小鼠仙台病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备小鼠仙台病毒(Sendai virus,SeV)HN蛋白单克隆抗体,试验采用SeV参考毒株HN基因(GenBank登录号为NC_001552.1)对编码HN蛋白的基因密码子优化后克隆重组至原核表达载体pGEX-6P-1上获得重组质粒pGEX-6P-1-HN,将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达,并对纯化的重组蛋白rHN进行SDS-PAGE分析。用重组蛋白rHN免疫Balb/c小鼠6次,取其脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过亚克隆技术和间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,然后注入小鼠腹腔制备抗HN蛋白单克隆抗体,分析单克隆抗体的免疫活性、特异性和稳定性。结果表明:获得3株分泌抗SeV HN蛋白抗体的杂交瘤细胞2F9、5D8、10H2,分泌的抗体效价均为1∶16 000左右。3株单克隆抗体的亚型均为IgG1,均可特异性识别SeV,并不与其他小鼠病毒产生交叉反应,具有良好的特异性。经过10次传代,3株单克隆抗体的效价均在1∶8 000以上,稳定性较好。说明试验成功制备了具备良好免疫活性、特异性和稳定性的抗SeV HN蛋白单克隆抗体,可以为SeV的检测提供有效试剂。

杆状病毒表达系统中NLS序列对鸭圆环病毒Cap基因表达的影响及其免疫原性研究

为了研究核定位信号肽(Nuclear localization signal,NLS)序列对鸭圆环病毒(duck Circovirus,DuCV)Cap蛋白表达的影响,并探究不同免疫策略下重组蛋白的免疫原性,试验将去除和未去除NLS序列的DuCV Cap基因分别克隆至杆状病毒载体pFastBacⅠ中,通过杆状病毒表达系统进行表达,分析NLS序列对Cap蛋白表达的影响。采用不同的免疫策略,分别以原核表达系统构建的重组蛋白rCap(rCap组)、杆状病毒表达系统构建的rvAc-Cap(rvAc-Cap组)及rCap与rvAc-Cap联合(Prime-Boost组)作为免疫源免疫Balb/c小鼠,并设置PBS对照组,定期采血,检测DuCV IgG抗体水平、淋巴细胞增殖指数(SI)和γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)等细胞因子水平,评价其免疫效果。结果表明:利用杆状病毒表达系统成功表达出重组杆状病毒rvAc-Cap和rvAc-NLS-Cap,且去除NLS序列的Cap基因表达水平更高;小鼠免疫重组蛋白rCap后,重组蛋白rCap与重组杆状病毒rvAc-Cap均能够刺激小鼠产生特异性IgG抗体,三免后Prime-Boost组的IgG抗体水平最高,而与其他免疫组差异不显著(P>0.05);三免后各免疫组淋巴细胞增殖指数显著高于PBS对照组,差异显著(P<0.05);各免疫组IFN-γ、IL-2和IL-4水平与PBS对照组比较差异显著(P<0.05),且Prime-Boost组水平最高。说明在杆状病毒表达系统中去除NLS序列可以提高Cap基因的表达;重组杆状病毒rvAc-Cap能够活化小鼠的免疫系统,刺激小鼠机体产生体液免疫与细胞免疫,而Prime-Boost免疫策略有效提高了免疫效果。

H5亚型禽流感病毒HA基因在重组杆状病毒中的表达及检测

利用杆状病毒表达系统对H 5亚型禽流感病毒HA基因在sf9细胞中的表达进行了研究。首先将pUCm-T-H 5HA质粒用B amHⅠ及N otⅠ酶切,获得HA基因片段,同时杆状病毒转座载体质粒pF astB acⅠ也用B amHⅠ及N otⅠ酶切,然后用T4DNA连接酶连接,构建了重组质粒pF astB ac-H 5HA。再将该重组质粒转化DH 10 B ac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒B acm id-H 5HA。将B acm id-H 5HA转染sf9细胞,获得重组杆状病毒,经SDS-PAGE和W estern b lotting检测表明,HA蛋白在重组杆状病毒中获得表达。

牛磺酸对热应激肉鸡肠道SIgA和细胞因子的影响

探索在热应激条件下日粮中添加牛磺酸对肉仔鸡分泌型免疫球蛋白A(SIgA)和细胞因子的影响。选用150只1日龄健康的艾维茵肉仔鸡,随机分成5组。I组饲喂基础日粮,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V组分别在基础日粮中添加0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的牛磺酸的试验饲粮。试验期28 d。在试验第14天、第28天和第42天,测定各试验组小肠黏膜SIgA、血浆中白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量。结果表明:日粮添加牛磺酸能够显著提高热应激条件下肉鸡小肠黏膜SIgA含量,降低血浆中IL-1和TNF-α含量(P<0.05)。在日粮中添加一定水平的牛磺酸可改善热应激肉鸡肠道免疫性能。

南五味子多糖对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影响

探讨研究南五味子多糖（KPS）对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影响。用环磷酰胺腹腔注射建立免疫功能抑制动物模型，以黄芪多糖（APS）为阳性对照。给模型小鼠分别灌胃氯化钠注射液和多糖溶液，连续10d灌胃多糖的量分别为50、100和150mg／kg，检测免疫指数、T细胞亚群和细胞因子等免疫指标。结果表明：KPS在50～150mg／kg能够不同程度提高免疫指数，明显降低免疫抑制小鼠CD4＋／CD8＋值（P〈0．05），提高小鼠白介素-2（IL-2）和小鼠干扰素-1（INF-1）含量，降低小鼠白介素-4（IL-4）水平，且具有剂量依赖型。KPS可提高免疫抑制小鼠免疫功能。

玉屏风散颉颃镉致鸡肝脏氧化损伤作用的研究

为了研究玉屏风散对镉对鸡肝脏氧化损伤的颉颃作用。将150只30日AA公鸡随机分为3组:对照组(A:饲喂基础日粮)、加镉组(B:组饲喂基础日粮+CdCl2150 mg/kg)和玉屏风散加镉组(C:饲喂基础日粮+CdCl2150 mg/kg的基础上每天灌服玉屏风散1 mL),所有动物自由采食,染毒后15、30、45、60天时分别从以上3组中取10只鸡剖杀,用于肝脏组织相关指标的检测。结果表明:随着镉作用时间的延长,试验组的GSH-Px、SOD的活性降低,MDA生成量增加;试验组与对照组差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),C组各项指标数据介于A组和B组之间。因此,玉屏风散可减轻镉中毒对机体抗氧化功能的影响,对镉中毒有颉颃作用。

黄芪多糖(APS)拮抗铅镉联合致鸡脾脏细胞凋亡作用的研究

为了探讨黄芪多糖注射液对铅镉联合致鸡脾脏细胞凋亡的拮抗作用。采用TUNEL法、RT-PCR和DNAladder方法检测分别对对照组、铅镉组和黄芪多糖-铅镉组的鸡脾细胞凋亡率和脾淋巴细胞凋亡基因Bcl-2mRNA转录水平。结果表明:与对照组比较,试验组的细胞凋亡率明显升高,Bcl-2mRNA表达水平降低;试验组和对照组差异显著或差异极显著,并且黄芪多糖-铅镉组数据介于对照组和铅镉组之间。试验结果显示:黄芪多糖注射液对铅镉联合致鸡脏脾细胞凋亡具有明显的拮抗作用。

谷氨酰胺和维生素E对热应激肉仔鸡肝抗氧化损伤的影响

为探讨在热应激条件下谷氨酰胺和维生素E对肉仔鸡肝组织抗氧化功能的影响,将320只4周龄艾维茵肉仔鸡随机分成4组,对试验组肉仔鸡单独或联合添加谷氨酰胺(0.4%)和维生素E(200 mg/kg),在试验第14天、第28天和第42天时,从每个试验组随机抽取10只试验鸡剖杀后取其肝组织,测定其超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量。日粮中添加谷氨酰胺和维生素E,能够显著提高热应激条件下肉仔鸡肝中SOD、GSH-Px和CAT活性,降低MDA生成量(P<0.05),其中以复合组效果最佳。结果表明:谷氨酰胺和维生素E能不同程度地提高热应激条件下肉仔鸡的抗氧化能力,联合添加作用更加明显。

苜蓿提取物对肉仔鸡内分泌和免疫指标的影响

添加600mg/kg苜蓿提取物能够提高28、35日龄肉仔鸡法氏囊指数,显著提高血清中三碘甲状腺原氨酸和皮质醇水平,促进35、42日龄肉仔鸡B细胞分裂增殖,显著提高42日龄肉仔鸡血清皮质醇水平和极显著提高法氏囊指数;添加400mg/kg苜蓿提取物能够显著提高28、35日龄肉仔鸡法氏囊指数、血清中三碘甲状腺原氨酸和皮质醇水平,显著提高35日龄肉仔鸡脾脏器官指数、血清球蛋白和促进B细胞分裂增殖,极显著提高42日龄肉仔鸡皮质醇水平和法氏囊指数,但效果不及600mg/kg苜蓿提取物组;添加200mg/kg苜蓿提取物对这些指标没有显著影响。日粮中添加600mg/kg苜蓿提取物效果较佳。

禽流感检测方法研究进展

禽流感不仅对世界养禽业带来巨大的经济损失,而且可以感染人,公共卫生意义重大。由于其病毒亚型众多,抗原性变异极快,毒株的致病性也相差很大,早期快速诊断和血清学检测就成为预防和控制禽流感的前提条件。禽流感病毒的传统诊断方法是分离病毒和检测抗体。近年来,又相继建立了血凝抑制试验、神经氨酸酶抑制试验、酶联免疫吸附试验等血清学诊断技术及分子诊断技术。文章对禽流感检测方法快速诊断进行了概述。

中兽医学教学改革初探

中兽医学是动物医学专业的专业课,具有很强的实践性和应用型。而传统教学方法比较抽象,内容繁杂不易被学生理解和接受。因此,有必要对教学过程中对各个教学环节进行改革。本文从教学目标、教学方法、实验教学和考核方法等环节提出来改革措施,为中兽医教学改革提供一些思路。

胸膜肺炎放线杆菌ApxI A基因C端的克隆、表达及检测

为了研究ApxI A基因C端基因的免疫原性,试验采用分子生物学技术设计1对引物,采用PCR方法扩增得到ApxI A的C端基因片段,经酶切鉴定和基因测序后,构建原核表达载体pET-32a-AC;将重组质粒转化至宿主菌BL21中诱导表达,然后进行SDS-PAGE电泳和Western-blot检测。结果表明:目的基因能够在原核表达系统中表达,其表达产物具有免疫学活性。

CBL教学法在兽医内科学实践教学中的应用

兽医内科学是兽医专业的主要专业课程之一,是实现学生由理论知识走向临床实践的重要环节,传统的教学方法重视传授知识,忽视对学生能力的培养,教学效果不理想,在教学过程中,采用CBL教学法,有针对性地引入相应病例,提高学生们学习兴趣,增加学生们学习的积极性和主动性。词句对教师来说,也能促进自身业务水平的不断提高。

TAT-NPY融合蛋白的表达和生物活性检测

为了获得重组TAT-NPY融合蛋白,并研究其生物学活性。利用基因工程技术,从犊牛下丘脑组织中克隆得到神经肽Y基因序列,通过基因比对符合率为100%。同时,在牛神经肽Y基因序列中插入TAT蛋白基因序列,构建原核表达载体pGEX-3X-NPY-PTD,导入到BL21宿主菌中,进行原核表达,并对表达产物进行鉴定、表达条件优化和纯化,并且经过活性检测,融合蛋白对鸡胚血管生成起促进作用。结果表明:含有PTD结构的重组奶牛神经肽Y具有生物功能活性,为下一步的研究提供了物质基础。

犬IL-2基因克隆及原核表达

[目的]研究犬IL-2基因的克隆和表达,为开发新型免疫增强剂和基因工程疫苗提供理论支持。[方法]从犬全血中分离出白细胞,经刀豆素刺激培养20 h后,提取总RNA;根据GenBank中犬IL-2基因序列,设计1对引物,进行PCR扩增,并构建原核表达载体pET-28a,将其转化到宿主菌BL21中,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE进行分析。[结果]RT-PCR扩增出一条约500 bp的条带,与预期结果相符;重组质粒pMD18-T-IL2经双酶切后,产生一个约500 bp基因片段,说明目的基因被成功克隆;表达载体pET-28a-IL2经双酶切和PCR鉴定后,分别产生一个约500 bp目的片段,表明表达载体构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,分子量约为20 kDa,与预期蛋白大小基本相同。[结论]犬IL-2基因被成功克隆和表达。

检测禽流感病毒RT-PCR一步法的建立及H5、H9亚型的鉴定

目的建立禽流感病毒(AIV)通用型RT-PCR一步法,并鉴定AIV H5和H9亚型。方法根据流感病毒高度保守的M1基因序列,设计一套通用型引物,建立AIVRT-PCR一步法。根据H5、H9亚型HA基因序列,分别设计一套特异性引物,其上、下游引物分别位于裂解位点两侧,应用RT-PCR一步法检测AIV H5和H9亚型,并验证所建立方法的敏感性;通过检测NDV、IBV和IBDV等RNA病毒及计算机软件模拟检测,验证其特异性。结果所建立AIV系列RT-PCR检测方法具有特异、敏感、简便和快速的特点。结论该方法可用于AIV的检测,H5、H9亚型的鉴定及致病性分析。

口蹄疫重组鸡痘病毒诱导猪特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性检测

目的:评价口蹄疫重组鸡痘病毒vUTAL3CP1诱导猪产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性的能力。方法:用PCR方法亚克隆O型FMDVVP1基因C末端部分片段(第1 30～2 1 3AA)。将其插入真核表达载体pDisplay中,构建质粒pDisplay- mVP1。将pDisplay -mVP1转染PK 1 5细胞,经3次G41 8加压筛选,并用RT- PCR和IFA鉴定,证明获得表达目的基因的PK 1 5 /pDisplay- mVP1细胞。最后,利用该细胞作为靶细胞,用LDH法检测口蹄疫重组鸡痘病毒vUTAL3CP1免疫猪的特异性CTL杀伤活性。结果:vUTAL3CP1免疫组在效靶比2 5∶1和5 0∶1时,CTL裂解活性分别达到42 . 84%±3 2. 1 %和61 . 94%±4 2. 8% ,显著高于灭活疫苗组与其它对照组(p <0 . 0 1 )。结论:vUTAL3CP1可以诱导猪产生高水平的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性,为进一步的FMDV基因工程疫苗的研究奠定了基础。

黄芪多糖对肉鸡新城疫免疫效果的影响

研究黄芪多糖在新城疫(ND)La Sota疫苗免疫过程中对肉鸡免疫效果的影响。120只1日龄肉雏鸡随机分为3组,每组40只鸡。分为对照组、试验Ⅰ和Ⅱ组。所有肉鸡于21和42 d分别进行La Sota疫苗的首免和二免,胸肌注射,0.3 mL/羽。试验Ⅰ组每只鸡分别注射0.3 mL黄芪多糖注射液;试验Ⅱ组每只鸡分别注射0.6 mL黄芪多糖注射液;对照组正常饲喂全价料。试验结束时称量肉鸡质量,测定脾和法氏囊指数;分别在首免前1 d、首免7、14和21 d及二免14和21 d测定ND抗体效价。结果表明:试验Ⅰ和Ⅱ组肉鸡体质量、脾和法氏囊指数均高于对照组,差异显著;试验Ⅰ组从首免21 d开始与对照组差异显著;试验Ⅱ组首免14 d开始与对照组差异显著。从而得出黄芪多糖提高肉鸡体质量和免疫器官指数及新城疫血凝抑制试验抗体效价。