大肠杆菌肌苷酸节点代谢优化高效合成肌苷

该研究以产肌苷的大肠杆菌INO4-5为出发菌,针对其发酵过程中副产物含量高、肌苷产量低以及需要额外添加腺嘌呤等问题,对肌苷酸节点代谢流进行了优化。首先使用不同启动子和核糖体结合位点对枯草芽孢杆菌来源的purA_(bsu)基因进行了表达,以强化腺苷合成支路,使菌株5 L发酵罐上的肌苷产量达到了29.5 g/L,且无需额外添加腺嘌呤。接着通过替换guaB基因的原有启动子以弱化鸟苷合成支路,并过表达guaC基因促使鸟苷酸回流至肌苷酸,使菌株副产物含量显著降低且肌苷产量提升至35.1 g/L;最后对不同5′-核苷酸酶进行了筛选和强化,发现引入来自酿酒酵母的特异性5′-核苷酸酶基因(introduction of specific 5′-nucleotidase gene,ISN1)可有效促进肌苷生产。最终所得菌株INO7-6在5 L发酵罐上发酵,肌苷产量为41.2 g/L,转化率为0.17 g/g葡萄糖,生产强度为0.86 g/(L·h),为目前报道的基因工程菌株的最高产量。

氨基酸生产菌代谢工程研究发展趋势

氨基酸及其衍生物具有重要的代谢与调控功能。随着代谢工程技术的迅速发展,代谢工程育种逐步取代传统的育种技术,在氨基酸生产菌株的选育中占据了主导地位,特别是在优良性状的选育,如菌株的低值原料利用能力、抗逆性等方面表现出越来越重要的作用。文章主要介绍氨基酸生产菌株的代谢工程育种技术及其发展趋势,以及代谢工程育种技术在菌株优良性状选育方面的应用。

磷酸盐对Escherichia coli TRJH L-色氨酸发酵代谢流分布的影响

应用代谢流分析方法研究了磷酸盐对Escherichia coli TRJH L-色氨酸发酵中后期胞内代谢流分布的影响.结果表明:在发酵中后期添加4.0,g/L,KH2PO4时,与不添加KH2PO4相比,L-色氨酸合成的代谢流增加了19.3%,而副产物Lac、HAc和Ala的代谢流仅增加了6.0%、7.8%和6.8%.与添加8.0,g/L,KH2PO4比较,副产物代谢流的增量明显减少,说明磷酸盐的过量添加会使EMP途径代谢流量超过TCA及L-色氨酸合成支路的代谢能力,从而导致副产物的生成增加,L-色氨酸生物合成的转化率相对降低.因此,在L-色氨酸发酵过程中应该严格控制磷酸盐的用量.

柠檬酸钠对L–缬氨酸发酵及代谢流量分布的影响

以黄色短杆菌XV0505为供试菌,研究柠檬酸钠对L–缬氨酸发酵的影响,同时应用MATLAB软件和代谢流量分析方法,定量研究柠檬酸钠对L–缬氨酸发酵中后期胞内代谢流量分布的影响.结果表明,添加2.0 g/L柠檬酸钠可提高L–缬氨酸产量,同时不影响菌体生长.添加柠檬酸钠后,L–缬氨酸生物合成的代谢流从41.42增长至45.87,较未添加前提高了10.74%.合成副产物L–丙氨酸和HAc的代谢流明显减少,分别降低了21.10%和32.47%.因此,添加柠檬酸钠能够扰动L–缬氨酸生物合成途径关键节点代谢流量分布,有利于减少副产物的生成,提高L–缬氨酸生物合成途径的代谢流量.

微生物同步利用葡萄糖和木糖代谢工程概述

现阶段,随着资源枯竭和环境污染问题的日益突出,利用农业废弃物等木质纤维素原料发酵生产生物产品、生物能源和生物材料已经成为学术界和社会的共识.微生物同步利用葡萄糖和木糖是木质纤维素生物炼制的重要内容,同时也有利于提高芳香族氨基酸等产品的发酵性能.然而,由于碳分解代谢物阻遏(葡萄糖效应)的存在,大多数微生物并不具备这种特性,迫切需要采用代谢工程手段构建高效同步利用葡萄糖和木糖的菌株.首先对微生物同步利用葡萄糖和木糖的意义进行了说明,然后阐述了氨基酸和核苷生产菌大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌葡萄糖效应的分子机制和破除策略,同时介绍了一些能够同步代谢葡萄糖和木糖的工程菌株的实际应用.

溶氧强制振荡对L-苏氨酸发酵产率及其代谢流迁移的影响

为有效降低L-苏氨酸发酵过程中副产物的积累,考察了发酵过程中的溶氧强制振荡对L-苏氨酸发酵产率及其多种副产物积累的影响,并深入探讨了振荡行为对L-苏氨酸生物合成代谢网络的代谢流分布的影响。结果表明:采用溶氧强制振荡工艺能够明显提高L-苏氨酸的发酵产率和降低多种抑制性产物的合成。与非振荡工艺相比,经过36h培养,细胞生物量达到29.5g·L-1,苏氨酸的质量浓度达到118.9g·L-1,而乙酸质量浓度下降到0.8g·L-1,副产的其他氨基酸也大大降低。通过代谢流分析表明,在发酵后期的一个振荡周期(30h至31h)内,与非振荡组相比,HMP途径的代谢流量由6.5提高至95.88,CO2固定反应代谢流量由45.1提高至86.1,TCA循环相对代谢流量从1.86提高至17.78,从而导致苏氨酸对葡萄糖的质量转化率从30.0%增加至57.0%。溶氧强制振荡条件下的苏氨酸发酵液中各种副产物更少,更适合今后的大规模工业化生产。

柠檬酸钠对L-谷氨酸发酵代谢流迁移的影响

为更全面深入地理解细胞内谷氨酸代谢的调控机制,以黄色短杆菌GDK-9为供试菌株,应用MATLAB软件和代谢流分析方法,定量研究了添加柠檬酸钠后L-谷氨酸发酵中后期胞内的代谢流迁移.在L-谷氨酸发酵中后期添加3.0 g/L柠檬酸钠后,合成副产物L-丙氨酸和乳酸的代谢流量明显减少,分别降低了18.7%和27.4%,EMP途径和乙醛酸循环的代谢流分别减少了0.88和2.12,HMP途径的代谢流增加了0.88,而L-谷氨酸生物合成的代谢流从73.59增长至76.47,较未添加前提高了3.9%.添加柠檬酸钠能使关键节点发生代谢流迁移,提高L-谷氨酸合成中心代谢途径的代谢流量.

代谢工程改造大肠杆菌合成L-异亮氨酸的研究

以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,利用基因重组技术替换ilv LXGMEDA启动子并过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilv A和ilv IH,以期获得L-异亮氨酸生产菌。将ilv LXGMEDA启动子替换为强启动子Ptrc并敲除ilv LXGM后获得ILE01菌株,于该菌株中分别过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilv IH及共表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilv A和ilv IH,获得菌株ILE02和ILE03,其L-异亮氨酸产量分别达到1.75 g/L和2.19 g/L。针对ILE03α-酮丁酸积累量过高的问题,通过改变操纵子中ilv A和ilv IH的顺序调节其转录水平,获得菌株ILE04,其L-异亮氨酸产量达2.85 g/L。利用ILE04于5 L发酵罐中进行发酵实验,L-异亮氨酸产量、发酵强度及转化率分别为5.23 g/L、0.17 g/(L·h)及4.6%。

不同碳源生物转化合成L-亮氨酸的代谢计量分析

目的:建立黄色短杆菌利用不同碳源生物合成L-亮氨酸的代谢网络模型,并进行代谢网络计量分析。方法:通过对所构建的L-亮氨酸代谢网络模型进行途径分析,确定以果糖、葡萄糖、蔗糖或木糖为碳源时L-亮氨酸生物合成的基元模型、最大理论产率和不同模型的呼吸熵。结果:通过途径分析得到了L-亮氨酸生物合成的基元模型。以果糖、葡萄糖、蔗糖和木糖为碳源时L-亮氨酸的最大理论产率均为66.7%,其对应的最大呼吸熵分别为18、16、19、18。结论:L-亮氨酸理论得率与碳源种类无关;呼吸熵增加,能够有效提高L-亮氨酸合成代谢流,限制菌体量的过量生成。与其他碳源相比,蔗糖能够避免碳架溢流出现,合成L-亮氨酸能量代谢需求低;而葡萄糖能够较好地满足菌体生长和产酸的需求。

谷氨酸棒杆菌代谢副产物对α-酮戊二酸积累的影响

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中ldh基因编码乳酸脱氢酶,可以催化丙酮酸转化生成乳酸,ack A和pqo基因编码乙酸激酶和丙酮酸:醌氧化还原酶,可以催化丙酮酸转化为乙酸。为了研究这三个基因缺失对谷氨酸棒杆菌α-酮戊二酸积累的影响,以C.glutamicum GDK-10为出发菌株,通过重叠延伸PCR及同源重组技术分别构建ldh,pqo,ack A,pqo和ack A基因缺失突变株GDK-14,GDK-15,GDK-16,GDK-17。对出发菌及上述重组菌株进行发酵验证比较,发酵结果表明:ldh和pqo基因缺失菌株的α-酮戊二酸产量分别比出发菌降低了8.54%和27.9%,而ack A基因的缺失使α-酮戊二酸产量比出发菌提高了8.99%。

苹果酸对L-谷氨酸发酵代谢流迁移的影响

为更全面深入地理解细胞内谷氨酸代谢的调控机制,以黄色短杆菌GDK-9为供试菌株,应用MATLAB软件和代谢流分析方法定量研究添加苹果酸后L-谷氨酸发酵中、后期胞内的代谢流迁移。在L-谷氨酸发酵中、后期添加2.0 g/L苹果酸后,合成副产物L-丙氨酸和乳酸的代谢流量明显减少,分别降低了22.1%和16.5%,EMP途径和乙醛酸循环的代谢流分别减少了2.26%和9.09%,HMP途径的代谢流增加了2.26%,而L-谷氨酸生物合成的代谢流从73.59%增长至79.92%,较未添加前提高了6.33%。添加适量苹果酸能使关键节点发生代谢流迁移,提高了L-谷氨酸合成中心代谢途径的代谢流量。

大肠杆菌L-色氨酸合成的代谢流分析

目的：从代谢流的层面研究育种过程中基因操作对色氨酸积累的影响，为色氨酸菌种选育的设计思路提供理论指导和验证。方法：根据实验菌株的代谢特点构建￡一色氨酸代谢网络图，对出发菌株TRTH0709，及其重组菌株TRTH1013、TRTH1105和TRTH1107在30L发酵罐中进行分批流加发酵试验，在发酵进入稳定期后的26．28h，分别检测主要胞外代谢物的浓度并计算变化速率。结果和结论：得到了各菌株在拟稳态下的代谢流分布图。转酮酶基因（tktA）和磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因（ppsA）过表达能显著影响中心代谢途径，使代谢流向有利于色氨酸合成的方向改变，贮碳因子基因（csrA）敲除的影响较小，但在tktA和ppsA过表达质粒存在的情况下对色氨酸合成的代谢流有明显的促进作用。进一步的菌种改造仍有待进行，葡萄糖转运系统的替代和三羧酸循环的减弱是主要方向。

大肠杆菌芳香族氨基酸代谢工程研究进展

芳香族氨基酸包括L-苯丙氨酸(L-Phe)、L-酪氨酸(L-Tyr)和L-色氨酸(L-Trp),是生物体内非常重要的必需氨基酸,具有重要的生物学功能,广泛应用于医药、食品和饲料等领域。本文中,笔者介绍了芳香族氨基酸的生物合成途径以及代谢调控,综述了构建大肠杆菌芳香族氨基酸生产菌株的代谢工程策略。针对现阶段工业化生产芳香族氨基酸存在的问题,笔者对进一步应用代谢工程策略改造芳香族氨基酸菌株进行了展望。

CRISPRi干扰中心代谢基因转录对苏氨酸合成的影响

苏氨酸是重要的饲料氨基酸,需求量持续增加,提高苏氨酸发酵产率和糖酸转化率,降低生产成本已成为一个重要课题。该实验以苏氨酸工程菌Escherichia coli THRD为出发菌,利用CRISPRi(clustered regularly interspaced short palindromic repeats interference)技术研究中心代谢9个基因转录水平的改变对苏氨酸合成的影响。发酵结果显示,干扰zwf、pfk A和glt A基因的转录水平提高了苏氨酸的合成效率,对应菌株苏氨酸产量分别为60. 3、64. 6和65. 8 g/L,与出发菌(50. 9 g/L)相比,分别提高了18. 5%、26. 9%和29. 3%。糖酸转化率分别为40%、38%和39%,与出发菌(34%)相比,分别提高了17. 7%、11. 8%和14. 7%。结果表明,通过CRISPRi干扰中心代谢基因的转录水平,可以调节合成代谢网络,使更多碳源流向苏氨酸,提高苏氨酸的合成效率。同时,该研究也为其他生物制品工程菌的构建提供了参考。

基于近红外光谱结合代谢流分析的L-缬氨酸发酵过程监控

L-缬氨酸作为必需氨基酸之一,在许多发酵类食品配料方面有重要应用。及时监控其发酵过程,有利于L-缬氨酸产品品质的提升。本文建立了一种发酵类的食品配料生产过程监控新方法。该方法通过对发酵原料和产物进行分析,建立主要原料及产物的近红外模型,结合代谢流模型,能够快速分析不同发酵条件下细胞内部代谢流分布及变化,实时监测发酵过程各项参数。该方法能够实现同时对多组分快速、准确的检测,从而弥补了传统检测方法的缺点和不足;能够快速分析获得发酵过程细胞内部代谢流分布,从而帮助控制发酵过程条件,实时监测发酵过程参数,为发酵过程自动化控制提供理论基础,为发酵类食品配料生产过程监控提供方法。

柠檬酸钠对L-组氨酸发酵代谢流分布的影响

目的:建立谷氨酸棒杆菌TL1105生物合成L-组氨酸的代谢网络模型,并进行代谢网络计量分析。方法:通过所构建的L-组氨酸代谢网络模型,利用MATLAB软件计算出添加柠檬酸钠和不添加柠檬酸钠发酵中后期代谢网络的代谢流分布。结果:在L-组氨酸分批发酵过程中,在发酵初期未添加柠檬酸钠的条件下流向戊糖磷酸途径(HMP)的代谢流为9.59,合成组氨酸的代谢流为8.91;在发酵初期添加2g/L柠檬酸钠的条件下流向HMP的代谢流为12.74,合成组氨酸的代谢流为9.61。结论:在发酵初期添加柠檬酸钠能够改变L-组氨酸生物合成途径的关键节点6-磷酸葡萄糖、丙酮酸及乙酰辅酶A的代谢流分布,保持糖酵解途径、三羧酸循环与HMP之间代谢流量平衡,有利于提高L-组氨酸生物合成途径的代谢流量,最终使流向组氨酸的代谢流增加了7.86%。

基于代谢流分析的L-组氨酸产生菌定向选育

基于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)代谢网络和L-组氨酸合成代谢流分析,对L-组氨酸产生菌谷氨酸棒杆菌TQ2223(Phe-,Tyr-,8-AGr,SGr,CINr)进行多次硫酸二乙酯(DES)定向诱变,依次赋予其6-MPr、5-MTr、2-TAr和L-Hisase-(L-组氨酸酶缺陷)遗传标记后得到突变株TL1106(5-MTr,SGr,5-FTr,8-AGr,6-MPr,2-TAr,Hisase-)。经验证突变株TL1106可在10%葡萄糖的发酵培养基上积累L-组氨酸6.0g/L,比出发菌株提高了2.5倍。结果表明:通过赋予目的遗传标记而改变代谢流分布,能够促进L-组氨酸的合成与积累。

代谢工程改造大肠杆菌生产肌苷

肌苷是一种具有重要生理功能的嘌呤核苷,被广泛应用在医药和食品领域。为构建肌苷工程菌株,该研究对阻断肌苷降解途径的大肠杆菌INO1-1进行了系统的代谢工程改造。结果显示,引入解淀粉芽孢杆菌的嘌呤操纵子和枯草芽孢杆菌来源的purF_(bsu)^(D293V,K316Q,S400W)突变基因,增强了肌苷合成途径,肌苷产量达到308.3 mg/L;将自身purA基因替换为枯草芽孢杆菌来源的purA_(bsu)^(P242N)突变基因,弱化了腺苷合成支路,使肌苷产量提升至1412.5 mg/L;敲除purR基因及引入prs eco D128A突变基因,增强了前体物5-磷酸核糖-1-焦磷酸的供应,使肌苷产量提升至3.1 g/L;引入解淀粉芽孢杆菌的pbuE基因以促进肌苷外排,又敲除nupC基因以减弱肌苷吸收,使肌苷产量提升至5.0 g/L;最终菌株INO4-5经5 L发酵罐发酵48 h,肌苷产量达到20.2 g/L,糖酸转化率和生产强度分别为0.12 g/g葡萄糖和0.42 g/(L·h)。该研究从头构建了一株可稳定高效合成肌苷的工程菌株,为肌苷的发酵法生产提供了新的参考。

代谢工程改造大肠杆菌生产L-丝氨酸

L-丝氨酸是一种具有重要生理学功能的中性氨基酸,广泛应用在食品、化妆品和医药等领域。为构建L-丝氨酸的生产菌株,对Escherichia coli MG1655进行了系统的代谢工程改造。采用的方法策略包括减弱L-丝氨酸的降解,增强L-丝氨酸合成酶类的表达以及转运系统的改造。特别是利用启动子P trp调控丝氨酸羟甲基转移酶的表达,减弱了L-丝氨酸向甘氨酸的降解途径,显著增强了L-丝氨酸的合成。最终所得菌株SER09摇瓶发酵24 h,L-丝氨酸产量可达13.53 g/L;在5 L发酵罐上发酵28 h,L-丝氨酸产量达到22.31 g/L。该研究从头构建了1株产L-丝氨酸的平台菌株,具有较好的应用前景。

采用膜分离技术高效分离提取L-亮氨酸

为提高L-亮氨酸提取得率,文中采用微滤、离交、超滤和反渗透技术对亮氨酸发酵液进行处理,重点研究了有机膜分离提取亮氨酸的工艺。确定膜分离工艺为:进料温度控制在45℃,pH调节至4.0;微滤压力0.1MPa,超滤压力0.25MPa,反渗透压力1.5MPa;反渗透浓缩倍数3～4效果最好。应用有机膜技术提取亮氨酸,其收率可达86.75%,产品纯度达98.58%。