低能离子注入诱变法选育新硫肽类抗生素166A高产菌株

目的为进一步提高产量,以小单孢菌Micromonospora sp.TMD166-MU1为出发菌株,采用低能离子注入技术,研究不同离子注入参数对菌株存活率、正负突变率的影响,通过突变株抑菌活性变势参数分析,初步探讨N+离子注入对166A生产菌所产生的诱变效果,并结合卡那霉素抗性筛选及牛津杯固体发酵高通量筛选,获得高产菌株。方法利用低能N+离子注入技术对出发菌株TMD166-MU1的孢子进行辐照诱变,以卡那霉素耐受性为选择压力,不同诱变条件处理的菌悬液涂布在含有卡那霉素培养基平板上培养后获得单菌落,并以牛津杯固体发酵高通量筛选方法进行高产菌株初筛,之后对高产菌株进行摇瓶复筛,利用高效液相法检测突变株摇瓶发酵的化学效价。结果通过研究30和60 keV能量下不同注入剂量与小单孢菌正突变率的生物学效应关系,确定了在注入能量为30 keV、注入剂量4×10^(13)ions/cm^(2)、卡那霉素抗性筛选浓度为6 mg/L条件下,可获得最高达36.33%的正突变率。复筛效价是出发菌株1.5倍以上的有4株,其中突变株IK-3的166A产量是菌株TMD166-MU1的1.8倍。结论采用低能N+离子注入诱变方式,再结合抗生素抗性筛选及牛津杯固体发酵高通量筛选的集成方法能简单、高效地获得166A高产突变菌株。

格尔德霉素生物合成基因功能的验证

格尔德霉素(Geldanamycin,Gdm)作为热休克蛋白90的特异性抑制剂,是非常有前景的抗肿瘤和抗病毒的药物,我们已从吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus17997)的基因文库中获得了Gdm大部分生物合成基因。为了研究主要基因的功能,选择了聚酮合酶基因(Polyketide synthase gene,pks)的第六模块、单加氧酶基因(Mono-oxygenase gene,gdmM)和氨甲酰基转移酶基因(Carbamoyltransferase gene,gdmN)3个基因作为靶点分别进行基因阻断,获得了基因同源双交换的阻断变株△pks、△gdmM和△gdmN。经HPLC检测证实这些基因的阻断变株均不产生Gdm,基因回复实验排除了基因阻断所可能造成的极性效应对其它基因表达的影响,说明所克隆的pks、gdmM和gdmN基因确实是Gdm生物合成所必需的基因。

格尔德霉素基因工程高产菌株的构建和培养

在格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)中存在两种3-氨基-5-羟基苯甲酸(3-amino-5-hydroxybenzoic acid,AHBA)的生物合成基因簇,根据同源性可分为苯醌类和萘醌类。已证明其中苯醌类的AHBA生物合成基因簇负责格尔德霉素(geldanamycin,Gdm)起始单位的合成,而萘醌类的AHBA基因簇可能参与未知安莎化合物的生物合成。为提高吸水链霉菌17997菌种的Gdm发酵产量,并研究高产菌种在固体培养基上孢子的生长周期。采用基因阻断技术,将吸水链霉菌17997中的萘醌类AHBA生物合成基因簇(shnSOP)进行破坏,以获得ΔSOP菌株,从而减少对合成所需共同底物AHBA的争夺。HPLC分析结果表明ΔSOP菌株Gdm的发酵产量比原株提高185%。同时,通过孢子计数发现该菌株在固体培养基上的孢子生长经历2个周期,第2代孢子菌种的Gdm产量较高。

反相高效液相谱型分析检测吸水链霉菌17997变株发酵新产物

以吸水链霉菌17997为出发菌株,分别阻断格尔德霉素(geldanamycin,GA)生物合成酶基因簇中的I型聚酮合酶(type I polyketide synthase,pks)基因的第6模块,单加氧酶(monooxygenase,gdmM)基因和氨甲酰基转移酶(carbamoyltransferase,ct)基因得到3种变株(pks-)、(gdmM-)和(ct-)。比较变株与原株发酵产物的H PLC谱型,结合紫外吸收图谱分析。检测结果表明各变株的GA生物合成均被阻断,并产生3个不同于原始菌株的新物质。这证明基因操作所涉及的pks,gdm M和ct基因是GA生物合成的必需基因;这些基因的阻断可产生不同于原株的新物质。HPLC谱型比较可以在多样化代谢产物的产生菌中快速、准确地发现基因工程变株发酵产物的变化,指导新化合物的分离鉴定,样品用量甚微,是化学早期鉴别的有力工具。

可利霉素产生菌中糖基转移酶基因ssp803的功能鉴定及酶学特性分析

目的 通过体内基因阻断和体外酶促反应鉴定可利霉素产生菌中糖基转移酶基因ssp803功能和酶学特性,以及与可利霉素生物合成的关系。方法 在可利霉素产生菌54-IA中利用CRISPR-Cas9基因编辑系统敲除ssp803基因,将组成型启动子kasOp*控制的ssp803及其同源基因oleD分别转化到54-IA和?803变株中进行回复和高表达实验,通过HPLC分析?803变株、回复株和高表达株中可利霉素主组分异戊酰螺旋霉素的产量变化。再将ssp803基因连接至冷休克表达载体pColdI上,利用大肠杆菌Transetta(DE3)中进行表达和纯化。以大环内酯类抗生素为糖苷配体和以UDP-葡萄糖为供体进行Ssp803催化反应,通过HPLC-MS检测酶催化后的产物,通过UDP-Glo试剂盒测定Ssp803的酶促动力学参数。结果 利用PCR筛选出了ssp803基因框内缺失突变株?803,在?803中异戊酰螺旋霉素产量与54-IA出发菌株相似,而在54-IA和?803中高表达ssp803完整基因时,异戊酰螺旋霉素的含量明显下降,导入高表达oleD基因的质粒后产量下降得更多。通过体外酶促反应证实Ssp803催化的最适温度是37℃,最适pH是9.06。Ssp803对所测的大环内酯类抗生素都具有糖基化失活作用,对异戊酰螺旋霉素I等16元环的大环内酯类抗生素的催化活性要低于14元环大环内酯类抗生素,对索利霉素的催化效率最高。结论 Ssp803对大环内酯类抗生素具有糖基化失活作用,对14元环大环内酯类抗生素的活性更高,最适底物是索利霉素;在可利霉素产生菌中高表达ssp803和oleD基因会抑制异戊酰螺旋霉素的生物合成。

淀粉酶抑制剂与抗虫的研究进展

本文综述了α淀粉酶抑制剂对α淀粉酶特异性抑制的分子机制 。

吸水链霉菌17997格尔德霉素部分生物合成基因簇的克隆和分析

吸水链霉菌17997(Streptomyceshy groscopicus17997)是我所从中国云南土壤中分离到的格尔德霉素(geldanamycin,GDM)产生菌,GDM具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性,但其肝毒性和水溶性差的缺点限制了其在临床上的应用。为了实现对GDM结构的生物学改造,首先要获得GDM的生物合成基因。根据GDM后修饰基因——氨甲酰基转移酶基因(gdmN)的保守序列筛选S.hygroscopicus17997的柯斯质粒基因组文库,共获得6个阳性克隆,选择CT-4阳性柯斯质粒进行亚克隆和测序,又通过PCR延伸的方法获得了与CT4连锁的将近5kb的外源序列,共获得28.356kb的外源DNA序列,其中包含了13个可能阅读框架,通过同源比较证实该序列与S.hygroscopicusNRRL3602中的GDM生物合成基因有很高的同源性。为进一步研究GDM生物合成基因的功能,并通过组合生物学的方法改造GDM的结构奠定了基础。

格尔德霉素生物合成的调控基因

从吸水链霉菌17997中克隆了格尔德霉素(Geldanamycin,Gdm)生物合成酶基因簇,通过生物信息学分析发现两个LAL(Large ATP-bindingregulators of the LuxR family)家族的调控基因gdmRI和gdmRII,基因阻断和基因回复实验证实这两个基因产物都正调控Gdm的生物合成。

苯安莎类抗生素的一种早期鉴别方法

目的建立一种对苯安莎类抗生素特异的颜色反应早期鉴别方法。方法根据碱性处理苯安莎类抗生素,使其安莎链与苯环连接的酰胺键开裂后化合物呈紫色的原理,建立了将发酵液粗提品进行薄层色谱层析后采用2.0mol/L NaOH溶液喷涂显色的早期鉴别方法;以格尔德霉素为例,在硅胶板上的检测灵敏度为4μg。结论采用该颜色鉴别反应方法:1对两株确证为新的格尔德霉素产生菌Streptomyces sp.4-4以及Streptomyces sp.3-57进行了佐证;2对吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997的一株格尔德霉素生物合成后修饰基因阻断变株CT-1中产生的格尔德霉素前体物及其类似物,在硅胶板上进行了快速定位和初步鉴别。

土壤宏基因组文库的构建及格尔德霉素类PKS基因的初步筛选

目的构建土壤宏基因组文库并对格尔德霉素类I型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因进行初步筛选研究。方法直接提取土壤样品中宏基因组DNA,以Fosmid为载体,构建宏基因组文库。根据格尔德霉素的I型PKS基因的保守序列设计引物,使用菌落PCR方法直接筛选所获得的宏基因组文库。结果成功构建了土壤宏基因组文库,获得约6800个克隆子,其平均插入片段在25kb以上,覆盖至少170Mb的基因组信息。通过PKS基因筛选,获得了新的PKS基因片段。结论本文报道了土壤宏基因组文库的成功构建,并为利用宏基因组技术寻找新的聚酮类次级代谢产物的生物合成基因,以便于其异源表达或组合生物合成新的聚酮类次级代谢产物奠定基础。

吸水链霉菌17997产生的4,5-双氢格尔德霉素的鉴别与检测

本文对从吸水链霉菌17997发酵提取获得的格尔德霉素精制品进行了LC-MS-MS分析,发现其中含有4,5-双氢格尔德霉素组分。对吸水链霉菌17997摇瓶发酵产物的硅胶板薄层层析分析表明,4,5-双氢格尔德霉素组分在发酵中期有积累。已知4,5-双氢格尔德霉素的抗肿瘤活性比格尔德霉素差,因而需要限制其在格尔德霉素制品中的含量。本文研究结果对以吸水链霉菌17997等为产生菌研究格尔德霉素发酵,促进4,5-双氢格尔德霉素转化为格尔德霉素以提高发酵液的品质,以及检测格尔德霉素制品中的4,5-双氢格尔德霉素组分具有实际意义。

响应面法优化必特螺旋霉素发酵培养基

目的利用响应面法对新一代必特螺旋霉素基因工程菌(Streptomyces spiramyceticus,WSJ-2),即含有整合型双拷贝4″位异戊酰基转移酶基因(4″-isovaleryltrasferase gene,ist)工程菌发酵培养基进行优化。方法以发酵效价和异戊酰螺旋霉素组分含量为指标,通过部分因子析因设计实验,筛选出影响较大的主要影响因子。其次,进行最陡爬坡实验,最后,通过中心组合设计,利用DX7trail 7.0软件进行回归分析,确定主要影响因子的最佳浓度,得到优化发酵培养基。结果综合培养基组成对发酵效价和组分含量的影响获得2个主要影响因子,即KH2PO4和NaCl,通过最陡爬坡实验和响应面法,确定了优化发酵培养基组成为(g.L-1):淀粉60、碳酸钙7.0、MgSO42.0、NH4NO36.0、酵母粉3.0、鱼粉15、MnCl20.10、NaCl 12.5、KH2PO40.645。验证实验表明在优化培养基中发酵相对效价为142%与预测值139%比较接近,效价比原配方提高了42%,而其总异戊酰基螺旋霉素组分的含量与原配方基本一致。结论对新构建的必特螺旋霉素基因工程菌采用响应面中心组合设计,可以较有效地进行发酵培养基的优化。

海洋细菌中活性化合物的筛选策略(英文)

目的从700多株海洋沉积物分离得到的细菌中筛选安莎类抗生素和6-脱氧己糖(6DOH)糖基化修饰的次级代谢产物产生菌。方法以3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)合酶基因和dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶基因为靶标,分别进行安莎类抗生素和6DOH糖基化修饰的次级代谢产物产生菌的分子筛选。对AHBA合酶及dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶基因阳性的菌株发酵液及提取物进行抗菌、抗肿瘤、抗病毒活性分析。采用利福霉素抗性及氢氧化钠显色初步鉴定安莎类化合物;采用α-萘酚硫酸显色初步鉴定6DOH糖基化修饰的化合物。利用16S rRNA序列对部分阳性菌株进行系统发育分析。结果共获得39株AHBA合酶基因阳性和10株dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶基因阳性菌株。阳性菌株中,78%具有不同程度的生物活性。化学初步鉴定结果表明:49%的AHBA合酶基因阳性菌株产生安莎类化合物;50%的dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶基因阳性菌株产生6DOH糖基化修饰的化合物。系统发育分析表明,大多数阳性菌株属于放线菌中的链霉菌属。结论基因探针筛选可作为一种合理、有效的方法从海洋细菌中发现活性代谢产物。

可利霉素药理活性研究进展

可利霉素属于16元环大环内酯类抗生素,由多种酰化螺旋霉素组成,以3种异戊酰化螺旋霉素为主组分,在遗传改造后的螺旋链霉菌中发酵产生。它已经被国家药品监督管理局批准为国家一类新药,主要用于治疗上呼吸道感染。可利霉素除了具有抗细菌感染作用以外,还发现它具有多种药理活性如抗肿瘤、抗肝纤维化、抗炎、免疫调节等作用。最近研究还证实可利霉素还具有抗病毒活性,特别是对新冠病毒(SARS-CoV-2)也有良好的抑制活性,并在临床试验中证实对新冠肺炎患者具有一定疗效。阐明这些非抗菌的生物活性机制对扩宽可利霉素的适应症具有重要意义。

高效液相色谱质谱法测定格尔德霉素基因阻断变株产物

目的:在研究格尔德霉素(GDM)生物合成的过程中利用基因阻断技术分别阻断 GDM 生物合成的起始基因3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)基因、含 AHBA 基因并与之相连的聚酮合酶(PKS)基因簇以及 GDM 生物合成相关的 PKS 和 PKS 后修饰基因簇 CT-PKS 获得3个 GDM 基因阻断变株。为了比较分析他们的次级代谢产物,采用高效液相色谱质谱法测定发酵液组分。方法:发酵液经过乙酸乙酯提取后用反相高效液相色谱分析。分析柱为迪马公司 Diamonsil^(TM)(钻石)C_(18)(4.6 mm×150 mm,5μm);流动相是40%～100%甲醇,30 min 梯度洗脱;流速1 mL·min^(-1);二极管阵列检测器(DAD),检测波长304nm。利用电喷雾质谱(ESI)通过正负离子扫描获得相应化合物的相对分子质量信息;利用质谱的源内裂解技术获得相应化合物的结构信息。结果:检测发现,阻断2个不同的 GDM 生物合成基因以后主要产生2个不同于 GDM 的化合物。结论:该方法可快速、准确地对基因工程变株发酵新产物进行早期鉴别,指引后续的化学分离,并用于其他 GDM 基因阻断变株产物的定性。

提高可利霉素药代动力学研究中微生物法检测灵敏度的研究

目的研究影响可利霉素微生物法检测敏感度的因素,以提高血浆中测定可利霉素的灵敏度,为药代动力学研究中血药浓度的测定奠定基础。方法采用管碟法和纸片法,以抑菌圈大小为指标,考察检定菌液浓度,培养基配方,单、双层培养基检定平板,缓冲液加NaCl,胎牛血清,血浆等多种因素对检测灵敏度的影响;采用有机溶剂从人血浆中萃取可利霉素等方法测定血药浓度。结果检定菌浓度、培养基配方、检定平板厚度对检测灵敏度影响显著,含NaCl的缓冲液有利于提高检测灵敏度,人血浆对检测灵敏度有一定影响。以藤黄八叠球菌作检定菌,其菌浓为OD600=0.3~1.0,采用含牛肉蛋白胨0.5%,牛肉浸膏0.25%检定培养基制备单层检定平板,可以有效提高可利霉素检测灵敏度6倍;从血浆中萃取可利霉素,用纸片法进行测定,其最低检测限度可达0.02μg/ml。结论所建立的从血浆中萃取可利霉素的纸片法显著提高了微生物法检测血浆中可利霉素的灵敏度,可用于可利霉素药代动力学研究中血药浓度的微生物法检测。

一种发酵提取物中含卤有机化合物的早期鉴别方法

目的建立一种对发酵提取物中含卤有机化合物的快速定性检测方法。方法以改良的Beilsten法对含卤和不含卤的有机化合物纯品及发酵液提取物进行焰色反应,观察是否有阳性现象——绿色火焰呈现;同时研究了该法的检测基限和氯化钠对检测的干扰。结论改良的Beilsten法适用于对含氯、溴、碘元素有机物的定性检测,其对卤元素的检测基限可达到微克级;通过适当的发酵液提取方式降低无机卤素的干扰后,该法可有效检测发酵提取物中含卤有机化合物。

多肽IMB-P1的理性设计及活性评价

目的通过对多肽IMB-P1进行截短设计并进行体内和体外抗肿瘤活性评价,确定多肽IMB-P1的最小功能片段。方法分别从N端和C端对多肽IMB-P1进行截短,经固相合成法制备目标多肽。测定这些多肽对PD-1/PD-L1结合的抑制活性,在荷B16黑色素瘤小鼠模型中评价它们的体内抗肿瘤活性,并测定活性好的多肽在血浆中的稳定性及其二级结构特征。结果设计合成了6条IMB-P1截短多肽IMB-P1-1~6。经PD-1/PD-L1结合的抑制活性评价,发现IMB-P1-2、IMB-P1-3和IMB-P1-6抑制活性较好,其中多肽IMB-P1-6的抑制率最高,可达90%。在小鼠体内抗肿瘤活性研究发现IMB-P1-2的抑瘤作用与IMB-P1相当,其他多肽的抑瘤活性都有所下降。经过HPLC检测发现多肽IMB-P1-2在血浆中的稳定性优于IMB-P1-3和IMB-P1-6。多肽IMB-P1无论是在水中还是在SDS环境中均呈无规则卷曲状态,而多肽IMB-P1-2在水中形成了α-螺旋结构。结论鉴定出与多肽IMB-P1体内抗肿瘤活性相当的更短多肽IMB-P1-2及其二级结构特征,为将来进一步提高多肽活性的修饰策略提供了锁定其α-螺旋构象的方向。

利用强启动子PermE^＊提高4＂-异戊酰基转移酶基因在变铅青链霉菌TK24中对螺旋霉素的4＂-异戊酰化水平

目的提高螺旋霉素生物转化为4"-异戊酰螺旋霉素的水平,为构建以4"-异戊酰螺旋霉素为主要组分的必特螺旋霉素新一代基因工程菌提供指导。方法构建重组质粒pKC1139-e-ist-ist和pKC1139-ist-ist,它们分别含有5'-上游插入红霉素抗性基因强启动子PermE*的4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝,和4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝;将它们分别导入到变铅青链霉菌TK24中,比较它们对螺旋霉素的4"-异戊酰化能力。结果在加入终浓度为50μg/mL螺旋霉素时,变铅青链霉菌TK24[pKC1139-e-ist-ist]比变铅青链霉菌TK24[pKC1139-ist-ist]对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平提高近4倍。结论在变铅青链霉菌TK24中,PermE*可以增强4"-异戊酰基转移酶基因表达,明显提高对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平。

链霉菌形态分化和次级代谢调控机制的研究进展

链霉菌具有复杂的形态分化周期,并能产生多种具有生物活性的次级代谢产物,而且两者的关系密不可分。文章总结了链霉菌气生菌丝和孢子形成等形态分化相关调控的研究成果,以及在次级代谢调控中全局调控和途径特异性调控等分子水平上的新进展。阐明链霉菌形态分化和次级代谢的调控机制将有利于优化次级代谢物生产菌株和新型药物的研究。