抗凝血因子蛋白C系统的生理及应用前景

在机体内，抗凝系统和凝血系统处于动态平衡，当凝血系统被激活占优势时，则出现血栓性疾病。目前，血栓性疾病是致死率最高的常见病，因此对抗凝功能的研究引起了医者的广泛的关注。在抗凝生理功能中发挥重要作用的是血液中的抗凝因子，主要有3个体系：抗凝血酶、蛋白C系统和组织因子途径抑制物。

PAgVR对某些类型疾病患者血小板聚集功能影响的观察

血小板聚集蛇毒试剂(Platelet aggregation Venom Reagent,简称PAgVR)是广州蛇毒研究所研制的一种新型血小板聚集诱导剂。本文探讨了该试剂对健康成人、血液高凝及低凝性患者血小板聚集功能的影响,与目前临床上常用的血小板诱聚剂ADP时行了比较,提出了临床该试剂诱导血小板聚集的最佳剂量。为该试剂在临床上的广泛使用提供了依据。

小剂量茶碱对支气管哮喘患者外周淋巴细胞PAF受体mRNA表达的影响

目的了解茶碱对支气管哮喘患者血小板活化因子（ＰＡＦ）受体ｍＲＮＡ表达的影响。方法采用逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术检测了支气管哮喘患者及健康成人外周淋巴细胞ＰＡＦ受体ｍＲＮＡ的表达水平，探讨了小剂量茶碱对哮喘患者外周淋巴细胞ＰＡＦ受体ｍＲＮＡ表达的影响。结果（１）被检测的２０例健康成人中只有８例其外周淋巴细胞ＰＡＦ受体的ｃＤＮＡ可被扩增出来，而被检测的２１例哮喘患者均可获得ｃＤＮＡ片断；（２）服用小剂量茶碱１ｗｋ后，哮喘患者ＰＡＦ受体ｍＲＮＡ表达量（以“闪烁计数ｍｉｎ－１”表示，下同）与给药前的表达量相比无明显变化（Ｐ＞０．０５），服用２ｗｋ后，哮喘患者ＰＡＦ受体ｍＲＮＡ表达量由给药前的８６４０８±７４６２减少至６８９２７±５８８６（Ｐ＜０．０５），服用３ｗｋ后减少至５６７２０±４８６６（与给药前比较，Ｐ＜０．０１），接近健康人的表达量４９６８８±５４３８。结论连续服用小剂量茶碱可抑制外周淋巴细胞ＰＡＦ受体ｍＲＮＡ的表达。

CaN-NFATc3途径在大鼠腹主动脉球囊扩张术后再狭窄中的作用

目的研究钙调神经磷酸酶(CaN)及其下游活化T细胞核因子(NFATc3)在球囊扩张术后再狭窄中的作用,为防治血管再狭窄提供新的理论依据。方法雄性SD大鼠随机分为假手术组(n=12)、球囊组(n=12)、环孢菌素(Cs A)组(n=12)。球囊组大鼠用球囊扩张术损伤腹主动脉;Cs A组大鼠从手术前3d至实验结束,每天灌喂Cs A12.5 mg/(kg.d)-1。球囊损伤术后30 d取材,血管组织作苏木素—伊红(HE)染色、免疫组化检测CaN在血管壁中的水平,光学显微镜观察病理学改变;Rea1 time PCR技术检测血管壁组织中CaN、NFATc3的m RNA表达;Elisa法测定血清MCP-1水平。结果球囊损伤后血管壁出现新生内膜,且厚度不均;Cs A组与球囊损伤组相比较内膜增生、内膜/中膜厚度明显减轻(P<0.05)。与假手术组相比,球囊损伤组血管壁组织CaN蛋白及m RNA表达均明显升高、NFATc3的m RNA表达显著增加,血浆炎症因子MCP-1水平也升高(P<0.05)。Cs A组上述各项指标均显著低于球囊损伤组(P<0.05)。结论 CaN-NFATc3途径参与大鼠球囊损伤术后再狭窄的发生;Cs A通过抑制该通路减轻再狭窄的形成。

蛇毒蛋白C激活剂的活化蛋白C特性及影响因素的探讨

目的:研究蛇毒蛋白C激活剂(PCA-SV)活化蛋白C的特性,探讨可能影响PCA-SV作用的实验条件.方法:分别采用APTT法和CBS02.46发色底物法,研究PCA-SV的作用特点,探讨PCA-SV在不同实验条件下的抗凝活性及酰胺酶活性.结果:PCA-SV是蛋白C特异性激活剂,可特异性地作用于蛋白C,使后者表现抗凝和酰胺酶活性.PCA-SV的最适pH值为6.0～7.0,最适温度为37～40℃,肝素、枸橼酸钠等抗凝剂及Na+、K+、EDTA等不影响其活性.结论:PCA-SV是一种效价较高、特异性强、影响因素少的蛋白C活化剂.

中华眼镜蛇毒组份Ⅲ的药代动力学及组织分布研究

目的 :观察中华眼镜蛇 (Najanajaatra)蛇毒组份Ⅲ在兔体内的药代动力学过程和在小鼠体内的分布状况。方法 :用氯胺 -T法对眼镜蛇毒组份Ⅲ进行碘化标记 ,用放射性核素示踪动力法检测血液中的药物浓度 ,以放射性参与量 (脏器与血液放射比 )的比值作为组份Ⅲ在组织中分布的依据。结果 :兔静脉注射眼镜蛇毒组份Ⅲ 75、15 0和 30 0 μg/kg 3个剂量后 ,快分布相半衰期T1/2 α为 39 6 - 4 2 5min ,慢分布相半衰期T1/2 β为 16 8- 17 3h ,消除相半衰期T1/2 γ为 2 1 7- 2 2 1h。小鼠尾静脉注射 [12 5Ⅰ ]-组份Ⅲ后 ,2h及 4h放射性参与量大于 1的器官为肝脏、肾脏、肺脏、心脏和肌肉 ,其中以肾脏分布最高 ,且 4h放射性参与量高于 2h。结论 :兔静脉注射组份Ⅲ 3个剂量后 ,血药 -时间曲线经 3P87药动学程序拟合符合三房室模型特征 ,3个时相的半衰期各剂量组之间无显著差异 ,曲线下面积 (AUC)与剂量成正比 ,表明药物在兔体内的分布和消除为一级线性动力学过程。小鼠静注组份Ⅲ后 2h ,以肾脏分布最高 ,肝脏与肺脏的放射性参与量也较高 。

眼镜蛇毒组份在动物体内外的抗氧化作用研究

目的 :以大鼠组织匀浆及红细胞为材料 ,研究中华眼镜蛇毒组份F和H的抗脂质过氧化作用 ;探讨组份F/H对小鼠体内抗氧化酶活性的影响。方法 :以MDA为指标 ,观察组份F/H对组织匀浆体外脂质过氧化及红细胞自氧化溶血体系脂质过氧化产物MDA生成量的影响 ;观察组份F/H对邻苯三酚自氧化产生的O ·2 及Cu2 + VitC自由基产生系统产生的·OH的清除作用 ;连续 15天腹腔注射组份F/H ,测定小鼠体内SOD、CAT的活性。结果 :组份F/H均能抑制红细胞自氧化 ,显著减少红细胞自氧化过程中MDA的含量 ;组份F/H均可抑制正常大鼠心、肝、脑组织匀浆体外过氧化脂质生成 ,并能对抗Fe2 + Cys激发的过氧化脂质生成增加 ;组份F/H均能清除超氧阴离子 (O ·2 )和羟自由基 (·OH) ,组份H的作用更强 ;组份F/H均能不同程度地增加小鼠体内多种抗氧化酶的含量。结论 :组份F和H具有一定的抗氧化作用 ,能直接清除活性氧自由基 ,提高SOD的活性。

用蛇毒诱聚剂检测肝硬化及糖尿病患者血小板聚集功能

用蛇毒诱聚剂检测肝硬化及糖尿病患者血小板聚集功能林振桃，赵路宁，管锦霞，余清声（广州蛇毒研究所，广州５１０１８２）许浦生（广州医学院第二附属医院）尹松梅（中山医科大学附属孙逸仙纪念医院）关键词蛇毒诱聚剂，血小板聚集，肝硬化，糖尿病血小板功能检测对正确...

蛇毒蛋白C激活剂实验条件及稳定性的探讨

目的 探讨可能影响蛇毒蛋白 C激活剂作用的实验条件和该试剂的稳定性。方法 分别采用APTT法和 CBS0 2 .46底物法 ,检测蛇毒蛋白 C激活剂在不同实验条件下的抗凝活性及酰胺酶活性。结果 蛇毒蛋白 C激活剂的最适 p H值为 6.0～ 7.0 ,最适温度为 37～ 40℃ ,肝素、枸橼酸钠等抗凝剂及 Na+ 、K+ 、EDTA等不影响其活性 ,SDS则显著抑制其生物学活性。该试剂溶液剂型在室温下或 4℃中 4w内效价无变化 ,冻干剂型则在 2 y内效价无明显变化。结论 蛇毒蛋白 C激活剂是一种效价较高、稳定性较好、影响因素少的蛋白

老年糖尿病肾病患者血浆差异蛋白的表达

目的探讨老年糖尿病肾病(DN)与健康人群血浆差异蛋白的表达。方法选取老年DN患者10例(试验组),同期查体健康人群10例(对照组),采用荧光差异双向凝胶电泳(2D-DIGE)检测老年DN患者及健康志愿者血浆蛋白质组的表达情况,以差异表达1.5倍为截断值挑选蛋白质斑点并行质谱分析。结果应用老年DN患者及健康志愿者血浆成功构建差异表达双向凝胶电泳图谱,并分析筛选出33个差异表达斑点,通过质谱分析数据库比对鉴定出6种差异表达蛋白。结论 2D-DIGE技术可有效筛选老年DN相关特异蛋白,为进一步筛选DN血清标志物提供依据。

眼镜蛇毒组分C对小鼠实验性肝癌细胞生长影响的探讨

ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠腹水型肝癌细胞与眼镜蛇毒组分Ｃ在无菌条件下混合后接种于昆明种小鼠右前肢腋下，在２５℃条件下饲养１２天。结果表明，组分Ｃ能明显抑制小鼠肝癌细胞的生长（ＩＣ５０为５９．０８μｇ／ｍｌ），当肝癌细胞膜被人为造成损伤时，组分Ｃ对其生长的抑制作用则显著增强（ＩＣ５０为６．７２μｇ／ｍｌ）。此外，组分Ｃ能显著延长荷瘤小鼠的生存时间。对体外培养的小鼠肝癌细胞，组分Ｃ也具有很强的杀伤作用，且这种杀伤作用受组分Ｃ的浓度、组分Ｃ与肝癌细胞孵育的时间及孵育的温度的影响。病理组织检查发现，给组分Ｃ后，镜下可见肝癌细胞生长受到明显抑制，肝癌细胞未向皮肤及附件浸润。

中华眼镜蛇毒组分F/H对大鼠心肌细胞缺氧-再给氧损伤的作用探讨

以 L aarse方法建立大鼠心肌细胞缺氧 -再给氧模型 ,缺氧缺糖 60 min,再给氧 1h,探讨组份 F和 H对实验性心肌细胞缺血再灌注的保护作用。实验结果显示 ,缺氧后心肌细胞成活率显著减少 ,心肌释放 LDH含量显著增加 ,细胞膜流动性下降 ,缺氧再给氧后上述各指标改变加剧。组份 F和 H能明显提高心肌细胞成活率 ,减少 L DH的释放 ,增加细胞膜流动性 ,减少心肌细胞膜的损伤 ,实验结论 ,组份 F和 H有明显抗心肌细胞缺氧 -再给氧损伤的作用 ,尤以组份 F作用更显著。

蛇毒蛋白C激活组份的作用机制研究

目的 研究蛇毒蛋白 C激活组份 F6.3 .2对蛋白 C的激活机制。方法 以 Ba Cl2 吸附血浆和纯化蛋白 C为作用底物 ,采用发色底物法测定蛇毒组份 F6.3 .2对蛋白 C的特异性激活作用 ,同时采用 SDS-PAGE测定该组份对蛋白 C的激活机制。结果 F6.3 .2没有直接作用发色底物使之生色的能力 ,它对 Ba Cl2 吸附血浆不表现生色反应能力 (与对照组相比 P>0 .0 5 ) ,而对纯化蛋白 C则表现出很强的生色反应能力 (与对照组 、对照组 相比 P<0 .0 1)。SDS-PAGE结果表明 ,F6.3 .2与纯化蛋白 C作用后的混合物 ,由两条链组成 ,一条链分子量为 19KDa,与纯化蛋白 C的轻链相同 ,另一条链分子量为 5 9.5 KDa,为纯化蛋白 C重链与 F6.3 .2的分子量之和 ,表明 F6.3 .2已结合到纯化蛋白 C的重链上。 结论 蛇毒蛋白 C激活组份 F6.3 .2对蛋白 C有特异性激活作用 ,它激活蛋白 C的可能机制是通过结合于蛋白 C的重链 ,形成 F6.3 .2 -蛋白 C复合物 ,引起蛋白 C变构 ,从而将蛋白 C激活为活化蛋白 C。

国产蝮蛇毒蛋白C活化组份的分离提取及生物学活性鉴定

目的：从国产蝮蛇毒中分离提取蛋白C活化组份。方法：以江浙蝮蛇毒为材料，经DEAE－SephadexA－50、CM－SephadexG-25二次柱层析，分离提取蛋白组份，并用KlPTT法及发包庇物法检测其抗凝活性及酰胺酶活性。结果：经二次柱层析，分离出了FⅥ-Ⅲ蛋白组份，经生物学活性鉴定表明，该组份具有强烈的抗凝血活性及酰胺酶活性，同时观察不同浓度FⅥ-Ⅲ组份对正常血浆KFPTT值及A405值的影响，发现KPTT值随FⅥ-Ⅲ组份浓度的增加而升高，两者呈正相关，A405值也与该组份有显著量效关系，表明我们分离提取的蛇毒组份FⅥ-Ⅲ具有抗凝活性，并且该活性与蛋白C的活化有关。

中华眼镜蛇毒组份M抑制血小板聚集作用机制初探

探讨中华眼镜蛇毒组份Ｍ抑制血小板聚集作用机制；方法：运用卵磷脂法、剩余可凝纤维蛋白原法、纤维蛋白平板法等分别测定了中华眼镜蛇毒组份Ｍ中磷脂酶Ａ_２（ＰＬＡ_２），纤维蛋白原溶解酶及纤维蛋白溶解等与血小板聚集相关的酶活性，并运用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析了组份Ｍ对血小板内细胞骨架蛋白的影响；结果：组份 Ｍ不含 ＰＬＡ_２活性，无纤维蛋白（原）溶解酶活性，亦无ＡＤＰ酶和 ５’－核苷酸酶活性，不影响正常人血浆乳酸脱氢酶的含量，但对ＡＤＰ诱导的血小板细胞内肌动蛋白微丝聚合物的形成有明显抑制作用；结论：中华眼镜蛇毒组份Ｍ对血小板聚集所依赖的血小板内细胞骨架系统的功能有抑制作用。

腹主动脉狭窄致大鼠左室肥大后心脏射血功能及神经肽Y受体亚型变化

目的:观察压力负荷型心肌肥大大鼠左室射血功能及其神经肽Y(NPY)受体亚型(Y_1、Y_2、Y_4和Y_5)的表达变化。方法:腹主动脉缩窄法建立大鼠压力过负荷心肌肥大模型,测量全心和左心室的重量;颈总动脉插管检测左心室血流动力学;IE33彩超仪测量左室壁厚度、内径、容积,以及左室射血功能相关指标;荧光定量PCR法检测左心室组织匀浆中NPY各受体亚型mRNA的表达。结果:与假手术组相比,腹主动脉缩窄大鼠全心/体重、左室/右室均明显增高(P<0.05),左室内压力峰值(LVSP)、左室等容收缩末期压力上升最大速率(+dsp/dt_(max))和左室舒张期压力下降最大速率(-ddp/dt_(max))明显增高(P<0.05)。M型超声心动图显示,腹主动脉缩窄大鼠舒张末期室间隔厚度(IVSd)、收缩末期室间隔厚度(IVSs)、舒张末期左室后壁厚度(LVPWd)以及收缩末期左室后壁厚度(LVPWs)也较假手术组显著增加(P<0.05);通过超声推算出的左室质量,与实际测得的数值高度相关(r=0.997,P<0.05);心输出量(CO)下降至假手术组的55%(P<0.01)。另外,与假手术组相比,压力负荷型肥大心肌Y_1、Y_2、Y_4和Y_5受体的表达均显著减少(P<0.05)。结论:压力负荷导致左心室明显肥厚,收缩和舒张功能增强但心输出量降低;肥厚心肌中NPY受体各亚型表达量均显著降低。

^(125)I标记眼镜蛇毒组分Ⅲ在小白鼠体内的分布和药代动力学研究

目的：探讨眼镜蛇毒（Ｎａｊａ ｎａｊａ ａｔｒａ）蛇毒组分Ⅲ在小鼠体内的分布状况和在兔体内的药代动力学过程。方法：用氯胺－Ｔ法对眼镜蛇毒组分Ⅲ进行１２５Ｉ标记，用放射性核素示踪动力法检测血液中的药物浓度，以放射性参与量（脏器与血液放射比）的比值作为组分Ⅲ在组织中分布的依据。结果：小鼠尾静脉注射１２５Ｉ－组分Ⅲ后，２ｈ及 ４ ｈ放射性参与量大于 １的器官为肝脏、肾脏、肺脏、心脏和肌肉，其中以肾脏分布最高，且 ４ ｈ放射性参与量高于２ｈ。兔静脉注射眼镜蛇毒组分Ⅲ７５、１５０和３００μｇ／ｋｇ三个剂量后，快分布相半衰期Ｔ１／２α为３９．６～４２．５ｍｉｎ，慢性分布相半衰期Ｔ１／２β为１６．８～１７．３ ｈｒ，消除相半衰期Ｔ１／２γ为２１．７～２２．１ｈｒ。结论：小鼠静注组分Ⅲ后２ｈ，以肾脏分布最高，肝脏与肺脏的放射性参与量也较高，尿中含量很高。兔静脉注射组分Ⅲ３个剂量后，血药－时间曲线经３Ｐ８７药动学程序拟合符合三房室模型特征，三个时相的半衰期各剂量组之间无显著性差异，ＡＵＣ与剂量成正比，表明药物在兔体内的分布和消除为一级线性动力学过程。

hBcl-2和hVEGF_(165)双基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的将hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测目的基因的表达及表达产物的生物学效应。方法贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞;重组腺病毒转染BMSCs,用PCR法验证目的基因mRNA在间充质干细胞中的表达;用ELISA及Western Blot检测双基因在转染后细胞的蛋白表达量;用MTT法及Annexin V-PE/7-AAD法分别观察对转染后BMSCs增殖及凋亡的影响。结果大鼠BMSCs分离纯化成功。在mRNA水平,转染后的BMSCs可表达这两个外源基因;转染后细胞培养上清液hVEGF165峰浓度达到(924.3±56.5)pg/mL,多个时间点与对照组相比,浓度差异有统计学意义(P<0.05);Western Blot也检测到转染后细胞Bcl-2蛋白表达量明显比对照组增加(P<0.05)。MTT比色法观察到,转染细胞分泌的hVEGF165上清液可促进BMSCs的增殖(P<0.05);用Annexin V-PE/7-AAD检测转染后间充质干细胞的凋亡率下降,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论转染重组腺病毒载体的BMSCs能够表达hBcl-2及hVEGF165,并且表达产物具有生物学效应。

hBcl-2和hVEGF_(165)双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续基因转染和动物实验提供实验基础。方法通过RT-PCR从A549细胞中分别获得hBcl-2和hVEGF165基因片段,并克隆到pMD-19T载体。将目的基因hBcl-2、IRES元件和hVEGF165依次定向克隆到腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV上。线性化重组穿梭质粒后通过电穿孔转化含有腺病毒骨架质粒pAd-easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。脂质体转染线性化的重组腺病毒载体质粒于HEK293细胞以包装制备重组腺病毒。重组腺病毒经PCR鉴定之后进一步扩增、纯化。通过荧光计数确定病毒感染滴度。结果克隆的hBcl-2和hVEGF165基因测序正确,酶切重组穿梭载体质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物,重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞3 d后观察到GFP的表达,重组腺病毒的PCR得到hBcl-2和hVEGF165基因的PCR产物,滴度测定为5×109pfu/mL。结论成功构建制备了高滴度的hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为联合基因治疗心肌梗死的研究提供实验基础。