江汉平原及其周边地区花生根瘤菌的遗传多样性

采用 RAPD分析技术和 1 6S- 2 3S r RNA间隔区段 (IGS) RFLP分析 ,分别对分离自江汉平原及其周缘地区的花生根瘤菌进行了遗传多样性和系统发育研究。结果表明 ,全部供试菌株分别在 48%和 50 %的相似性水平分为 I、II两群。供试花生根瘤菌与参比菌株 B. japonicum和 B. elkanii聚在群 I,参比菌株Rhizobium Sinorhizobium、Mesorhizobium和 Agrobacterium聚在群 。供试花生根瘤菌的遗传多样性及其在系统发育中的地位主要受地域因素的影响 ,来自江汉平原中心地带天门和潜江的菌株在 76%以上的相似性水平上聚在一起。处于周边地带的武汉和荆州 ,由于其特定的地理因素的影响 ,菌株的多样性更为丰富 ,部分菌株在分类上与其它地域的菌株相互融合 ,并在较高的相似水平存在一定摆动性。来自外缘随州的菌株 ,表现了明显的地理分隔作用 ,其在系统演化中的地位相对独立。总体上从平原腹地到外缘地区 ,根瘤菌地理分隔作用逐渐明显 ,在平原外缘的交接地带 ,根瘤菌的多样性最为丰富。

利用细菌双杂交文库筛选华癸中慢生根瘤菌7653R中与外膜蛋白Opa22互作的蛋白

为研究华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653R外膜蛋白Opa22在共生固氮过程中的作用机制,构建了细菌双杂交基因组随机文库,并以Opa22为诱饵,钓取与其相互作用的候选靶蛋白。结果获得12个与Opa22蛋白互作的阳性克隆,为后续研究Opa22的作用机制提供了新的线索和思路,同时也为开展根瘤菌蛋白互作的研究构筑了良好的技术平台。

花生根瘤菌群体遗传多样性和系统发育研究

利用 16SrRNARFLP、16SrRNA序列分析和 16S～ 2 3SIGSPCRRFLP技术对 4 3株花生根瘤菌和来自其他种属的 15个参比菌株进行了群体遗传多样性和系统分析。 16SrRNAPCRRFLP分析结果表明 ,所有供试花生根瘤菌均属于慢生根瘤菌属 ,在系统发育上与B .japonicum的亲缘关系最近 ,具有相同的 16SrRNARFLP基因型 ,而与B .elkanii相对较远。 16SrRNA序列分析结果表明 ,供试花生根瘤菌在系统发育上更接近于B .liaoningense ,序列间差异小于 1% ,而B .liaoningense在系统发育上与B .japonicum相距很近 ,其序列间差异小于 1%。 16S～ 2 3SrRNAIGSRFLP分析结果表明 ,尽管花生根瘤菌与B .japonicum和B .elkanii的亲缘关系很近 ,但在 71%的相似性水平上供试花生根瘤菌仍各自聚为一群 ,并可进一步分为A、B、C和D 4个亚群 ,该分群还明显反映了地理因素对群体遗传多样性和系统发育的影响。

棉浆黑液生物处理系统中嗜碱细菌的多样性

以棉浆黑液为细菌分离培养基,从某化纤厂黑液生物处理系统中分离到16株嗜碱细菌,对其形态及生理生化等特征的研究结果表明,所分离的嗜碱细菌以产芽孢的革兰氏阴性细菌占优势,在个体形态和生理生化特性方面具有丰富的多样性.扩增rDNA限制性分析(ARDRA)结果表明,棉浆黑液中的嗜碱细菌分为2大类群,不同菌株之间的酶切图谱具有较大的差异.测定黑液生物处理系统中6株占优势的嗜碱细菌的16S rDNA序列,与国际上已报道的细菌的16S rDNA序列进行比较,结果表明:它们的序列与芽孢杆菌属(Bacillus)或副球菌属(Paracoccus)中的参比菌株的同源性达到98%以上.以16S rDNA序列为基础的Bacillus属嗜细菌的系统发育分析结果显示,其中3个菌株与B.halodurans和B.wakoensis的相似性大于99%.

华癸中生根瘤菌共生基因exo56的克隆和功能初步分析

利用Tn5-sacB转座子随机插入突变的方法,从Mesorhizobium huakuii7653R的400个突变株中筛选获得1个共生缺失突变株HK56。使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)的方法从M.huakuii7653R中克隆了exo56序列。exo56全长969 bp,编码322个氨基酸,其编码产物Exo56与糖基转移酶2个家族的成员有很高的相似性,糖基转移酶为胞外多糖合成所必需。盆栽结果表明,exo56基因突变株只能形成少量的不固氮根瘤。

华癸中慢生根瘤菌7653R MCHK_8182基因的共生固氮功能

根据华癸中慢生根瘤菌7653R全局转录组分析结果,获得在共生固氮阶段显著上调表达的基因MCHK_8182;设计重叠延伸PCR引物,构建MCHK_8182双交换突变重组质粒载体;通过三亲本杂交,将突变载体导入7653R;在蔗糖压力培养下进行筛选,最终获得MCHK_8182双交换突变株。PCR及测序验证双交换突变株构建成功。植物盆栽试验结果显示,与7653R野生型接种的植株相比,MCHK_8182突变菌株接种的植株根瘤数减少,但固氮酶活未见明显差异。

1株广谱拮抗植物病原真菌的芽孢杆菌HNA3的鉴定及其活性成分分析

采用形态观察、16S rDNA序列和部分特异基因排列分析鉴定从植物根际土壤中分离的1株根际细菌HNA3;采用平板对峙试验和抑菌率计算方法测定其对供试植物病原真菌的拮抗谱和拮抗能力;通过摇瓶发酵和酸沉淀方法研究相关抗菌活性物质的产生条件及其分离方法;采用表面活性检测和有关功能编码基因的序列分析初步鉴定抗菌活性物质成分的性质。结果表明:HNA3菌株为1种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefa-ciens;BPY(牛肉膏蛋白胨酵母粉)培养基是适合HNA3生长和产生相关抗菌活性物质的适宜培养基;活性物质存在于发酵除菌液中,可通过酸沉淀方法分离获得。活性物质具有较高的稳定性和抗逆性,属于脂肽类物质。本研究结果表明HNA3具有较广谱的拮抗植物病原真菌的能力,具备研发成为一种表面喷施型微生物杀菌剂的特性和应用前景。

华癸中慢生根瘤菌7653R SraG sRNA的共生固氮功能

基于前期对华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)7653RsRNA(small non-coding RNA,sRNA)的生物信息学预测,经Northern blot验证获得SraGsRNA。本研究采用RACE与转录组高通量深度测序确定了SraG全长,并分别利用RNAfold软件和TargetRNA软件预测了SraG二级结构和靶位点,进而构建了M.huakuii 7653R的SraG插入失活突变体(M.huakuii SraGmut),并对突变体接种紫云英的共生表型进行了检测。盆栽试验结果表明,与野生型菌株M.huakuii 7653R相比,接种突变株M.huakuii SraGmut的固氮能力显著下降,突变株固氮酶活性下降约40%,植株鲜质量和根瘤数目也显著降低。结果表明,SraG的功能与M.huakuii 7653R的共生固氮过程相关,作为sRNA可能参与根瘤菌的共生固氮调控过程。

紫云英根瘤中特异表达CCPs基因的同源分析及表达定位

将紫云英根瘤中特异表达的编码CCPs(cysteine cluster protein)同源多肽的蛋白AsF259在大肠杆菌表达菌株(DH10B)中进行体外诱导表达,分别检测其在洋葱表皮细胞与紫云英根瘤中的细胞定位,并利用免疫荧光技术,检测紫云英中AsF259基因的时空表达特征。结果表明:AsF259蛋白分布于洋葱表皮的细胞壁、细胞膜、细胞质;基因表达和融合蛋白定位实验显示,AsF259在根瘤中呈特异性表达,在类菌体分化前期大量表达,且AsF259蛋白与类菌体共定位,表明AsF259基因属于NCR家族,在类菌体分化、维持和共生固氮过程发挥重要作用。

费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)的多样性研究

用大豆品种Willimas和黑龙 33从多年种植大豆未接种根瘤菌的土壤中捕集大豆根瘤菌 ,从分离株中选出 5 0株费氏中华根瘤菌 ,对供试菌株的培养特性、生长速度、耐酸、耐碱性、生长最终pH值、天然抗药性、CN源利用、刚果红吸收强度、产黑色素能力和质粒图谱类型进行了系统的比较研究 ,并通过聚类分析得到树状图谱 ,证实了不同土壤中费氏中华根瘤菌的多样性 .

紫云英类受体蛋白激酶Nip43靶蛋白的筛选与初步鉴定

以紫云英类受体蛋白激酶Nip43的S-TKs结构域构建诱饵载体,通过酵母双杂交技术,筛选获得17个候选的阳性克隆。经过测序分析和Blast比对,最终确定了1个互作蛋白EPN。EPN蛋白是网格蛋白聚合反应中的配体蛋白,可调控网格蛋白的聚合反应。通过实验验证显示,靶蛋白EPN与Nip43蛋白互作最强的区域为ENTH/ANTH结构域。Real-time q PCR检测表明,epn基因参与了根瘤菌早期结瘤过程。

利用细菌表面展示技术构建镉耐受性的重组根瘤菌

通过细菌表面展示功能基因InaXN、猴金属硫蛋白α亚基四聚体MT4α和两种启动子PnifH及Plac元件,分别构建两个重组质粒pTNIM和pBLIM.进一步通过三亲本杂交,将重组质粒分别导入费氏中华根瘤菌HN01,分别构建获得诱导表达型重组菌HN01(pTNIM)和组成表达型重组菌HN01(pBLIM).在培养条件下比较测定重组菌和出发菌对镉的吸附能力和耐受性,结果表明,组成表达型重组菌HN01(pBLIM)在上述两个方面的能力得到明显增强,对镉的吸附富集能力提高了2倍.研究还发现重组根瘤菌也具有很好的静态吸附效果.盆栽实验结果表明,接种诱导表达型重组菌HN01(pTNIM)的大豆根瘤和根中Cd2+的富集量均明显高于野生菌株HN01.本实验为后续探索重组根瘤菌与宿主植物共生体系在Cd2+污染土壤修复中的应用前景奠定了基础.

华癸根瘤菌7653R hfq基因突变株的构建及其生物学特性

【目的】研究hfq基因在Mesorhizobium huakuii 7653R抵抗外界不利环境和共生固氮中的功能特性。【方法】利用pK19mob同源重组方法构建7653R hfq基因的插入失活突变株7653RΔhfq,并构建互补菌株7653RΔhfq-C,对hfq在压力胁迫和共生固氮中的功能特性进行研究。【结果】与野生型7653R相比,突变株7653RΔhfq的生长速率降低,热激处理后致死率升高;hfq突变影响了7653R中部分sRNA的表达;在4.5%乙醇和50 mmol H_2O_2生长胁迫下,突变株适应性明显较野生型差。另外,接种突变株的紫云英结瘤能力和固氮酶活性都明显降低。【结论】hfq基因作为重要的转录后调控因子,在7653R抵御外界胁迫环境和与宿主紫云英的共生固氮中发挥了重要作用。