miR-126过表达和ADAM9基因沉默对胃癌SGC-7901细胞生物学行为的影响及其机制

目的:探讨微小RNA-126(miR-126)过表达和解整联蛋白金属蛋白酶9(ADAM9)基因沉默对胃癌细胞生物学行为的影响,并阐明其作用机制。方法:体外培养人胃低分化腺癌SGC-7901细胞和人正常胃黏膜上皮NGEC细胞,提取细胞中总RNA,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2种细胞中miR-126和ADAM9 mRNA表达水平。将处于对数生长期的SGC-7901细胞分为miR-126过表达组(miR-126-OE组)和ADAM9基因沉默组(ADAM9 siRNA组),以LipofectamineTM 2000为载体分别转染miR-126模拟物(miR-126 mimics)和敲低ADAM9的RNA寡核苷酸,并设置相应的阴性对照组。采用噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖活性,细胞划痕实验检测各组细胞迁移率,Transwell小室实验检测各组细胞的迁移细胞数和侵袭细胞数,Western blotting法检测各组细胞中E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白表达水平。TargerScan网站预测miR-126的靶基因并通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-126和ADAM9的靶向调控关系,采用RT-qPCR法和Western blotting法检测转染miR-126 mimics后SGC-7901细胞中ADAM9 mRNA和蛋白表达水平。结果:RT-qPCR法检测,与人正常胃黏膜上皮NGEC细胞比较,胃癌SGC-7901细胞中miR-126表达水平明显降低(P<0.05),而ADAM9mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。MTT法检测,SGC-7901细胞过表达miR-126或沉默ADAM9基因48和72 h后,与相应阴性对照组比较,miR-126 OE组和ADAM9 siRNA组细胞增殖活性均明显降低(P<0.05或P<0.01)。细胞划痕实验检测,与相应阴性对照组比较,48 h后miR-126 OE组和ADAM9 siRNA组细胞迁移率明显降低(P<0.05)。Transwell小室实验检测,与相应阴性对照组比较,miR-126 OE组和ADAM9 siRNA组迁移细胞数和侵袭细胞数明显减少(P<0.05或P<0.01)。Western blotting法检测,与相应阴性对照组比较,miR-126-OE组和ADAM9 siRNA组细胞中E-钙黏蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01),而N-钙黏蛋白和波形蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。靶基因预测,ADAM9的3´-UTR含有与miR-126-3p互补的核苷酸序列。双荧光素酶报告基因实验,ADAM9是miR-126靶向负调控的下游基因。SGC-7901细胞转染miR-126 mimics 48 h后,与mimics NC组比较,miR-126 OE组细胞中ADAM9 mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01)。结论:胃癌SGC-7901细胞中miR-126低表达而ADAM9基因高表达。miR-126过表达可抑制胃癌SGC-7901细胞增殖活性、迁移和侵袭能力,其机制可能与miR-126靶向负调控ADAM9并抑制胃癌细胞的上皮-间质转化(EMT)进程有关。

γδT细胞

一小部分T细胞的受体不是由α和β多肽链构成的“常规”T细胞受体(TCRαβ),而是分别由γ和δ链取而代之(TCRγδ)。TCRγδ能够识别抗原。出现在T细胞个体发生的早期。在机体的某些部位,如小鼠的皮肤和肠道TCRγδ占优势,提示γδT细胞可能在抗感染的第一线起着防御作用γδT细胞能分泌淋巴因子,并具有细胞毒活性。由于MHC的非限制性以及CD_4、CD_8两阴性γδT细胞的发现,表明其激活过程可能与已知的αβT细胞不同。结核杆菌抗原能够优先激活γδT细胞,提示γδT细胞可能有一种特异的功能。γδT细胞的数量在许多疾病中稍有增加,但到目前的研究还未能证实γδT细胞有病原性作用。

抑制c-FLIP_L表达增强rhTRAIL蛋白杀伤肺癌A549细胞的研究

目的:探讨抑制c-FLIPL表达增强rhTRAIL蛋白杀伤肺癌A549细胞株的可行性。方法:构建c-FLIPL序列特异性siRNAs表达载体并转染A549细胞抑制c-FLIPL基因表达,化学抑制剂他莫昔芬抑制c-FLIPL蛋白表达。RT-PCR和Western blot法检测c-FLIPL的mRNA和蛋白表达的变化。Western blot法检测caspase-8的活化情况。流式细胞仪检测A549细胞凋亡率,MTT法检测联合应用RNAi+rhTRAIL和他莫昔芬+rhTRAIL对A549细胞的杀伤活性。结果:特异性siRNA片段能显著降低A549细胞中c-FLIPL的mRNA水平和蛋白水平。他莫昔芬可以显著抑制c-FLIPL蛋白的表达。两者均可以实现caspase-8的活化,并促进rhTRAIL对A549细胞诱导凋亡作用,凋亡率从2.52%提高到64.5%和59.2%(P<0.05),他莫昔芬和siRNA均可显著促进rhTRAIL蛋白对A549细胞的增殖抑制作用,抑制率分别提高到73.2%和69.5%(P<0.05)。结论:靶向抑制FLIP蛋白表达能增加A549细胞对rhTRAIL诱导细胞凋亡的敏感性,有利于促进rhTRAIL蛋白在治疗NSCLC方面的研究应用。

IL-4、IL-6对IFN-γ诱导的小鼠腹腔巨噬细胞抗弓形虫作用的影响

本文以Ｃ５７ＢＬ／６小鼠腹腔巨噬细胞（Ｍｏｕｓｅｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＭＰＭ）为靶细胞，通过３Ｈ－尿嘧啶（３Ｈ－Ｕ）特异性标记的弓形虫在ＭＰＭ内的增殖实验，研究了ＩＬ－４、ＩＬ－６对ＩＦＮ－γ诱导的ＭＰＭ抗弓形虫作用的影响。结果表明，ＩＬ－４能够部分抑制弓形虫在ＭＰＭ内的增殖，且与ＩＦＮ－γ具有相加作用；ＩＬ－６促进弓形虫在ＭＰＭ内的增殖，且可部分逆转ＩＦＮ－γ诱导的ＭＰＭ抗弓形虫作用；抗ＴＮＦ－α抗体能够逆转ＩＦＮ－γ的抗弓形虫作用。

体外培养系统中各细胞组分在IL-18诱导的肿瘤特异性CTL中的作用

应用rhIL 18在体外培养系统 (coculturesysteminvitro ,CCS )中诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxicTlympho cyte ,CTL ) ,探索不同细胞在IL 18起动和促进肿瘤特异性免疫应答方面的作用。采用StemSepTM免疫磁性细胞分离法分离人外周血NK细胞、T细胞及树突细胞 (DC ) ,流式细胞仪分析细胞表型 ,12 5I UdR标记的细胞毒实验检测杀伤活性。结果表明 ,在肿瘤抗原存在的条件下 ,CCS中rhIL 18能够诱导并促进CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应 ;并且 ,在rhIL 18诱导肿瘤特异性CTL的过程中 ,rhIL 18、NK细胞、DC及T细胞均起着十分重要的作用 ,缺少任一组份 ,均对诱导肿瘤特异性CTL有明显差异 (P <0 0 1)。提示在CCS中 ,rhIL 18诱导的NK细胞快速杀伤效应及DC的抗原提呈作用 ,在肿瘤特异性CTL产生过程中 ,均起着决定性的作用。

IL-4、TNF-α及IFN-γ诱导的小鼠腹腔巨噬细胞抗弓形虫中的作用

目的观察IL—4、TNF—α及IFN-γ诱导的MPM在抗弓形虫中的作用。方法采用3H-尿嘧啶（3H-U）特异性标记的弓形虫在小鼠腹腔巨细胞（Mouseperitonealmacrophage，MPM）内的增殖实验。结果与结论单独应用IL—4可部分抑制弓形虫在MPM内的增殖，且IL-4与IFN-γ在诱导MPM抗弓形虫的效应中具有相加作用，杭TNF-α中和抗体对IL—4诱导的弓形虫细胞内增殖抑制作用无影响;TNF—α与IFN-γ在诱导MPM抗弓形虫效应中存在协同作用，且其协同作用随TNF-α剂量的增高而明显增强。

消化性溃疡及胃癌患者外周血IL-2活性水平及其与NK活性的关系

本文观察了40例健康人,28例胃癌,26例球部溃疡,19例胃溃疡及9例胃溃疡伴不典型增生病人的IL—2活性及NK细胞活性。其中胃癌病人IL—2及NK活性最低,与健康对照组比较,P<0.0005;胃溃疡伴不典型增生病人的IL—2活性及NK活性,虽然高于胃癌病人,但却显著低于健康人,统计学有意义。将正常人和病人的PBMC分别用IL—2处理后,观察IL—2对NK细胞的调节作用,IL—2对正常人及病人的NK细胞活性均有促进作用,但未能使NK活性显著低下的胃癌病人的NK活性恢复至正常人水平。

ABC—ELISA在抗胃癌单克隆抗体筛选中的应用

我们利用ABC—ELISA方法检测抗胃癌单克隆抗体,并与常规ELISA方法进行比较。ABC—ELISA方法的敏感性比常规ELISA方法高110～100倍,但非特异性并没有增加。重复5次检测杂交瘤上清液的效价,结果基本一致。本文所有结果表明,ABC—ELISA方法用于筛选和检测抗胃癌单克隆抗体不但灵敏度高,而且特异性和重复性好,是值得作为筛选和检测单克隆抗体的新方法而进行推广。

可溶性Fas表达水平与人黑色素瘤相关性的初步研究

目的:分析可溶性Fas(soluble Fas,sFas)表达水平与人黑色素细胞瘤恶性程度的关系,探讨Fas、Fas配体与可溶性Fas在调控细胞凋亡信号转导途径中的作用。方法:对35位确诊黑色素细胞癌患者的皮肤组织标本和病例进行回顾性分析和归类,用免疫荧光的方法检测组织中Fas/FasL的表达水平。通过酶联免疫吸附反应(ELISA)方法对人血清中sFas的浓度进行分析。结果:35例黑色素细胞癌组织中,病理分型浅表型2例、结节型9例、肢端型18例、雀斑痣型6例。Fas在正常皮肤组织中高表达,恶性黑色素癌组织中低表达;而相反FasL在恶性黑色素癌组织中高表达,在正常皮肤组织中表达非常低。可溶性Fas在不同组织中的表达强度差异显著,sFas在恶性黑色素细胞癌患者、良性黑色素瘤和正常人血清中的浓度分别为(36.32±11.57)ng/ml、(7.33±3.78)ng/ml和(4.18±1.88)ng/ml。结论:可溶性Fas在恶性黑色素癌患者血清中含量较高,与黑色素细胞癌恶性程度呈正相关,sFas对细胞凋亡的竞争性抑制可能与黑色素细胞癌的进展密切相关。

流式细胞术检测细胞毒方法的建立

目的 :建立一种用流式细胞仪测定细胞介导细胞毒活性的方法。方法 :用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记靶细胞 ,再用碘化丙碇 (PI)标记DNA筛选细胞膜已破坏的靶细胞。效靶比为 10 0∶1～ 6 2 5∶1,共孵育时间为 1～ 6小时 ,流式细胞仪收集 10 0 0个靶细胞并测定被杀细胞的百分率。结果 :CFSE是合适的标记靶细胞的荧光染料 ,18小时后也能很好地区分效靶细胞 ;靶细胞的自然死亡率低于 5 % ;杀伤百分率随着效靶比和共孵育时间的增加而增加。最佳效靶比为5 0∶1～ 2 5∶1,共孵育时间为 2～ 4小时。结论 :CFSE PI双荧光染料标记的流式细胞分析检测细胞毒具有多个优点 :避免放射性试剂的应用 ,敏感性增强 ,单细胞水平的分析。

虎眼万年青多糖对小鼠免疫功能的调节作用

目的 :依据虎眼万年青组分中多糖对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 ,筛选并优化出 6 0 %醇浓度中性多糖活性组分S3,进而研究其对体液免疫、细胞免疫及细胞因子变化的影响 ,并从细胞和分子水平探讨其作用的机理。方法 :采用溶血素测定方法 ,测定S3对小鼠脾细胞溶血素抗体的诱导作用 ;采用3H TdR渗入法 ,测定S3对ConA诱导小鼠脾淋巴细胞的增殖作用 ;采用3H TdR后标记法 ,测定S3对NK细胞细胞毒活性的影响 ;以ELISA法测定S3对小鼠脾细胞IL 2产生的影响 ;利用流式细胞术 ,检测S3对T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8、CD4 CD8阳性细胞百分率的影响 ;采用RT PCR方法检测IL 2mRNA的表达水平。结果 :S3高、中剂量组能明显增强小鼠脾细胞溶血素抗体的形成 (P <0 0 5 ) ;各剂量组均能明显增强ConA诱导的淋巴细胞增殖能力 (P <0 0 0 1) ;各剂量组均能增强NK细胞的细胞毒活性并促进IL 2的产生 (P <0 0 0 1,P <0 0 1) ;高、中剂量组CD8阳性细胞百分率明显降低 (P <0 0 0 1) ,各剂量组均能显著地提高CD4 CD8阳性细胞百分率 (P <0 0 0 1) ;高剂量组可明显促进脾细胞中细胞因子IL 2的mRNA表达 ,使表达量增加 (P <0 0 5 )。结论 :S3具有较强的增强机体多种免疫功能的作用 ,可利用开发为一种免疫增强药物。

CA125联合中性粒细胞与淋巴细胞比值对卵巢癌诊断及预后判断的意义

目的:探讨CA125联合中性粒细胞和淋巴细胞比值对卵巢癌诊断及预后判断的临床意义。方法:检测152例卵巢癌患者外周血CA125及血细胞计数,对比CA125水平及中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)与健康体检者及卵巢良性疾病患者间的差异,评估二者及二者联合(联合标志物)在诊断卵巢癌方面的敏感性和特异性,并分析检测指标与卵巢癌患者临床特征的相关性。结果:卵巢癌患者的CA125水平及NLR值明显升高,与对照组及良性肿瘤组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05);在敏感性上CA125最为显著,但在特异性上NLR及联合标记物要比CA125高;联合标志物与疾病的疗效及预后密切相关(r=0.683,P<0.01)。结论:CA125联合中性粒细胞和淋巴细胞比值测定是卵巢癌诊断的敏感指标,且具有更高的特异性,在对卵巢癌的诊断、病情评估及预后判断方面具有指导意义。

浆细胞性乳腺炎患者外周血CD4^+CD25^+CD127^-调节性T细胞变化

目的:观察浆细胞性乳腺炎(Plasma cell mastitis,PCM)患者外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞(CD4+CD25+CD127-Treg)数量和功能变化,以探讨PCM免疫病理机制。方法:将58例浆细胞乳腺炎患者分成三组:其中急性组13例(22%)、亚急性组25例(43%)和慢性组20例(34%)。并设正常对照组20例及乳腺癌对照组16例。以流式细胞术检测各型PCM患者外周血中CD4+CD25+CD127-Treg细胞百分率;实时荧光定量RT-PCR检测转录因子Foxp3表达及ELISA检测TGF-β水平。结果:三组PCM组与正常组相比,外周血CD4+CD25+CD127-Treg数量,外周血PBMC中Foxp3表达及血浆TGF-β水平均下降(P<0.05),其中急性PCM组下降最为明显(P<0.01),乳腺癌组三项指标均升高(P<0.05)。结论:浆细胞性乳腺炎患者的CD4+CD25+CD127-Treg数量及功能有所下降。

高同型半胱氨酸血症致动脉粥样硬化的实验研究

目的通过大鼠灌胃给予蛋氨酸复制高同型半胱氨酸血症（HHcy）动物模型，观察HHcy大鼠动脉粥样硬化（As）的病理改变及与氧化应激的关系。方法Wistar雄性大鼠，体重120～150g，实验组每天灌胃给予蛋氨酸0．75g／ks，2次／d；叶酸、维生素B12（VB12）干预组每天灌胃给予蛋氨酸0．75g／kg，2次／d＋叶酸2．5mg／kg＋VB1210μg／kg；对照组每天给予等容积生理盐水，连续给药10w，处死动物取血及胸主动脉。在平左心耳下缘水平取胸主动脉冰冻切片，HE染色，光镜下（X100）照相，测量动脉平滑肌相对厚度（mm），除以体重计算出每100g体重动脉平滑肌厚度指数（SMTI）。检测血浆同型半胱氨酸（Hcy）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，组间比较t检验。结果实验组大鼠灌胃给予蛋氨酸可诱发HHcy（与对照组比较P〈0．01），血浆MDA含量生高（与对照组比较，P〈0．01），GSH-Px、SOD活性降低（与对照组比较，P〈0.01），SMTI（与对照组比较，P〈0．01）。叶酸、VB12干预可降低SMTI（与实验组比较，P〈0．01），血浆Hcy浓度下降（与实验组比较，P〈0．01），MDA降低（与实验组比较，P〈0．01），GSH-Px、SOD活性升高（与实验组比较，P〈0．01）。结论高蛋氨酸可诱发HHcy，通过导致动脉平滑肌增生及过氧化状态致AS。叶酸、VB12对HHcy诱发的AS具有拮抗作用，并改善其引起的高过氧化状态。

膜联蛋白A2与肿瘤进展的相关性

膜联蛋白A2（ANXA2）是众所周知的钙离子依赖性磷脂结合蛋白,广泛分布于各种真核细胞的胞核、胞质及细胞外膜。它作为功能多样的蛋白质影响多种细胞和分子功能活动。ANXA2的表达或调节失常涉及一系列疾病,包括自身免疫性疾病、神经系统退行性变、抗磷脂抗体综合征、炎症、糖尿病及各种肿瘤。

虎眼万年青多糖对小鼠T细胞及其细胞因子IL-2 mRNA表达的影响

目的 :探讨天然产物虎眼万年青多糖 (S3)对 T细胞及其细胞因子 IL - 2 m RNA表达的影响 ,进一步从细胞和分子水平探讨其免疫调节作用机制 ,为开发这一天然产物提供理论依据。方法 :利用流式细胞术 ,检测S3对 T淋巴细胞亚群 CD3、 CD4、 CD8、 CD4 / CD8阳性细胞百分率的影响 ,并采用 RT- PCR方法检测 IL - 2 m RNA的表达水平。结果 :各剂量组 CD3、CD4阳性细胞百分率均有上升趋势 ,极高剂量组 CD3、CD4与对照组比较差异有显著性 (P<0 .0 0 1) ,CD8有下降趋势 ,各剂量组均能显著提高 CD4 / CD8阳性细胞百分率 (P<0 .0 0 1) ;极高剂量组和高剂量组可明显促进脾细胞中细胞因子 IL- 2的 m RNA表达 ,使表达量增加 (P<0 .0 1,P<0 .0 5 )。结论 :S3具有较强的增强机体多种免疫功能的作用。

Ki-67、P53、LAT1在食管癌及癌前病变组织中的表达及其临床意义

目的:观察Ki-67、P53、LAT1在食管鳞癌及癌前病变组织中的表达情况并探讨其临床意义。方法:采用免疫组织化学方法检测食管正常黏膜组织20例、癌前病变组织68例(轻度非典型增生21例,中度非典型增生22例,重度非典型增生25例)以及癌组织34例中Ki-67、P53及LAT1的阳性表达情况,分析三者在食管癌组织中表达的相关性。结果:食管正常黏膜组织、轻度非典型增生、中度非典型增生、重度非典型增生以及癌组织中,Ki-67阳性表达率分别为0%(0/20)、23.8%(5/21)、40.9%(9/22)、76.0%(19/25)、82.4%(28/34),P53阳性表达率分别为0%(0/20)、14.3%(3/21)、31.8%(7/22)、48.0%(12/25)、67.6%(23/34),LAT1阳性表达率分别为0%(0/20)、19.0%(4/21)、36.4%(8/22)、52.0%(13/25)、76.5%(26/34)。等级相关分析结果显示,Ki-67、P53、LAT1的阳性表达均与组织学分级显著相关(r=0.626,0.427,0.586,P<0.01);Ki-67与P53、LAT1在食管癌组织中的表达呈正相关(r=0.428,0.596,P<0.01)。结论:Ki-67、P53、LAT1蛋白的异常表达与食管癌的癌变过程显著相关,三者联合检测具有重要的临床意义。

HIF-1α与VEGF在动脉粥样硬化闭塞症患者缺血下肢血管及肌组织中的表达及意义

目的:研究缺氧诱导因子1(HIF-1α)及血管内皮生长因子(VEGF)在动脉粥样硬化闭塞症(ASO)患者缺血下肢的表达及分布规律,为应用HIF-1α基因治疗缺血性疾病提供实验依据。方法:应用免疫组织化学SP法对15例ASO截肢患者肢体的血管、肌组织及3例正常人肌组织中的HIF-1α、VEGF蛋白进行检测;同时应用CD34标记血管,根据CD34阳性的血管内皮细胞数测定微血管密度(MVD)。结果:ASO患者缺血肢体主干血管及缺血肌组织内HIF-1α、VEGF表达灰度值较正常人均明显增加,MVD计数增加。增加最高的是胫后动脉(HIF-1α为932.5±545.2,VEGF为354.5±75.8,MVD为38.4±8.4),股浅动脉、胫前动脉、小腿缺血肌肌间动脉、小腿缺血肌以及足坏死肌中HIF-1α和VEGF表达量均明显低于胫后动脉;在缺血血管壁内,HIF-1α、VEGF表达量及MVD计数均随着缺血程度的加重而增加;而在缺血肌组织内,HIF-1α、VEGF表达量及MVD计数增加均与缺血程度无关联;HIF-1α、VEGF在缺血肌组织内的表达量均明显低于缺血大血管。结论:HIF-1α、VEGF在ASO患者缺血肢体主干血管和缺血肌组织中均有较高水平表达,但在缺血肌组织内的表达均明显低于缺血大血管。

养血清脑颗粒对血管性痴呆大鼠海马神经元的保护作用

目的研究慢性脑缺血致血管性痴呆大鼠海马区局部脑血流量(rCBF)改变及细胞凋亡情况,探讨养血清脑颗粒对血管性痴呆大鼠海马神经细胞的保护机制。方法将36只成年雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型对照组、养血清脑颗粒组,每组12只。采用双侧颈总动脉缺血再灌注法制作血管性痴呆大鼠模型。养血清脑颗粒组术前10 d及术后每天用养血清脑颗粒灌胃4.8 g/kg,共灌胃45 d。Morris水迷宫实验检测大鼠的空间学习以及记忆能力,HE染色法观察大鼠海马CA1区病理组织形态学变化,免疫组织化学法检测大鼠海马区的caspase-3阳性神经元细胞,蛋白印迹检测大鼠海马区凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达含量的变化。激光多普勒血流仪测量大鼠海马脑血流变化。结果 Morris水迷宫检测结果表明,养血清脑颗粒组平均潜伏期明显低于模型对照组(P<0.05)。大鼠脑组织HE染色结果表明,养血清脑颗粒能够改善海马CA1区神经元形态异常。免疫组化染色发现,养血清脑颗粒组大鼠神经细胞caspase-3表达明显低于模型对照组(P<0.05)。养血清脑颗粒能够提高细胞中Bcl-2蛋白表达量,降低Bax蛋白表达(P<0.05),养血清脑颗粒能明显增加大鼠脑血流量(P<0.05)。结论养血清脑颗粒能够增加实验大鼠海马局部脑血流量,抑制海马神经细胞凋亡。