应用PCR－SSCP银染色法检测宫颈癌中p53基因突变

应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染色法检测宫颈癌中ｐ５３基因突变赵蔚明，司静懿，李昆，张煊，宋国兴，刘世德，赵立新（中国医学科学院，中国协和医科大学，北京基础医学研究所，１００００５）聚合酶链反应－单链构象多态性分析（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａ...

中国妇女宫颈癌中HPV16E6基因序列分析及分子克隆

人乳头瘤病毒16型（Humanpapillomavirustype16，HPV16）感染与宫颈癌的发生有密切关系。研究发现，HPVI6早期蛋白E6是肿瘤相关抗原，可在HI，V相关肿瘤中持续表达，为肿瘤治疗性疫苗的研制及免疫治疗提供了靶位。但也有文献报道，宫颈癌中HPVI6E6基因可有一定的变异性，...

外源性tRNAser对人乳头瘤病毒E7基因表达的影响

目的:探讨哺乳动物细胞中特定外源性tRNAser(CGA)的表达对HPV6bE7蛋白转译的影响,为研究HPV抗原表达的机制提供实验依据。方法:提取重组真核表达质粒pSVtRNAser(含人tR-NAsercDNA的全部序列)、pcDNA3-WtE7(含野生型HPV6bE7ORF)、pcDNA3-HuE7(含优化密码人源化HPV6bE7ORF),EcoRI酶切鉴定pSVtRNAserKpnI和EcoRI双酶切鉴定pcDNA3-HuE7和pcDNA3-WtE7。将质粒DNApSVtRNAser分别与pcDNA3-WtE7或pcDNA3-HuE7混合,脂质体介导共转染COS-1细胞。转染后48h,做免疫荧光染色。结果:重组质粒酶切鉴定结果正确。免疫荧光检测显示:与野生型E7基因单独转染组相比,pSVtRNAser与pcDNA3-WtE7共转染的COS-1细胞中,E7蛋白的表达增强。pcDNA3-HuE7质粒单独转染的COS-1细胞中优化密码E7基因可获得有效表达,共转染后,荧光阳性细胞未见明显增多。Southernblot检测结果显示,在400bp处可见特异DNA条带,说明质粒pSV2tRNAser已转入COS-1细胞。结论:补充外源性pSVtRNAser对COS-1细胞中野生型HPV6bE7基因的表达有一定程度的增强作用。

PCR-SSCP分析技术及其在肿瘤学研究中的应用

PCR-SSCP分析技术是近年来发展起来的基因分析新方法。本文重点介绍了此技术的原理、方法学新进展以及在人类肿瘤学研究中的应用前景。

宫颈癌组织中HPV16 E6C基因变异的研究

为探讨ＨＰＶ１６ 肿瘤相关抗原Ｅ６ 羧基端基因片段（Ｅ６Ｃ）在宫颈癌组织中的变异性以及采用Ｅ６Ｃ做为肿瘤治疗性疫苗抗原基因的可行性，采用ＰＣＲ方法自１８ 例单纯ＨＰＶ１６ ＤＮＡ 阳性的宫颈癌组织中扩增ＨＰＶ１６ Ｅ６ＣＤＮＡ，经单链构象多态性分析（ＳＳＣＰ）和ＤＮＡ序列测定法检测其基因变异性。ＳＳＣＰ分析结果显示，１８ 例宫颈癌组织中ＨＰＶ１６ Ｅ６ＣＤＮＡ 电泳条带与标准对照ＤＮＡ 条带一致，提示无基因变异现象存在，ＤＮＡ 序列测定也证实Ｅ６Ｃ编码区内无核苷酸突变。该研究证实采用ＨＰＶ１６ Ｅ６Ｃ端基因片段作为ＨＰＶ疫苗候选基因可行，为进一步研制ＨＰＶ１６ ＤＮＡ

子宫颈鳞癌 Rb 基因与 HPV16 E7 基因的相关性研究

用多聚酶链反应—单链构象多态性分析（Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）以及地高辛标记探针斑点杂交技术对３０例子宫颈鳞癌组织中Ｒｂ抑癌基因及ＨＰＶ１６Ｅ７癌基因进行分析。结果３０例子宫颈鳞癌组织中未检出Ｒｂ基因突变或缺失；２０例癌组织中检出ＨＰＶ１６Ｅ７ＤＮＡ，阳性率为６７％。提示ＨＰＶ１６Ｅ７癌基因与子宫颈鳞癌密切相关。子宫颈鳞癌中Ｒｂ基因结构异常并不常见，而且与ＨＰＶ１６Ｅ７基因的存在状况无明显相关性。

“课程渗透模式”与七年制医学微生物教学

七年制高等医学教育是以培养达到硕士水平高级医学人才为目标的新型培养形式。如何针对七年制教育的特点，探索医学教育新模式，培养符合21世纪医学科技发展要求的高层次医学人才，是当今医学教育改革的一个重要课题。医学微生物学在七年制教学全过程的第四年第一学期开设，作为一门独立的专业基础课，学时多，要求高。显然，该层次的教学内容和方法不应等同于医学本科的教育和一般的硕士研究生培养。在目前尚无统一的七年制医学教育教学大纲和相应教材的情况下，如何达到加深、拓宽教学之目的，我们认为采用“渗透模式”教学方法较为理想。

PCR检测在尖锐湿疣诊断中的综合评价

对７０例外阴病变的病例进行严格质控的ＰＣＲ检测，并结合病史、组织病理改变及ＨＰＶ核壳抗原免疫组化检测进行综合分析。结果表明，４０例具有ＣＡ组织病理特征的病例中，３７例ＨＰＶ６／１１ＤＮＡＰＣＲ检测阳性，３０例原病理诊断为鳞状上皮乳头状增生或假性湿疣的病例中，有７例检出ＨＰＶＤＮＡ。综合分析的结果提示，对于有典型ＣＡ组织学特征者，结合临床，即使不做ＰＣＲ检则也可做出正确诊断。ＰＣＲ检测的意义在于为无典型ＣＡ组织学特征的病例增加一有价值的诊断依据，而不能仅根据ＰＣＲ结果武断地做出结论。

HPV16L2开放读码框编码表位的基因克隆和表达

利用质粒p16L2Ex6-3和pATH10,制备了含有HPV16L2ORF编码表位的基因克隆p16L2REx6-3。将此重组质粒转化大肠杆菌HB101,并诱导其有效表达,产生一分子量约为40KD的含有E.coli trpE的融合蛋白。Western blot分析结果表明,此蛋白可与感染HPV16的患者血清呈阳性免疫反应,提示该克隆的表达蛋白具有HPV16,的型抗原特异性。

济南地区献血者中人疱疹病毒8型(HHV-8)IgG抗体的检测及相关危险因素分析

目的:了解人疱疹病毒8型(HHV-8)在济南地区不同献血者中的感染情况,并对其与年龄、性别、HBV、HCV、梅毒螺旋体的相关性进行统计学分析。方法:以HHV-8 ORF K8.1合成多肽为抗原,采用ELISA方法检测献血者血清中相应IgG水平。结果:520份血清中抗HHV-8 ORFK8.1抗体的总体检出率为5.962%(31/520),有随年龄增加而增高的趋势,但与性别、HBV、HCV、梅毒螺旋体的相关性无统计学意义。结论:济南地区献血者中有一定比率的HHV-8感染。采取措施,防止HHV-8经输血传播具有一定的现实意义。

E型沙眼衣原体MOMP基因重组腺病毒的构建及免疫原性研究

目的:构建E型沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)基因重组腺病毒,为沙眼衣原体腺病毒疫苗的研究奠定基础。方法:根据Genebank中E型Ct MOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到MOMP基因片段,克隆至pcDNAII载体,测序后连接入腺病毒穿梭载体pDC316。穿梭载体pDC316-MOMP与含腺病毒基因组的辅助质粒PBHGlox△E1,3Cre共转染至HEK293细胞,在Cre-loxP重组酶作用下进行重组,包装成重组腺病毒颗粒,用PCR和RT-PCR方法进行鉴定。并用动物免疫试验检测重组腺病毒的免疫原性。结果:从E型Ct基因组DNA中扩增出约1.1 kb的特异MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实穿梭载体pDC316-MOMP构建正确。穿梭载体pDC316-MOMP与含腺病毒基因组的辅助质粒PBHGlox△E1,3Cre共转染至293细胞,出现明显细胞病变效应。收集重组腺病毒,PCR法证实重组腺病毒含有MOMP基因,RT-PCR证实重组腺病毒在293细胞能表达MOMP基因。重组腺病毒免疫小鼠可诱导特异性抗体产生,证明重组腺病毒具有良好免疫原性。结论:成功构建了E型沙眼衣原体MOMP基因重组腺病毒,该重组腺病毒可诱导小鼠产生特异性抗体。

龋病及牙周炎患者唾液中HP检测及意义

采用Taqman实时荧光定量PCR技术分别对无慢性胃炎史的龋病、牙周炎患者及正常对照者唾液标本中的幽门螺杆菌(HP)进行检测。结果龋病患者唾液中HP阳性率为14.28%,HP-DNA拷贝数为(1744.77±673.33)拷贝/μl;牙周炎患者分别为25%、(2177.56±403.22)拷贝/μl;正常对照者未检测到HP阳性者,HP-DNA<500拷贝/μl。结论HP不是无慢性胃炎史的健康人群口腔中的常驻菌群,但重症的龋病和牙周炎与HP在口腔中的定植有关。

中草药和铬对心肌细胞生长代谢及其抗病毒的实验研究

选用中草药人参、黄芪、麦冬及微量元素铬于体外培养的人及鼠心肌细胞上，研究药物对细胞生长代谢及其抗病毒作用。实验表明：中草药及铬均有促进细胞生长代谢、延长细胞存活时间、增强鼠心肌细胞自发收缩搏动及提高人心肌细胞抗病毒的作用，其中麦冬、黄芪及铬的作用更明显。

减毒沙门氏细菌为载体的人乳头瘤病毒双启动子DNA疫苗载体构建

目的 :构建一种廉价高效的防治宫颈癌的人乳头瘤病毒新型双启动子DNA疫苗。方法 :设计合成细菌厌氧诱导启动子Nir ,含有FNR顺式反应元件、RBS和真核基因Kozak元件 ,插入pTriEx真核启动子CMVIE下游 ,构建pCMVnir双启动子载体。将人乳头瘤病毒 16型L1L7,融合基因 ,插入pCMVnir,制备pCMVnirL1E7,转化减毒沙门氏细菌SL32 6 1,厌氧诱导表达 ,SDS PAGE和Westernblot分析检测Nir启动子的活性。结果 :经DNA序列和限制性内切酶鉴定分析 ,成功构建了HPV双启动子DNA疫苗载体pCMVnirL1E7,转化沙门氏细菌SL32 6 1,厌氧条件下可诱导表达HPVL1E7蛋白质。结论 :成功构建了一种与胞内寄生细菌(减毒沙门氏细菌 )匹配的双启动子DNA疫苗新型载体 。

CpG-ODN诱导白血病HL60细胞分化和凋亡的研究

目的:研究含CpG基序的寡核苷酸对白血病HL60细胞的作用。方法:设计合成含CpG基序的寡核苷酸(CpG-ODN)、不含CpG基序的寡核苷酸(nonCpG-ODN)和含甲基化CpC基序的寡核苷酸(ZpG-ODN)分别作用于白血病HL60细胞,MIT法测定HL60细胞抑制效应,硝基四氮唑蓝还原实验和细胞表面CD14分子表达状况分析HL60细胞诱导分化结果,流式细胞仪和透射电镜观察HL60细胞的凋亡现象,免疫组化检测HL60细胞后caspase 3、Bel-2和Bax的表达状况。结果:CpG-ODN对白血病HL60细胞有诱导分化和诱导凋亡作用,nonCPG-ODN和ZpG-ODN无此作用。结论:CpG-ODN可直接诱导白血病HL60细胞分化和凋亡,此为白血病免疫治疗提供了新的途径。

HPV_(16)L1-E7重组腺病毒载体疫苗免疫BALB/c小鼠的研究

目的:探讨人乳头瘤病毒16型L1-E7重组腺病毒载体疫苗的免疫效应。方法:①将rAd5HPV16L1-E7载体疫苗在293细胞中扩增后,以肌肉注射、腹腔注射、滴鼻和灌胃途径免疫小鼠,采用ELISA法测其血清IgG抗体水平;②制备脾细胞悬液,加入到96孔无菌培养板中,并分别加入rAd5HPV16L1-E7特异性蛋白和RPMI1640+10%胎牛血清,加入3H-TdR1μCi/孔,做T-细胞增殖实验;③取经过培养56h的培养液进行IFN-γ的测定。结果:不同途径免疫的BALB/c小鼠血清IgG抗体水平均高于对照组(P<0.05),但以肌注组产生抗体量最多,IFN-γ和T-细胞增殖亦高于对照组(P<0.05)。结论:rAd5HPV16L1-E7重组活病毒疫苗既能刺激T-细胞产生细胞介导的免疫应答,又能刺激B-细胞产生抗体介导的免疫应答,说明其具有很好的免疫原性。

SARS冠状病毒M基因片断在大肠杆菌中表达及其抗原性的研究

目的:获得纯的重组SARSCoVM蛋白,并初步测定重组蛋白的抗原性。方法:软件分析SARSCoVM蛋白富含免疫表位的片断,体外合成编码SARSCoVM蛋白15-170aa序列的DNA片段,利用DNA重组技术,将该合成DNA克隆至表达载体pGEX-5X-1,构建重组质粒pGEX-SARSCoVM。在大肠杆菌BL21中诱导表达GST-SARSCoVM重组融合蛋白,分离纯化GST-SARSCoVM蛋白,利用纯化蛋白作为抗原,建立ELISA试验检测抗SARSCoVM抗体。结果:GST-SARSCoVM蛋白分子量为43kD,纯化的GST-SARSCoVM蛋白作为抗原检测血清中SARSCoVM抗体,53例正常成人献血者血清未检出SARSCoVM抗体。结论:SARSCoVM蛋白表达成功,在健康人血清中未检出SARSCoVM抗体。

E型沙眼衣原体MOMP基因重组质粒的构建与表达

目的:构建E型沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)基因重组真核表达质粒pVAX1-MOMP,为探索安全的E型CtDNA疫苗奠定基础。方法:根据Genebank中E型CtMOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到约1.1kb的MOMP片段,克隆至pcDNAII载体,测序后亚克隆至表达载体pVAX1,构建卡那霉素抗性真核重组表达质粒pVAX1-MOMP,并以重组质粒转染COS-1细胞进行表达,用Westernblotting方法鉴定表达产物。结果:从E型Ct基因组DNA中扩增出特异的MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实pVAX1-MOMP重组质粒构建正确,能在COS-1细胞内表达,表达产物能与抗MOMP单克隆抗体特异性结合。结论:成功构建E型沙眼衣原体MOMP真核表达质粒pVAX1-MOMP,并在真核细胞内获得表达。

Identifiler^TM系统在单亲血缘关系鉴定中的突变观察与分析

微卫星（STR）基因座是一类广泛存在于真核生物基因组的短串联重复序列，因其高度多态性和在遗传过程中遵循孟德尔遗传定律等特点，现在被广泛用于个体识别及血缘关系鉴定中。根据孟德尔遗传定律，子代的遗传基因一半来自母亲，一半来自父亲，在进行父、母、子女三联体鉴定中，可存在子女与父母之间的基因差异．表明可能存在突变。在此对单亲血缘关系鉴定的890案例分析，15例有一个STR基因座不符合遗传规律，增加母亲进行检测，以期了解点突变对血缘鉴定结果的影响。

HPV16L1-E7蛋白疫苗诱导小鼠产生抗体及细胞免疫应答的研究

目的 :探讨嵌合性病毒样颗粒HPV1 6L1 E7蛋白疫苗接种于动物体内诱发体液和细胞免疫反应的能力。方法 :以本室构建的HPV1 6L1 E7嵌合蛋白疫苗腹腔注射免疫BALB/c小鼠 ,在初次免疫后 ,分别于第 3、4、5周采血ELISA检测特异性抗体的产生。并耳皮下注射HPV1 6L1蛋白 ,检测特异性DHT反应。在末次免疫 2周后 ,取小鼠脾细胞 ,用HPV 1 6L1 E7蛋白刺激 ,检测T细胞增殖反应及血清IFN γ水平。结果 :HPV1 6L1 E7蛋白疫苗免疫小鼠可有效产生HPV1 6L1抗体及特异性DTH反应 ,加强免疫后 ,抗体水平升高 ,两者水平均高于对照组 (P <0 .0 1 )。HPV1 6L1 E7嵌合蛋白疫苗免疫后取小鼠脾细胞 ,在特异性HPV1 6L1 E7蛋白抗原刺激下 ,特异性T淋巴细胞明显增殖。被免疫小鼠血清中出现高水平IFN γ。结论 :嵌合病毒样颗粒HPV1 6L1 E7蛋白可诱导小鼠产生高滴度抗体、HPV1 6L1特异性TDH参与的超敏反应及细胞免疫应答的细胞因子 。