羟基积雪草苷对D-半乳糖致亚急性衰老模型小鼠学习记忆的影响及机制研究

目的探讨天胡荽羟基积雪草苷(madecassoside from hydrocotyle sibthorpioides,MHS)对D-半乳糖致亚急性衰老模型小鼠学习记忆功能的影响及其作用机制研究。方法SPF级昆明♂小鼠75只,随机分为正常组、模型组、MHS低、中、高剂量治疗组。采用D-半乳糖皮下注射建立亚急性衰老模型,利用Morris水迷宫观察小鼠的学习记忆能力;Western blot法测定小鼠海马组织中Aβ1-42蛋白及突触可塑性相关蛋白的水平;RT-PCR法检测Aβ相关基因的表达。结果与模型组比较,MHS能明显降低Aβ1-42蛋白的含量(P<0.05);抑制APP、BACE1和Cat B,同时提高NEP和IDE的表达(P<0.05);增强突触可塑性相关蛋白PSD-95、pNMDAR1、p-Ca MKII、p-PKACβ、PKCγ、p-CREB和BDNF的表达(P<0.05)。结论 MHS能改善小鼠的学习记忆功能,其机制可能与抑制Aβ生成与沉积、增强突触可塑性相关蛋白表达有关。

满天星异荭草苷对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的调控作用机制

目的研究满天星异荭草苷对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法满天星异荭草苷5,10,20,40,80和160μmol·L^(-1)作用于HepG2细胞24,48和72h后,用MTT法检测细胞存活率。满天星异荭草苷5,10和20μmol·L^(-1)作用细胞48 h,检测细胞内乳酸脱氢酶(LDH)的释放量;作用24 h,荧光探针H2DCF-DA测定细胞内活性氧(ROS)含量,流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡和线粒体膜电位,比色法检测胱天蛋白酶3,8和9的活性,RT-PCR检测Bcl-2和Bax m RNA的表达;Western蛋白印迹法检测Bcl-2,Bax和细胞色素c蛋白的表达。结果满天星异荭草苷浓度依赖性地(5~160μmol?L^(-1))抑制HepG2细胞存活,作用24,48和72 h时IC50分别为62.7±9.1,47.2±11.4和(18.2±7.5)μmol?L^(-1)。与细胞对照组相比,满天星异荭草苷5,10和20μmol?L^(-1)能明显提高LDH水平和细胞凋亡率(P<0.05),10和20μmol?L^(-1)可显著促进ROS的产生,降低线粒体膜电位,并增强胱天蛋白酶3和9的活性;RT-PCR和Western蛋白印迹结果表明,满天星异荭草苷能明显降低Bcl-2 m RNA和蛋白的表达,但升高Bax m RNA和蛋白表达(P<0.05),降低细胞色素c蛋白表达(P<0.05)。结论满天星异荭草苷抑制HepG2细胞增殖,促进其凋亡,该作用与线粒体凋亡途径密切相关。

敲低Raf激酶抑制蛋白促进LX-2人肝星状细胞增殖

目的研究Raf激酶抑制蛋白(RKIP)在LX-2人肝星状细胞增殖中作用。方法将RKIP小干扰RNA(siRNA-RKIP)重组质粒转染至LX-2细胞,培养5 d,并筛选出稳定转染的细胞。MTT法检测沉默RKIP后LX-2细胞的增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期;实时定量PCR检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和1型胶原蛋白(Col1)mRNA的表达。Western blot法检测RKIP、α-SMA、Col1及胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶(ERK/MAPK)信号通路相关蛋白的表达水平。结果与空白对照组相比,RKIP低表达明显诱导LX-2细胞增殖,抑制细胞凋亡,增加G2期细胞比例,提高Col1、α-SMA mRNA和蛋白表达。此外,RKIP的沉默明显提高ERK/MAPK磷酸化水平。结论敲低RKIP的水平促进LX-2细胞的增殖,其机制与激活ERK/MAPK信号通路有关。

过表达Raf激酶抑制蛋白(RKIP)抑制人肝星状细胞增殖

目的研究Raf激酶抑制蛋白(RKIP)对LX-2人肝星状细胞增殖的影响。方法用重组质粒pc DNA3.1-RKIP转染LX-2细胞,G418筛选并培养稳定转染的细胞。MTT法和集落形成试验检测过表达RKIP对LX-2细胞增殖、集落生成的影响;Western blot法检测RKIP、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、1型胶原蛋白(Col1)、基质金属蛋白酶1(MMP-1)、MMP-2及胞外信号调节激酶/丝裂原激活蛋白激酶(ERK/MAPK)信号通路相关蛋白的表达水平。结果与对照细胞相比,过表达RKIP明显抑制LX-2细胞增殖和集落形成,下调Col1、α-SMA、MMP-1和MMP-2蛋白表达,降低ERK/MAPK磷酸化水平。结论过表达RKIP抑制LX-2细胞的增殖,其机制与抑制ERK/MAPK信号通路有关。

委陵菜酸对小鼠急性肝损伤保护作用

目的观察委陵菜酸(TA)对脂多糖(LPS)/D-半乳糖胺(D-Gal N)诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用及其可能机制。方法雄性C57BL/6小鼠90只,随机分为对照组、模型组、阳性对照组及委陵菜酸低、中、高剂量组,各组小鼠分别灌胃给予受试物,连续3 d,末次给予受试物8 h后,除对照组外,其余小鼠腹腔注射LPS/D-Gal N,1.5 h后眼球取血,6 h后处死小鼠,取肝脏,观察肝组织损伤程度;采用试剂盒测定小鼠血清中门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-10水平;RT-PCR法检测TNF-α和诱导型一氧化氮合酶(i NOS)基因表达;ELISA法测定NF-κB p65蛋白含量;Western blot法检测细胞色素C和Bcl-2含量;另外,取肝组织匀浆检测caspase-3、8、9活性。结果与对照组比较,模型组小鼠ALT、AST、TNF-α、NO含量[分别为(1 833.5±125.4)、(2 183.5±138.9)U/L、(656.8±64.7)pg/m L、(205.28±16.79)μmol/L]明显升高(P<0.05),肝脏中NF-κB p65表达[(228.9±14.2)pg/mg]升高、Bcl-2蛋白表达(0.18±0.03)下降、Caspase-3蛋白表达(275.3±14.7)升高(P<0.05);与模型组比较,委陵菜酸3 mg/kg组小鼠血清中ALT、AST、TNF-α、NO含量[分别为(991.3±70.2)、(968.5±68.6)U/L、(226.5±35.9)pg/m L、(133.69±9.79)μmol/L]明显降低(P<0.05)、肝脏中NF-κB p65表达[(151.2±6.5)pg/mg]降低、Bcl-2蛋白表达(0.35±0.02)升高、caspase-3蛋白表达(156.3±5.9)下降(P<0.05)。结论委陵菜酸可保护LPS/D-Gal N诱导的小鼠急性肝损伤,其机制可能与抑制NF-κB信号通路减轻炎症反应、抑制凋亡蛋白表达、继而减少细胞凋亡有关。

联合使用表没食子儿茶素没食子酸酯、牛磺酸和三羟基异黄酮对大鼠酒精性肝纤维化的保护作用

目的:研究联合使用表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG),牛磺酸(taurine)和三羟基异黄酮(genistein)对大鼠酒精性肝纤维化的保护作用及其作用机制。方法:Wistar雄性大鼠随机分成6组即正常组,模型组,秋水仙碱组(0.5 mg·kg^(-1)),联合用药低剂量15.625 mg·kg^(-1)组(牛磺酸12.5 mg·kg^(-1)+EGCG 1.875 mg·kg^(-1)+三羟基异黄酮1.25 mg·kg^(-1)),中剂量31.25 mg·kg^(-1)组(牛磺酸25 mg·kg^(-1)+EGCG 3.75 mg·kg^(-1)+三羟基异黄酮2.5 mg·kg^(-1)),高剂量62.5 mg·kg^(-1)组(牛磺酸50 mg·kg^(-1)+EGCG 7.5 mg·kg^(-1)+三羟基异黄酮5 mg·kg^(-1))。除正常组外,其余各组ig乙醇5.0~9.5 g·kg^(-1),正常组ig给予等量生理盐水,每天1次,连续24周。末次给药24 h后,取血,处死大鼠,采集肝组织;检测血清中丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST),碱性磷酸酶(ALP),谷氨酰转移酶(GGT),透明质酸(HA),层黏连蛋白(LN)和三型前胶原(PCⅢ)水平的变化,检测肝组织中丙二醛(MDA),羟脯氨酸(Hyp),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),超氧化物歧化酶(SOD),采用免疫组化法检测各组肝组织中α-平滑肌肌动蛋(α-SMA),转化生长因子-β1(TGF-β1)及人母亲DPP同源物3(Smad 3)蛋白表达情况,同时做组织学检查,观察肝组织的病理变化。结果:与正常组比较,模型组大鼠ALT,AST,ALP,GGT,MDA,Hyp,HA,LN,PCⅢ,α-SMA,TGF-β1和Smad3显著升高(P<0.05),SOD和GSH-Px显著降低(P<0.05);与模型组相比,联合用药可显著降低ALT,AST,ALP,GGT,MDA,Hyp,HA,LN,PCⅢ,α-SMA,TGF-β1和Smad3的表达(P<0.05),显著升高SOD和GSH-Px的活性(P<0.05)。结论:联合使用表没食子儿茶素没食子酸酯、牛磺酸和三羟基异黄酮用药对乙醇所致的大鼠肝纤维化具有一定的保护作用,其机制可能与加快自由基清除,减轻脂质过氧化损伤,下调α-SMA,TGF-β1,Smad3表达有关。

人脐静脉血管内皮细胞微环境对鼻咽癌CNE-1细胞生长和化疗药物敏感性影响研究

目的构建人鼻咽癌细胞CNE-1与人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)的交互培养体系,初步观察HUVEC微环境对鼻咽癌细胞生物学行为以及化疗药物对细胞生长抑制的影响。方法将鼻咽癌细胞分为A、B和C组,A组加入100%CNE-1上清液,B组加入50%HUVEC上清液和50%CNE-1上清液,C组加入100%HUVEC上清液。采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞贴壁率、生长曲线和不同浓度顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)对鼻咽癌细胞的生长抑制作用,激光扫描共聚焦显微技术(laser scanning confocal microscopy,LSCM)检测各组活细胞线粒体膜电位和钙离子浓度。结果成功构建了CNE-1细胞与HUVEC细胞的交互培养体系。不同时间段CNE-1细胞贴壁率B组和C组均大于A组,2h时B组和C组与A组的贴壁率差异最为显著,F值分别为37.303和20.299,P值分别为0.004和0.001。A组细胞倍增时间为(42.26±0.21)h,B组为(41.24±0.30)h,C组为(45.90±0.53)h,交互培养B组细胞增殖速率显著快于A组,F=33.506,P=0.004;而C组慢于A组,F=109.353,P<0.001。5-FU作用3组细胞后,A组细胞的半数抑制浓度(IC50)为(81.65±0.07)μg/mL,B组为(118.38±0.11)μg/mL,C组为(82.95±0.06)μg/mL,与A组相比,B组增加,差异有统计学意义,F=2.381×105,P<0.001,C组差异无统计学意义。DDP作用3组细胞后,A组的IC50值为(12.44±0.04)μg/mL,B组为(16.70±0.01)μg/mL,C组为(8.13±0.01)μg/mL,B组大于A组,F=3.203×103,P<0.001;C组小于A组,F=3.278×103,P<0.001。提示交互培养B组细胞对化疗药物的敏感性降低。与A组细胞膜电位比较,B组细胞线粒体跨膜电位显著升高,F=25.511,P=0.007;C组显著降低,F=54.251,P=0.002。与A组钙离子浓度比较,B组钙离子浓度显著降低,F=260.972,P<0.001;C组也降低,F=562.385,P<0.001。结论改变肿瘤细胞的微环境,将改变细胞的生物学特性,血管内皮细胞有利于维持鼻咽癌细胞的正常功能,提高细胞的活力,并导致交互培养体系中鼻咽癌细胞对化疗药物敏感性降低。

红车轴草素对Aβ诱导大鼠认知障碍的保护作用

目的:探讨对β1-42淀粉样蛋白(Aβ1-42)诱导的大鼠认知障碍的保护作用及其机制。方法:10周龄Wistar大鼠随机分成假手术组、Aβ1-42模型组、阳性药(石杉碱甲0.05 mg/kg)对照组、红车轴草素10 mg/kg和20 mg/kg治疗组。采用侧脑室注射Aβ1-42建立大鼠认知障碍模型,治疗3周后,应用Morris水迷宫行为试验测试大鼠的学习记忆能力,利用Western blot法检测大鼠海马中Aβ1-42蛋白、突触可塑性相关蛋白(PSD-95、p-NMDAR1、p-Ca MKII、p-PKACβ、PKCγ、p-CREB)和BDNF蛋白的表达。Realtime PCR分析Aβ相关基因APP、BACE1、Cat B、NEP和IDE mRNA的表达。采用碱性羟胺比色法测定大鼠脑乙酰胆碱酯酶(ACh E)含量。结果:红车轴草素(10 mg/kg、20 mg/kg)可明显改善大鼠学习记忆能力,减轻海马神经元退化和凋亡,提示对Aβ1-42诱导的大鼠认知损伤有明显的改善作用。进一步的机制研究表明红车轴草素可增强PSD-95、p-NMDAR1、p-Ca MKII、p-PKACβ、PKCγ、pCREB和BDNF蛋白的表达;抑制APP、BACE1和Cat B mRNA的表达,但提高NEP和IDE mRNA的水平;降低β淀粉样多肽的含量和沉积;同时,能明显降低脑内胆碱酯酶的活性,增加乙酰胆碱的含量。结论:红车轴草素能改善Aβ1-42诱导的大鼠认知障碍,其作用机制可能与降低脑内Aβ蛋白、增强突触可塑性相关蛋白表达和降低胆碱酯酶的活性有关。