞凋亡,以咖啡因作为干扰细胞周期检测点的因素。用API法(AnnexinⅤ-propidiumiodide,AnnexinⅤ/PI)及亚G1峰法对细胞凋亡率以及凋亡发生的周期特异性进行检测分析。结果:2.0～20.0mmol/L的咖啡因对处于对数生长期Molt-4细胞增殖没有影响。喜树碱能诱导Molt-4细胞产生以S期细胞为主的细胞周期特异性凋亡,0.15μmol/L喜树碱作用4、6h,细胞凋亡率分别为(23.69±2.26)%、(36.99±1.42)%;10.0mmol/L咖啡因能显著抑制这种细胞凋亡,与0.15μmol/L喜树碱联合作用4、6h后,细胞凋亡率分别下降至(4.79±0.64)%和(2.69±0.56)%。去除咖啡因后,凋亡细胞明显增多,去除4、6h后细胞凋亡率升至(46.23±0.21)%和(55.81±0.41)%,且仍以S期细胞为主。结论:咖啡因可以抑制喜树碱诱导细胞凋亡。作为影响细胞周期检测点的药物,咖啡因可以明显屏蔽检测点对损伤细胞的监督,抑制细胞凋亡,但其作用是一过性的、可以逆转的。

CD11b/DNA双参数流式细胞术检测HL-60细胞分化的细胞周期

目的采用双参数流式细胞术研究全反式维甲酸(alltransretinoidacid,ATRA)诱导人类急性早幼粒白血病细胞HL-60细胞分化的细胞周期。方法HL-60细胞经分化诱导剂ATRA(终浓度为1μmol/L)诱导不同时间点后,利用CD11b/DNA双参数流式细胞术同时检测分化细胞表面抗原CD11b的表达及分化细胞DNA含量。结果HL-60细胞经ATRA诱导后,细胞表面分化抗原CD11b表达明显升高,细胞阻滞于G0/G1期,且CD11b阳性细胞主要位于G0/G1期。结论CD11b/DNA双参数流式细胞术能简便,快速,直观地检测细胞分化的细胞周期。

新型冠状病毒肺炎暴发流行中心疫区急腹症诊治经验

目的分析新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情下在中心疫区开展急腹症诊治的临床效果,总结临床经验。方法回顾性分析2020年1月24日至2020年2月29日华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊收治和院内会诊的急腹症病人的临床处置和预后,随访结束时间为2020年3月8日。结果2020年1月24日至2020年2月29日已处置腹痛为主要表现的急腹症病人19例,其中,合并COVID-19病人(确诊及疑似病例)5例。19例病人中,有急诊手术指征并行急诊手术处置的9例,恢复顺利者7例,死亡2例,其中确诊COVID-19病人行急诊手术处置1例,死亡1例;行保守治疗并密切观察病情变化者10例(包括4例COVID-19病人),均恢复良好;随访至今未见密切接触上述COVID-19病人的医护人员出现感染表现。结论COVID-19疫情期间在中心疫区诊治急腹症病人时无论其是否是COVID-19病人都做到仔细检查,严格把握手术指征,术中熟练操作,术后密切监护及观察,同时做好医护人员个人防护。