荧光光度法测定重组人生长激素注射液中聚山梨醇酯20的含量

目的:建立荧光光度法测定重组人生长激素注射液中聚山梨醇酯20的含量。方法:利用 N-苯基-1-萘胺(NPN)能摄取溶液中的聚山梨醇酯20并产生荧光,以其荧光强度与浓度正相关的特性来测定聚山梨醇酯20的含量。同时考察该方法的影响因素,确定了最佳实验条件。结果:根据影响因素与荧光强度的关系确定了35℃、0.05%NPN 浓度反应5 min 的试验条件,该法的平均仪器精密度、方法精密度和板间精密度分别为2.0%,4.0%,5.0%,平均加样回收率为102.6%。本法测定的2批生长激素注射液结果,与企业采用的方法结果一致。结论:本法快速、简便、准确,可用于测定重组人生长激素注射液中聚山梨醇酯20的含量。

重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白质量标准研究

目的:建立重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(TNHH)的质控方法和质量标准。方法:采用抗凝血酶活性试验和抗白细胞黏附试验测定活性;通过胰蛋白酶消化分析该蛋白还原型肽图;利用RP-HPLC法和SEC-HPLC法分别测定有关物质和高分子蛋白质含量;其余检测项目均按《中华人民共和国药典》2005版三部相关规定进行。结果:用建立的方法分别对一批TNHH原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和现版《中华人民共和国药典》的要求。结论:建立的质控方法可有效地控制TNHH产品质量,并可用于TNHH原液及成品的常规检定。

人多药耐药基因1在CHO细胞中的表达及功能研究

目的:构建人多药耐药基因(MDR1)的真核表达载体,转染CHO细胞,研究MDR1基因在真核细胞中的表达及功能。方法:将MDR1全长基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),利用阳离子脂质体转染CHO细胞,RT-PCR检测MDR1转染阳性细胞,并用G418筛选稳定表达MDR1基因的细胞,通过测定细胞对Rh123的外排作用以及对阿霉素的耐受性确定MDR1基因在正常细胞中的功能。结果:酶切鉴定和测序结果证明构建的重组表达载体pcDNA-MDR1序列正确。RT-PCR分析以及荧光显微镜观察结果表明:该重组表达载体已在CHO细胞中有效转录并稳定表达。Rh123外排和MTT药敏实验结果显示:转染pcDNA-MDR1的CHO细胞对Rh123外排作用显著高于未转染的CHO细胞,并且转染后的CHO细胞对阿霉素的耐药性也有显著提高。结论:成功构建了稳定表达MDR1并具有多药耐药功能的细胞株,有望成为多药耐药性药物研究的细胞模型。

重组人胰岛素外源性DNA的荧光法测定

目的建立重组人胰岛素外源性DNA残留量的荧光检测方法,用于重组人胰岛素的质量控制。方法参照《中国药典》三部附录及相关资料方法,对样品的处理方法、测定方法等方面研究了外源性DNA残留的荧光法检测。从标准曲线、加样回收率、精密度、耐用性、重复性等方面进行了荧光法的方法学研究。结果建立了重组人胰岛素原料药中外源性DNA残留量的荧光检测方法,并进行了方法学验证。结论该方法具有简便、快速、重复性好等特点,可用于重组人胰岛素的外源性DNA残留量检定。

首批米非司酮国家对照品的研制

目的建立首批米非司酮国家对照品。方法采用红外光谱、紫外光谱、飞行时间质谱和核磁共振谱进行结构确证,反相高效液相色谱法和DSC法测定纯度,通过质量平衡法计算含量。结果确证了米非司酮原料的结构,并确定了首批米非司酮国家对照品的含量为99.5%。结论首批米非司酮国家对照品(批号:410003-201301)可作为米非司酮原料和相关制剂的鉴别和含量测定用对照品。

丹参酮ⅡA纳米制剂对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的:观察丹参酮ⅡA纳米制剂对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法:采用三动脉夹闭法制备大鼠全脑缺血再灌注损伤模型,以丹参酮ⅡA纳米制剂灌胃给药,观察丹参酮ⅡA纳米制剂对脑组织的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力和脑组织Na+-K+-ATPase活性水平的影响。做脑组织病理切片检查和透射电镜观察。结果:丹参酮ⅡA纳米制剂(25 mg/kg)能使脑组织MDA含量下降(P<0.01),SOD活性明显升高(P<0.05),Na+-K+-ATP活性显著上升(P<0.01),病理切片和透射电镜观察显示丹参酮ⅡA纳米制剂能在不同的水平上抑制细胞和线粒体的损伤。结论:丹参酮ⅡA纳米制剂对全脑缺血再灌注损伤具有很好的保护作用。

快速液相色谱在重组人胰岛素肽图分析中的应用

目的:探讨快速 HPLC 分析方法在重组人胰岛素肽图测定中的应用。方法:采用 Shimadzu Pack XR—ODS(3.0 mm×75mm,2.2 μm)色谱柱;流动相 A 为0.2 mol·L^(-1)硫酸盐缓冲液(pH 2.3)-乙腈(90:10),流动相 B 为乙腈-水(50:50),进行梯度洗脱。检测波长为214 nm;柱温50℃;流速0.8 mL·min^(-1)。结果:人胰岛素酶解样品的各个片段能够很好地分离,分析时间显著缩短。结论:本法简便、快速,经济,灵敏度高。可应用于重组人胰岛素肽图的测定。

门冬胰岛素外源性DNA残留量的荧光法检测

目的建立门冬胰岛素外源性DNA残留量的荧光检测方法,用于门冬胰岛素的质量控制。方法参照《中国药典》三部附录及相关资料方法,对门冬胰岛素外源性DNA残留的荧光检测法进行研究,确定检测方法的最适条件,并对方法的线性、加样回收率、精密度、耐用性、重复性等方面进行方法学验证。结果建立了门冬胰岛素原料药中外源性DNA残留量的荧光检测方法,并进行了方法学验证。结论该方法操作简便、准确快捷,且无需标准宿主DNA,可用于门冬胰岛素质量标准中外源性DNA残留量的检测方法。

门冬胰岛素宿主菌体蛋白残留检测的研究

目的建立门冬胰岛素酵母菌体蛋白残留量的检测方法,用于门冬胰岛素的质量控制。方法采用S.cerevisiae宿主蛋白含量酶免测定试剂盒,研究适宜的样品配制及测定方法,并从标准曲线、加样回收率、精密度、耐用性、重现性等方面进行方法学验证。结果该法在2～200ng/mL浓度范围内符合四参数回归曲线(r=1.000),精密度和加样回收率均能满足实验测定要求。结论该方法简单,快速,自动化程度高,可用于门冬胰岛素酵母菌体蛋白残留量的检测。

支持HCV 1b亚基因组复制的细胞模型的建立

目的建立一个稳定支持中国人群HCV1b亚基因组高效复制的体外细胞模型。方法构建中国人群HCV1b亚型亚基因组复制子质粒,通过体外转录的方法获得亚基因组复制子RNA,采用电穿孔技术把RNA转染到Huh-7.5.1细胞中,经过G418筛选含有HCV1b亚基因组的细胞集落。RT-PCR检测细胞集落中的HCV亚基因组以及Western blot检测细胞集落中的HCV蛋白的表达。用干扰素(IFN)处理含有HCV亚基因组的细胞,观察细胞中HCV RNA的变化。结果G418药物筛选得到了支持HCV1b亚基因组复制的细胞集落。RT-PCR检测有HCVR NANS4B的表达,Western blot检测有HCV的非结构蛋白NS5B的表达。IFN处理含有HCV复制子的细胞,HCV RNA水平明显降低。结论成功建立了支持中国人群HCV1b亚基因组高效复制的体外细胞模型,为进一步研究HCV致病机制、治疗药物筛选及疫苗方面的研究打下了基础。

不同亚型人SMYD3启动子转录活性比较

利用PCR方法克隆SMYD3两个亚型的启动子区域,并构建其荧光素酶报告质粒.转染COS-7细胞后,利用荧光素酶报告分析技术,对二者启动子的转录活性进行了检测和比较.结果显示:SMYD3亚型1启动子的转录活性要显著高于亚型2启动子,生物信息学分析提示其原因可能与含有转录因子E2F-1结合位点的串联重复序列有关.

我国已上市治疗用重组蛋白多肽类产品分析

目的:找出我国治疗用重组蛋白多肽类产品存在的不足,明确未来努力方向。方法:基于我国已上市治疗用重组蛋白多肽类产品批准数据进行统计分析和对比分析。结果:对我国已上市的重组蛋白多肽类产品的基本情况、技术代次、治疗领域等进行了回顾梳理。结论:我国重组蛋白多肽类药物在新一代产品的开发上,由于企业创新不足及技术落后,与国际先进水平的差距近年来在进一步加大。

我国已上市治疗用生物制品问题分析及监管建议

目的:对我国已上市治疗用生物制品现状及存在问题进行分析,并在此基础上从鼓励创新、系统构建注册法规等多个角度提出完善监管的建议。方法:基于对我国已上市治疗用生物制品批准情况的深度分析,通过专家咨询,提出建议。结果:治疗用生物制品产业发展迅速,在一定程度上满足了我国公众临床用药的需求,但仍与国际先进水平存在较大差距。结论:从鼓励创新、促进生物类似药发展、完善药品批准文号等方面提出建议。

我国已上市治疗用单抗类产品分析

目的:分析我国已上市治疗用单抗类产品存在的差距,明确努力方向。方法:基于我国已上市治疗用单抗类产品批准数据进行统计分析和对比分析。结果:对我国单抗类药物的发展历程、上市时间、批准品种以及我国已批准上市的单抗类药物与FDA单抗类药物的批准情况进行了对比梳理。结论:单抗类药物在生物技术制药中占有重要地位,并逐渐成为生物医药领域发展的主要方向。我国单抗类药物中国产品种与进口品种存在差距,整体上与FDA存在差距。但随着近年来的改革,发展潜力及势头良好。

我国已上市治疗用提取分离类和菌体制剂类产品分析

目的:分析我国已上市治疗用提取分离类和菌体制剂类产品存在的差距,明确努力方向。方法:基于我国已上市治疗用提取分离类和菌体制剂类产品批准数据进行统计分析和对比分析。结果:对我国已上市治疗用提取分离类产品中的血液制品和多组分生化药物以及菌体制剂类产品的批准数量、企业数量进行了梳理,并与FDA批准情况进行对比分析。结论:治疗用提取分离类和菌体制剂类产品都是早期的治疗用生物药物,血液制品目前仍发挥着重要的临床价值,但重复申报情况严重。多组分生化药物和菌体制剂重复申报情况很少,但在临床上应用很少。FDA批准的两类产品数量较少。

我国已上市治疗用生物制品整体情况分析

目的:梳理我国已上市治疗用生物制品的整体情况,提炼出存在的问题,为行业提供参考信息,同时为完善我国治疗用生物制品注册管理制度体系提供数据支持。方法:基于我国已上市治疗用生物制品的数据,进行统计分析和对比分析。结果:对我国已批准治疗用生物制品信息进行了整合,并从批准上市产品的发展历程、创新程度、技术类别等不同维度进行了全方位深入分析。结论:与发达国家相比,我国治疗用生物制品的研发和产业化相对较晚,市场规模较为有限,但增速显著高于全球水平。

气相色谱法测定利拉鲁肽中四种溶剂的残留量

目的:建立利拉鲁肽原料药中四种残留溶剂的测定方法。方法:采用顶空气相色谱法,色谱柱为DB-624(6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定液)的毛细管柱(30 m×0.53 mm×3μm);检测器为氢火焰离子化检测器(FID),检测器温度设定250℃;进样口温度为200℃;初始温度45℃保持5 min,以10℃/min速率升温至100℃,再以40℃/min升温至200℃,保持7 min;顶空平衡温度设定为80℃,平衡30 min。结果:在该色谱条件下,四种残留溶剂的分离效果良好,线性相关系数均大于0.99%;重复性、稳定性与耐用性试验中各溶剂测定结果良好;四种溶剂的检测限分别为0.174、0.019、0.400、0.005μg/ml,定量限分别为0.695、0.077、1.201、0.025μg/ml,方法检测灵敏度高;四种溶剂回收率均在92.0%~108.0%之间(RSD<10.0%,n=9)。结论:该方法操作简便、灵敏度高、重复性好,测定结果稳定可靠,可用于利拉鲁肽原料药中四种残留溶剂的测定。

HPLC法测定地特胰岛素有关物质及主要杂质鉴别

目的:探索和建立地特胰岛素的纯度分析测定方法,并对主要杂质进行鉴别。方法:采用RP-HPLC方法分离分析地特胰岛素的有关物质,使用Protronavi C4色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm,300),流动相A为0.2 mol·L-1硫酸钠缓冲液(pH2.3)-乙腈(82∶18),流动相B为水-乙腈(40∶60),洗脱梯度(0 min,35%B;45 min,67%B;65 min,67%B;66 min,35%B;80min,35%B),流速1.0 mL·min-1,检测波长214 nm,柱温45℃。同时收集该色谱条件下的最大杂质组分,利用LC-MS/MS方法进行鉴别。液质条件为:液相色谱分离采用Acquity UPLC BEH300 C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm),流动相A为含0.1%甲酸的水溶液,流动相B为含0.1%甲酸的乙腈溶液,30 min内B相由5%升至30%,流速为300 nL·min-1,洗脱时间为30 min。质谱离子源为纳升级电喷雾离子源,采用正离子模式检测。结果:建立的RP-HPLC纯度分析方法具有良好的方法学验证结果,能准确测定样品中的有关物质;LC-MS/MS鉴定了地特胰岛素中的最大杂质为A链第21位天冬酰胺的脱氨产物。结论:建立的RP-HPLC和LC-MS/MS方法可准确有效地对地特胰岛素有关物质进行定量测定和鉴别分析,可作为地特胰岛素的质量研究和质控分析方法。

地特胰岛素高分子蛋白质定性和定量分析

目的:探索和建立地特胰岛素高分子蛋白质的定性和定量分析测定方法。方法:采用Tricine SDS-PAGE凝胶电泳有效地分离地特胰岛素中的高分子蛋白质组分,确定高分子蛋白质的主要组成形式;采用分子排阻色谱法分离地特胰岛素单体以及高分子蛋白质,并对高分子蛋白质进行准确定量。结果:确定了地特胰岛素中高分子蛋白质的主要形式为二聚体和寡聚体,建立的分子排阻色谱法可准确地测定地特胰岛素中高分子蛋白质的含量,并考察了高分子蛋白质产生的主要因素以及国内外产品的高分子蛋白质含量。结论:建立的方法可快速有效地对地特胰岛素高分子蛋白质进行定性和定量分析,可作为地特胰岛素的质量研究和质控分析方法。

胰岛素注射液质量现状及相关标准研究

目的：为了解胰岛素注射液的质量现状及提高相关检验标准提供参考。方法：选取32批胰岛素注射液上市产品,根据本品法定检验标准（包括性状、鉴别、装量、可见异物、无菌及生物法测定效价）进行全检。另参照同类产品的法定检验标准,采用反相高效液相色谱法对其有关物质、含量及苯酚的量进行测定;采用高效液相分子排阻色谱法对其高分子蛋白质进行测定;采用原子吸收分光光度法对其锌含量进行测定。结果：按照法定标准进行检验,32批样品检验结果均符合规定。按照同类产品的法定标准进行检验,杂质A21脱氨胰岛素的测定结果为15.6%～39.2%,全部超过同类产品5.0%的限度标准;含量测定结果为93.2%～102.7%;高分子蛋白质含量测定结果为0.5%～0.6%;苯酚的质量浓度测定结果为2.34～2.51 mg/ml;锌含量测定结果为12.3～14.8μg/100 U。结论：胰岛素注射液现行法定检验标准缺少有关物质、含量测定等关键质控项目;相关上市产品高分子蛋白质、苯酚及锌含量控制较好;杂质A21脱氨胰岛素含量普遍偏高,胰岛素主峰的稳定性较差。