β4整合素结合蛋白调控成纤维细胞胞外基质生成的实验研究

目的探讨β4整合素结合蛋白(ITGB4BP)对成纤维细胞胞外基质生成的调控作用。方法分别构建、包装能在哺乳动物细胞中促进和抑制ITGB4BP表达的腺病毒表达载体pAdEasy-ITGB4BP-EGFP和慢病毒表达载体Lentivirus-FIV-H1/U6-copGFP-ITGB4BP-RNAi,经筛选鉴定有效后,分别感染人正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕(HTS)成纤维细胞,利用ELISA检测细胞培养上清内基质金属蛋白酶(MMP-9)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)的表达情况。结果正常皮肤成纤维细胞内IT-GB4BP高表达后,引起MMP-9、TGF-β1和collagenⅠ表达降低;反之HTS成纤维细胞内ITGB4BP表达抑制后,MMP-9、TGF-β1和collagenⅠ表达增高。结论ITGB7BP对MMP-9、TGF-β1和collagenⅠ表达具有重要调节功能。提示ITGB4BP可能具有抗纤维化的重要功能,为下一步深入探讨HTS的形成机制提供了重要依据。

人重组蛋白P311的原核表达纯化与鉴定

目的原核表达人增生性瘢痕新候选相关蛋白P311,并对该重组蛋白进行纯化、鉴定。方法通过PCR方法扩增人P311基因,利用BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点将其克隆至谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-s-transferase,GST)融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用SDS-PAGE、Western blotting等方法鉴定表达产物,并用谷胱甘肽-琼脂糖小珠亲和纯化表达的GST-P311蛋白。结果重组载体pGEX-4T-P311经酶切与测序鉴定证实构建成功。导入大肠杆菌进行表达,表达产物相对分子量为34KD左右,与预期值相符。该条带经免疫印迹检测鉴定为GST抗体阳性,获得了纯化的GST-P311蛋白。结论构建了pGEX-4T-P311原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究P311的生物学功能奠定了基础。

肾移植急性排斥反应早期诊断尿液蛋白质组学研究

目的利用二维凝胶电泳和生物信息学技术,从严格筛选的2例肾移植术后发生急性排斥反应患者尿液标本中,寻找急性排斥反应早期标志物。方法在pH值为4～7范围,采用Sypro-Ruby染色,对发生急性排斥反应过程的不同时间点(-3,-2,-1,7,14,21d)的患者尿液二维凝胶电泳(Two-dimensional Gel Electrophoresis,2-DE)图谱进行比较,挑选了30个有上调或者下调趋势的蛋白点。将这些蛋白点进行切胶、胰酶消化后用MALDI-TOF-MS/MS分析。结果得到了重复性好、分辨率高的肾移植术后尿蛋白2-DE图谱。30个差异蛋白点经质谱分析和数据库检索,鉴定了16个蛋白点,对应13种蛋白质。根据蛋白功能查询结果,发现了3个蛋白含量变化趋势与排斥反应密切相关的蛋白,分别是α-1抗胰凝乳蛋白酶(alpha-1-antichymotrypsin,AACT)、肿瘤排斥抗原gp96(tumor rejection antigen gp96)和锌-α2糖蛋白(Zn-Al-pha-2-Glycoprotein)。结论肾移植术后发生急性排斥反应患者的不同时间点尿液2-DE图谱存在明显差异。AACT、肿瘤排斥抗原gp96和锌-α2糖蛋白可能作为临床诊断肾移植术后急性排斥反应的标志物候选蛋白。

荧光共振能量转移技术检测ITGB4BP与P311间的相互作用

目的利用激光共聚焦显微镜中的荧光共振能量转移(FRET)技术来验证整合素4结合蛋白(ITGB4BP)和P311间的相互作用。方法分别构建能在哺乳动物细胞中表达ITGB4BP的绿色荧光融合蛋白ITGB4BP-EGFP和表达P311的红色荧光融合蛋白P311-DsRed的重组载体pITGB4BP-EGFP和pP311-DsRed,经酶切与测序鉴定正确后,共转染人胚肾293(HEK293)细胞48h后,采用受体漂白方法(P311-DsRed),检测ITGB4BP和P311间的能量转移率(E)和相互间的作用距离(R)。结果重组载体pITGB4BP-EGFP和pP311-DsRed经双酶切鉴定正确,转染293细胞后经激光共聚焦显微镜观察能分别表达融合蛋白ITGB4BP-EGFP和P311-DsRed,在细胞质和细胞核中存在着共定位,FRET检测结果显示其能量转移率为14%,两个分子间的作用距离为6.3nm。结论成功构建了ITGB4BP-EGFP和P311-DsRed融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中进行了表达后,利用FRET技术证实了活体细胞内ITGB4BP和P311间存在着相互作用。

HT036是纤维化相关基因P311的相互作用蛋白

目的利用激光共聚焦显微镜观察未知蛋白(HT036)与纤维化相关蛋白(P311)的细胞内表达与共定位。方法构建带绿色荧光的HT036真核表达载体,经鉴定正确后,与前期构建带红色荧光的P311真核表达载体共转染人胚肾上皮细胞株(HEK293),同时共转染空载体做对照,激光共聚焦显微镜下观察蛋白在细胞内表达、分布和共定位。结果HT036真核表达载体经聚合酶链反应(PCR)、双酶切和测序鉴定正确,与P311共转染HEK293细胞后,激光共聚焦显微镜观察到绿色和红色荧光表达。HT036和P311主要分布在细胞胞浆,两者在HEK293细胞中存在共定位,而对照组则无该现象。结论通过酵母双杂交筛选出的P311相互作用蛋白HT036,在活体细胞内存在空间上的共定位,进一步证明它们之间的相互作用,为探讨P311纤维化机制提供新的切入点。

肾移植术后尿蛋白二维电泳图谱的建立

目的近年来诊断急性排斥反应的发生,一直朝着寻找非侵入性的检测方向努力,尿液中的蛋白可以为肾脏疾病病理变化提供线索。本次实验的目的旨在建立肾移植术后病人尿蛋白二维电泳图谱。方法利用二维凝胶电泳(Two-dimensional Gel Electrophoresis,2-DE)技术,以固相pH梯度等电聚焦为第一向,改良等电聚焦的电压在3500V,总伏小时为14000 Vh;12%的SDS-PAGE进行第二向电泳,银染显色。结果得到了令人满意的肾移植术后发生急性排斥反应患者尿蛋白二维电泳图。结论此方法,可为后续利用蛋白质组技术,研究急性排斥反应诊断标志物提供可靠的技术支持。

真核起始因子6抑制小鼠肾间质纤维化的组织学研究

目的通过建立小鼠单侧输尿管结扎(UUO)模型,探讨真核起始因子6(eIF6)在肾间质纤维化中的作用。方法建立eIF6+/-和eIF6+/+小鼠UUO模型;用HE和Masson染色观测小鼠肾间质胶原沉积程度,免疫组化方法观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)的表达与分布变化,并进行图像定量分析。结果 UUO模型eIF6+/-小鼠在建模后10d出现比eIF6+/+小鼠更明显的肾纤维化;在UUO模型中,eIF6+/-小鼠的肾小管区比eIF6+/+小鼠的肾小管区表达更多的TGF-β1和α-SMA。结论 eIF6可能通过影响TGF-β1的表达参与调控肾间质纤维化。

ITGB4BP对Wnt/β-catenin信号通路活性的下调作用

目的探讨β4整合素结合蛋白ITGB4BP对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法将对照组空载体pCMV-3B质粒和实验组pCMV-ITGB4BP质粒分别转染至HEK293细胞中,用Western blot和激光共聚焦技术检测细胞中β-catenin含量的变化,用含TCF/LEF启动子的荧光素酶TOPFlash质粒和内参pRL-TK质粒共转染对照组和实验组的HEK293细胞,用荧光素酶活性分析法检测ITGB4BP转染后HEK293细胞TCF/LEF活性的变化。设不转染质粒组为正常组,对照组和实验组均分别设未加LiCl组和加LiCl组。结果 Western blot检测结果:与正常组或对照组比较,实验组细胞β-catenin表达显著减少(P<0.05)。加LiCl之后,β-catenin的表达显著增强(P<0.05),与未加有LiCl的正常组或对照组比较,加LiCl的实验组细胞内β-catenin仍有较高的表达,但差异无显著性。激光共聚焦技术观察:实验组β-catenin(绿色荧光)表达较对照组降低。加LiCl之后,β-catenin(绿色荧光)表达增强,与未加LiCl的对照组相比,加LiCl的实验组仍有较强的荧光强度。荧光素酶活性分析法检测:实验组的荧光素酶活性较对照组显著降低(P<0.05)。LiCl作用之后,Wnt/β-catenin信号通路活性明显增强(P<0.05),与未加LiCl的对照组相比,加LiCl的实验组仍有较强的荧光素酶活性(P<0.05)。结论ITGB4BP可以下调Wnt/β-catenin信号通路的活性。

氯代多氟烷基醚磺酸盐环境污染及治理研究进展

氯代多氟烷基醚磺酸盐(chlorinated polyfluorinated ether sulfonates,Cl-PFESA)在中国作为全氟辛烷磺酸盐(perfluorooctane sulfonate,PFOS)替代物,被广泛应用于电镀工业中,Cl-PFESA是目前最具生物持久性的全氟和多氟化合物(per-and polyfluoro-alkyl substances,PFASs),潜在毒性与PFOS相当甚至高于许多传统PFASs。其在各环境、动物及人体中已被频繁检出,是水环境、生物体甚至人体中PFASs的主要贡献者。本文总结了Cl-PFESA在各种环境介质、生物体及人体中的赋存情况,分析了吸附法、还原法、机械化学法和电化学法等处理技术对Cl-PFESA的降解效果,并对Cl-PFESA环境行为研究和人类健康风险评估提出展望,以期为Cl-PFESA的生态风险评估和污染治理研究提供理论参考。

3D打印的多聚甲醛硅氧烷仿生纳米银复合材料及性能研究

目的制备一种硅油灌注的多聚甲醛硅氧烷仿生纳米银复合材料(iPDMS/AgNPs),通过3D打印技术设计出能够满足不同伤口需求的材料。方法通过扫描电镜和能谱对制备的iPDMS/AgNPs材料进行形态学观察,CCK-8法检测其细胞毒性,并采用两种临床上常用的标准耐药菌(金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌)探索其抗黏附和抑菌特性。构建小鼠全层皮肤感染创面模型,观察iPDMS/AgNPs对创面愈合率、新生上皮长度和肉芽组织厚度的影响。结果扫描电镜和能谱观察证实了纳米银的存在,表明成功制备了iPDMS/AgNPs纳米银复合材料。CCK-8法检测结果显示,制备的iPDMS/AgNPs对成纤维细胞无明显毒性。抗黏附和抑菌实验显示,iPDMS/AgNPs膜片可有效抵抗金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的黏附并抑制其生长(P<0.05)。小鼠感染创面模型研究显示,制备的复合材料膜片可明显提高创面愈合率,增加再生上皮长度和肉芽组织厚度(P<0.05)。结论制备的iPDMS/AgNPs具有良好的生物相容性、抗黏附特性及抑菌活性,并能在体内有效促进上皮再生和肉芽组织生长,从而加速创面愈合,有望成为一种理想的伤口敷料。

烧伤患者气管切开置管全国专家共识(2018版)

大面积烧伤、头面颈部深度烧伤、吸入性损伤等易出现气道水肿、狭窄、梗阻甚至窒息,危及生命,及时行气管切开置管是重要的救治措施,而部分医院存在认识不足与处理不当,导致患者气道梗阻发生。经皮穿刺气管切开置管技术为危重症烧伤急救与成批烧伤的救治提供了便利,中国老年医学学会烧创伤分会组织国内部分专家,就烧伤患者气管切开置管的指征、时机、方法、拔管及注意事项进行讨论,撰写了《烧伤患者气管切开置管全国专家共识(2018版)》,为临床治疗提供参考标准。

给排水科学与工程专业创新创业人才培养探索构建——以重庆三峡学院为例

人才培养方案是确保教学质量的重要依据,对提升人才的专业能力和综合素质具有积极作用。本文通过分析重庆三峡学院给排水科学与工程专业对接产业创新创业人才培养方案的构建进行了初步探讨和分析,构建适合于应用型本科院校人才特点的课程体系和结构。

中国烧伤康复治疗现状

我国烧伤创面的治疗有着悠久的历史，但直到1958年才成立第1个专门的烧伤治疗单位。在过去50多年里，我国烧伤治疗水平取得很大进展，尤其表现在重度烧伤患者的存活率上，在一些烧伤中心可达98．9％。

P311在小鼠浅Ⅱ度烧伤及体外细胞创伤模型中对表皮干细胞迁移的影响

目的观察P311在小鼠浅Ⅱ发烧伤技体外细胞创伤模型中对表皮干细胞（ESC）辽移的作用并探讨其机制。方法（1）取18只C57BL／6小鼠，其中15只行背部浅Ⅱ度烧伤，于伤后6、12、24、48、72h取创面及创周皮肤组织，各时相点3只；余下3只小鼠作为正常对照，同法取止常皮肤标本。采用生物素-链霉亲和素-过氧化物酶（SP）染色法观察P311在上述皮肤组织中的表达。（2）取6只新生的C57BL／6小鼠，连续3d腹腔注射50μg／g溴脱氧尿苷（BrdU，2次／（1）建立ESC示踪模型。7周后于其背部制作浅Ⅱ度烧伤创面。伤后72h取创面皮肤组织制作连续切片，SP法免疫组织化学染色，观察P311阳性和BrdU阳性细胞空间共定位情况。（3）构建腺病毒空载体pAdEasy-增强型绿色荧光蛋h（EGFP）及P311腺病毒表达载体pAdEasy-EGFP-P311，并进行包装。应用Ⅳ型胶原快速黏附法分离培养人ESC,按照随机数字表法将其分为P311高表达组和EGFP对照组，每组3孔，分别以pAdEasy-EGFP-P311及pAdEasy-EGFP腺病毒感染ESC。2组ESC经丝裂毒素C处理2h后行划痕实验。划痕后0（即刻）、24、48、72h测量地固定范围内划痕剩余面积，计算划痕愈合面积百分比。对数据进行独立样本t检验。结果（1）浅Ⅱ度烧伤后不同时相点，P311在创面不同部位的表达量各不相同。伤后创面毛囊、新生表皮巾P311表达量随时间延长逐渐上升；创用表皮及毛囊的P311表达量于伤后12h达高峰，72h回落至正常。（2）应用BrdU标记的小鼠浅Ⅱ度烧伤创Ⅲ新生表皮层可见P311阳性细胞和BrdU阳性细胞共定位。（3）划痕后48、72h，P311高表达组ESC划痕愈合面积百分比分别为（69±31）％、（89±26）％，明显高于EGFP刘照组[（35±12）％、（46±31）％，t值分别为-2．336、-2，611，P值均小于0．05]。结论P311可明显促进小鼠浅Ⅱ度烧伤创面及体外细胞创伤模型中的ESC迁移，可能在创面修复中起重要作用。

烧伤创面治疗策略

创面修复是烧伤治疗的根本问题，它贯穿于整个救治过程，是烧伤领域最富挑战性、最重要和最基础的课题之一。每年我国烧伤发生率约占总人口的0．5％～1．0％，即每年600万～1200万例，大面积烧伤的致残率达48％，其中青壮年致残率约为78．1％。

一氧化氮对体外培养人表皮干细胞生物学行为的影响

目的观察外源性NO对人表皮干细胞（ESC）脱黏附、增殖以及迁移功能的影响。方法采用改良Ⅳ型胶原快速黏附法分离、培养人ESC，倒置相差显微镜下观察其形态；蛋白质印迹法和免疫荧光法观察ESC标志物整合素p，和细胞角蛋H 19（ CK19）的表达。对贴壁生长的ESC行划痕处理，用O（对照）、1、10、100、500 μmolL NO供体S-亚硝基-N-乙酰-DL-青霉胺（SNAP）作用细胞12、24 h，检测细胞迁移率；Transwe11实验检测SNAP（浓度同上）对ESC趋化能力的影响（计数转膜细胞）。采用0、10、100、500 μmolL SNAP作用细胞1 h，黏附实验检测SNAP对ESC黏附功能的影响，计算黏附抑制率；于上述4种浓度SNAP作用O（即刻）、12、24、48 h，采用酶标仪检测ESC增殖水平， 数据以吸光度值表示。对数据进行单凶素方差分析和Dunnett z检验。 结果 （1）倒置相差显微镜下可见，细胞培养5-9 d形成小克隆；培养10 -14 d，细胞增殖明显加快。蛋白质印迹法和免疫荧光法检测结果显示，所分离的细胞均能表达CK19和整合素p．。由此鉴定该细胞为ESC。（2）与O μmolL SNAP怍用12、24 h后细胞迁移率[（35.7±0.3）%、（45.7 ＋5.0）%]比较，1-100 μmolLSNAP均能促进ESC迁移，其中100 μmolL SNAP作用后细胞迁移率达峰值[（48.8±2.7）%、（82.1±15.8）%，P值分别为8. 34、5.10，P值均小于0.01]。100 y,mo1/L SNAP作用后转膜细胞数显著多于O μmolL SNAP作用后（t=9. 24，P=0.00）。100、500 μmolL SNAP作用后，ESC黏附能力明显低于OμmolL SNAP作用后（t值分别为4.30、4.67，P值均为0.00）。100、500 μmolL SNAP作用24、48 h，细胞增殖能力明显强于OμmolL SNAP作用后（t值为2.84-8.17，P值均小于0.05）。 结论适宜浓度的外源性NO对体外培养人ESC的迁移功能有促进作用。外源性NO对体外培养人ESC具有脱黏附、促增殖作用。

Jurkat T细胞质膜蛋白组学研究初探

目的:分析Jurkat T细胞质膜蛋白质组成,并对这些质膜蛋白的生理学过程和功能进行初步分析,为进一步研究Jurkat T细胞膜蛋白功能奠定基础。方法:首先采用差异密度梯度离心法提取Jurkat T细胞膜蛋白,然后将提取出的膜蛋白根据分子量大小通过SDS-PAGE进行初步分离,再进一步将分离出的蛋白条带切下进行胶内酶解,酶解后的肽段通过液相-芯片-离子阱质谱技术进行鉴定和生物信息学分析,建立Jurkat T细胞质膜蛋白全谱图,并进一步通过GO(Gene Ontology)对这些质膜蛋白进行功能分析。结果:成功提取了Jurkat T细胞的膜总蛋白,并建立了Jurkat T细胞质膜蛋白全谱图,共鉴定出618个质膜蛋白,经GO注释分析,其中与结合功能相关的质膜蛋白有493个,与信号转导活性相关的有186个,具有酶催化活性的有166个,具有转运活性的有137个,有些还具有酶调节活性、结构分子活性或者运动活性等,功能尚不清楚的有49个。结论:通过差异密度梯度离心,结合一维SDS-PAGE和HPLC-CHIP-MS/MS,成功建立了Jurkat T细胞质膜蛋白全谱图,并通过GO注释,初步分析了这些蛋白的功能和生理学过程,为进一步研究Jurkat T细胞质膜蛋白的功能奠定了基础。

重视烧伤康复评定

随着烧伤康复治疗的蓬勃发展,国内众多烧伤单位越来越重视烧伤康复治疗手段在烧伤患者中的应用,但是在烧伤康复治疗过程中不能忽视烧伤康复评定的开展。烧伤康复评定具有评定时间跨度大和评定内容多且复杂的特点,这造成不能制订符合所有烧伤患者的标准化评定表。并且,国内部分单位存在的烧伤康复评定专业人才短缺、客观化的评估仪器数量偏少以及各种制度限制等因素,也导致烧伤康复评定存在开展动力不足、评定质量较低的问题。基于此,该文主要分析了我国烧伤康复评定的特点和主要内容,并针对国内烧伤康复评定的不足提出部分改进意见,以期为烧伤康复从业人员提供参考。

胎猪皮肤前体组织异种移植研究

目的系统筛选猪胚胎皮肤前体组织异种移植的最佳妊娠时间窗，了解其创面修复能力。方法取胎龄35、42、56、70d的胎猪皮肤前体组织，制成微粒后移植于BABL／c裸鼠背部创面，以整形患者术后剩余皮肤或者成年猪皮覆盖。观察术后移植物生长发育特性，并于移植后6、12周取材，用组织学方法观察其形态结构及成瘤性。结果胎猪皮肤前体组织移植后具有如下特点：（1）能成活并继续生长发育，微粒可融合成片；胎龄35、42、56、70d的前体组织移植后12周，新生组织面积分别为（18±8）、（47±6）、（31±12）、（20±8）mm^2，其中胎龄42d的组织与其余三者比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。（2）新生（猪）皮肤组织具有表皮层和真皮层，真皮乳头明显。（3）能生长成为具有毛发、皮脂腺及汗腺等皮肤附属器的“完整”皮肤，且表皮层有黑素细胞。（4）胎龄56、70d的胎猪皮肤前体组织移植后未出现畸胎瘤。结论胎龄56d的胎猪皮肤前体组织可用于异种移植修复皮肤创面。

树突状表皮T淋巴细胞在小鼠皮肤移植免疫排斥反应中的作用及机制

目的探讨树突状表皮T淋巴细胞（DETC）在小鼠皮肤移植免疫排斥反应中的作用及其相天机制。方法（1）取1只野生型C57BL／6雄性小鼠背部全层皮肤，分离表皮细胞，流式细胞仪检测DETC表达情况及细胞表型。另取1只野生型C57BL／6雄性小鼠背部全层皮肤，分离表皮，免疫荧光技术观察DETC形态学特征。（2）分别取4只绿色荧光蛋白（GFP）标记C57BL／6雄性小鼠、7只野生型C57BL／6雌性小鼠（野生型组）以及7只γδ8T淋巴细胞6基因敲除C57BL／6雌性小鼠（基因敲除组）。剪去野生型组与基因敲除组小鼠背部1．4cm×1．4cm大小全层皮肤，移植GFP标记C57BL／6雄悱小鼠背部1．2cm×1．2cm大小全层皮肤，通过小动物活体成像仪及肉眼观察，判定并记录移植皮片存活时间。（3）取2只野生型C57BL／6雄性小鼠，分离表皮细胞，加入48孔板，按随机数字表法分为激活组和对照组，每组4孔。激活组加入2g／mL刀豆蛋白A10μL，对照组加入等量PBS，处理24h后用流式细胞仪枪测DETC表达γ干扰素情况。（4）取4只GFP标记C57BL／6雄性小鼠（供体）；取14只野生型C57BL／6雌性小鼠（受体），按随机数字表法分为γ干扰素中和组和对照组，每组7只。按（2）中方法构建皮肤移植模型，术前和术后72h，γ干扰素中和组小鼠腹腔注射1mg／mLγ干扰素中和抗体200μL，对照组注射等量生理盐水，同（2）中方法观察并记录移植皮片存活时间，并将γ干扰素中和组与（2）中基因敲除组移植皮片存活时间进行比较。对皮片生存曲线进行Log-rank（Mantel-Cox）检验。结果（1）小鼠皮肤表皮细胞内DETC阳性表达率为7．27％，且DETC均为CD3^＋表型细胞。DETC呈树突状散在分布于小鼠皮肤表皮中。（2）基因敲除组小鼠移植皮片存活时间为22～35d，较野生型组的12～16d明显延长（χ^2=14．10，P〈0．001），（3）激活组DETC的γ干扰素表达率为22．70％，明显高于对照组的0．51％。（4）γ干扰素中和组小鼠移植皮片存活时间为19～24d，较对照组的12～16d明显延长（χ^2=13．60，P〈0．001），但与（2）中基因敲除组小鼠移植皮片存活时间相近（χ^2=0．06，P=0．810）。结论DETC存C57BL／6小鼠皮肤移植免疫排斥反应中起促进作用，该作用可能是通过其分泌γ干扰素实现的。