羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株对昆明小鼠的致病性研究

为研究羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株对昆明系(KM)小鼠的致病性,使用羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株分别对昆明小鼠进行毒力测定,观察临床和剖检症状,对死亡小鼠进行细菌分离培养,并对典型菌落进行形态、生化特性以及PCR鉴定。毒力测定结果显示CVCC55001对于昆明小鼠的最小致死剂量为9 CFU,CVCC55002对于昆明小鼠的最小致死剂量为11 CFU。感染羊链球菌死亡小鼠主要剖检症状为肝脏出血、肠道液化性坏死、脾脏肿大,病理变化为肝细胞出现大量坏死、肠道黏膜层广泛自溶、脾脏组织广泛坏死出血。本研究建立了羊链球菌CVCC55001、CVCC55002株的昆明小鼠攻毒感染模型,确定了最小致死剂量,对羊链球菌感染和致病性研究展开初步探索,为疫苗研究及评价提供了平台支撑。

羊败血性链球菌病灭活疫苗效力检验小鼠免疫攻毒法研究

为解决羊败血性链球菌病灭活疫苗现行规程中效力检验采用靶动物免疫攻毒法所存在的动物筛选困难、动物质量不稳定、经济花费高等问题,开展了实验动物免疫攻毒替代方法研究。以靶动物免疫攻毒法为基础,确定该疫苗的最小保护剂量和不保护临界剂量,并在确认小鼠品系后开展平行关系研究,从而筛选出在小鼠模型上能够体现疫苗差异的最佳攻毒剂量。结果显示:合格疫苗1/2稀释度为最小免疫剂量,1/4稀释度为不符合规定的临界剂量;KM小鼠为替代方法最合适的小鼠品系;最佳攻毒剂量为使用2 MLD混合菌液,对免疫组和对照组进行攻毒,对照小鼠全部死亡,免疫小鼠至少保护70%。本研究建立了羊败血性链球菌病灭活疫苗效力检验实验动物免疫攻毒替代方法,这将有助于提升该类疫苗效力检验的稳定性和可靠性,为羊败血性链球菌病防控提供有力支撑。

猪链球菌2型的主要毒力因子与先天性免疫逃逸机制

猪链球菌(SS)是一种重要的猪病病原体,能引起猪的高热、脑膜炎、败血症、关节炎和神经症状等。该菌有33个血清型,其中猪链球菌2型(SS2)流行最广、致病性最强,且存在感染人的风险,是一种重要的人兽共患病原菌,严重危害养猪业和公共卫生安全。目前已发现百余种SS2毒力因子,包括荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、溶血素、烯醇化酶、核酸酶、菌毛蛋白、H因子、透明质酸裂解酶、表面蛋白、超氧化物歧化酶和其他代谢和调节因子等。这些毒力因子不仅与致病性密切相关,还在细菌的定殖、入侵、传播和免疫逃逸过程发挥重要作用。先天性免疫应答是病原微生物入侵机体的第一道防线,可以非特异性识别并清除病原微生物。然而,SS2已经进化出多种逃避宿主防御的机制,如逃脱中性粒细胞胞外陷阱、逃逸补体反应、侵袭中枢神经系统、逃逸活性氧的杀伤作用、促进肽聚糖的N-脱乙酰化和逃逸自噬等。目前,SS2的防控多依赖于抗菌药物和疫苗免疫,了解SS2的免疫逃避机制对开发高效的疫苗和靶向药物具有重要意义。

施马伦贝格病的流行病学与综合防控

施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)是一种新型虫媒病毒,于2011年首次在德国被分离到,随后在欧洲牲畜中引起了大规模流行。该病毒主要造成牛、绵羊和山羊等反刍动物临床疾病,成年反刍动物感染后表现以腹泻、高热和产奶量下降为特征的短暂性疾病,妊娠动物感染后表现流产、早产或产死胎,新生动物感染后出现先天畸形。本文综述了施马伦贝格病的流行状况、流行病学特征以及诊断方法和疫苗研发进展情况,提出了SBV传入风险防范措施,以期为预防该病传入我国的生物安全防控策略制定提供参考。

副猪嗜血杆菌4型灭活疫苗攻毒菌株的筛选

为筛选副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)4型攻毒菌株,对8株HPS进行血清型鉴定,并绘制细菌生长曲线;用豚鼠攻毒实验对其中5个菌株进行毒力测定,同时记录发病豚鼠的临床症状和剖检病变。结果显示8个菌株均为HPS4型,确定了候选菌株的最佳扩大培养时间为8~10h,筛选出毒力最强的CVCC4355。本研究确定CVCC4355可作为HPS4型疫苗产品效力检验的攻毒菌株。

卡介菌多糖核酸对IBDV感染鸡的免疫活性研究

为了评价卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)在畜禽病毒性疾病中的作用及其诱导机体免疫的能力,建立了人工感染传染性法氏囊病(IBD)动物模型,通过检测免疫器官指数、IBDV抗体、外周淋巴细胞亚群、诱导干扰素和白介素水平等特异性和非特异性免疫指标,评估不同剂量BCG-PSN对IBDV感染鸡免疫功能的影响。结果显示:免疫器官脾脏指数和胸腺指数在注射BCG-PSN的初期出现上升趋势,而在注射BCG-PSN后期(15d)受试鸡外周血液CD4+/CD8+值显著提升;各BCG-PSN注射组的IBDV抗体滴度在试验初期明显提高;从注射开始,BCG-PSN就显示出其对IFN-γ、IFN-α和IL-2的显著提升效果。上述结果说明:BCG-PSN既能调节IBDV感染鸡的细胞免疫功能,又能调节机体的体液免疫功能,激活组织细胞释放包括IFN-γ、IFN-α和IL-2等多种细胞因子,以0.3mg·kg-1的注射剂量可获得良好的免疫效果。

5种大肠杆菌O抗原定型血清的制备

本研究以大肠杆菌参考菌株CVCC1369(O26)、CVCC3800(O153)、CVCC1489(O157)、CVCC3739(O159)、CVCC3807(O163)为菌种制备免疫抗原并免疫家兔,获得5种大肠杆菌O抗原定型原血清,而后制备多种吸收抗原以消除5种原血清的非特异性凝集素。通过微量凝集试验的方法,确定各血清的凝集价。最终确定了5种大肠杆菌O抗原定型血清的制备方法,为进一步改进大肠杆菌O抗原定型血清的制备工艺提供了思路和依据。

1株粗糙型布鲁氏菌诱导株RB71的生物学特性研究

目的通过研究1株粗糙型布鲁氏菌诱导株RB71的毒力及免疫效果,进一步验证其生物学特性,探讨其作为疫苗株的潜力。方法通过药敏片扩散法检测诱导株RB71对β-内酰胺类及非β-内酰胺类抗生素的耐受程度;通过对小鼠脾脏载菌量测定,评价诱导株RB71对感染小鼠的免疫保护率并确定其最小免疫剂量;利用小鼠感染模型进行毒力试验,比较诱导株RB71与亲本株的毒力差异。结果诱导后的布鲁氏菌RB71株与亲本株相比,对β-内酰胺类抗生素和非β-内酰胺类抗生素的敏感性未发生改变;诱导株RB71对感染小鼠具有一定的保护效果,最小免疫剂量为10^(9)CFU/只;诱导株RB71与亲本株相比毒力更小,安全性更高。结论本研究验证了布鲁氏菌诱导株RB71对抗生素的敏感性,其具有良好的免疫原性且具有较低的毒力,具备成为疫苗株的潜力。

慢病毒载体表达系统的研究进展

作为运载工具,慢病毒载体将插入的目的基因导入至宿主细胞内,目的基因由此可于宿主细胞内进行复制或表达,因其具有广阔的宿主范围且能更加有效地引起细胞感染而被视为常用的基因导入方式之一。本文围绕慢病毒载体的构成、慢病毒载体表达系统的优势及演变等,开展相关研究状况的系统综述。

4种牛分枝杆菌特异性基因PCR检测方法的比较与评价

牛分枝杆菌是严重危害养牛业的重要人兽共患病原微生物,PCR是检测该病原的有效手段之一。本研究通过筛选最佳的PCR检测方法,以期为临床监测牛分枝杆菌感染提供技术参考。针对牛分枝杆菌4种常见的特异性基因(16S rRNA、IS6110、IS1081和Mpb64)分别设计引物,通过温度梯度PCR法确定最适退火温度;采用牛分枝杆菌参考株核酸确定PCR最小检测限,同时运用牛分枝杆菌国内参考株、牛分枝杆菌国际参考株、禽分枝杆菌、胞内分枝杆菌、副结核分枝杆菌、羊种布鲁菌以及牛种布鲁菌进行特异性比较试验;最后运用人工模拟牛分枝杆菌感染组织样本(肺脏、淋巴结、奶样)比较不同PCR方法检测效果。4对引物以60℃为退火温度时均能检测分枝杆菌,其中IS6110、IS1081和Mpb64基因引物可以特异性检测牛分枝杆菌。IS6110和IS1081基因引物对牛分枝杆菌基因组的检测灵敏度最高,可达10^(-10) ng/μL;IS6110基因引物在肺脏和淋巴结中牛分枝杆菌检测灵敏度可达10~6 CFU/mL以上,而Mpb64基因引物对奶样中牛分枝杆菌的检测灵敏度可达10~2 CFU/mL。本研究筛选出相对适宜的牛分枝杆菌PCR检测方法,为牛结核病病原学检测和临床应用提供技术支持。

动物源细菌对β-内酰胺类药物耐药性的研究进展

目前,我国动物源细菌耐药风险形势十分严峻,细菌耐药性的问题已严重威胁畜禽产品质量安全,给人类健康造成安全隐患。本文对常见β-内酰胺类抗生素的应用状况和动物源细菌对该类药物耐药状况等进行概述,以期为动物源细菌性疾病综合防控及β-内酰胺类药物的合理使用提供依据。

微量凝集试验用大肠杆菌O50、O60、O117、O131定型血清的研制

为进一步完善中国大肠杆菌菌体微量凝集试验定型血清库,改良微量凝集试验用大肠杆菌O抗原定型血清的制备工艺,本试验选取大肠杆菌O50、O60、O117、O131血清型进行定型血清制备方法的探究。首先用大肠杆菌不同血清型的参考菌株制备灭活抗原,而后多次免疫家兔以采血获得粗血清,用微量凝集试验的方法确定不同粗血清的交叉凝集素及凝集效价,再通过交叉凝集素吸收法结合血清稀释法消除非特异性凝集,最终研制出特异性良好的微量凝集试验用大肠杆菌O抗原定型血清。本研究确定了大肠杆菌O50、O60、O117、O131定型粗血清的主要交叉凝集素,最终成功研制出特异性良好的微量凝集试验用大肠杆菌O50、O60、O117、O131定型血清共4种,凝集效价在1∶256至1∶2048之间,其中微量凝集试验用大肠杆菌O50、O60定型血清无交叉凝集素,为单因子定型血清,微量凝集试验用大肠杆菌O117、O131定型血清存在1~2种非特异性的交叉凝集素O14和O107。本研究作为大肠杆菌O抗原定型血清制备工艺摸索过程中的重要部分,为完善中国大肠杆菌菌体微量凝集试验定型血清库,进一步改良微量凝集试验用大肠杆菌O抗原定型血清的制备方法提供了重要理论依据。

磷酸替米考星在肉鸡体内的药代动力学研究

为了探讨磷酸替米考星在肉鸡体内的药物代谢动力学过程并阐明其药动学特征,本试验给受试鸡分别口服不同剂量,以及静脉注射一定剂量的10%磷酸替米考星可溶性粉,利用HPLC方法分析不同时间点受试鸡血浆中磷酸替米考星的药物浓度。试验结果显示,口服高(16 mg/kg)、中(8 mg/kg)、低(4 mg/kg)剂量的10%磷酸替米考星可溶性粉与对照药10%替米考星可溶性粉(7.16 mg/kg),4组药物投服受试鸡体内的药物浓度-时间曲线下面积(AUC)分别为5.616 3±0.958 4、2.608 2±0.266 5、1.471 6±0.086 9、2.331 4±0.195 6(μg/mL).h,与喂药量成正比,说明10%磷酸替米考星可溶性粉在鸡体内的药物动力学呈一级动力学过程;口服中剂量10%磷酸替米考星可溶性粉和对照药10%替米考星可溶性粉后,受试鸡体内的Cmax分别为(0.265 8±0.020 5)、(0.233 6±0.033 7)μg/mL,处于生物等效性范围之内(0.80～1.25),说明口服10%磷酸替米考星可溶性粉后,鸡体内替米考星的血药分布与口服对应量的对照药10%替米考星可溶性粉相类似,二者的差异不显著。试验结果表明,10%磷酸替米考星可溶性粉口服后吸收极为迅速,达峰快,消除缓慢。此外,静脉注射10%磷酸替米考星可溶性粉(5 mg/kg),所有试验鸡均迅速出现死亡,因此,临床不推荐使用磷酸替米考星静脉注射肉鸡。

多杀性巴氏杆菌类活疫苗活菌计数参考品的研究

为了研制多杀性巴氏杆菌类活疫苗活菌计数的参考品,以期更科学的评价活菌计数结果的有效性。制备一批猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗为参考品候选物,对其性状、纯粹、真空度、剩余水分进行检测,对其运输稳定性、均一性进行测定,组织协作标定对参考品候选物进行定值,用协作标定的方法统计参考品候选物24个月的保存期,将参考品应用于多杀性巴氏杆菌类活疫苗活菌计数的检验。结果表明,参考品的性状、纯粹检验、剩余水分和真空度测定均符合《中国兽药典》的规定,均一性试验结果显示,10瓶参考品候选物计数结果的变异系数为5.4%,小于10%,说明其均一性良好。协作标定的赋值范围为(4.2~5.6)×10^8 CFU/头份,保存期试验结果显示,参考品候选物在-70℃以下保存24个月菌数稳定。参考品的初步应用显示本参考品不仅可以为多杀性巴氏杆菌类活疫苗活菌计数提供参照物,而且可以用于控制多杀性巴氏杆菌类疫苗检验用马丁琼脂培养基的质量。

B型副鸡禽杆菌田间分离株的毒力及免疫原性研究

为探索分离自安徽省某大型白羽鸡场的1株B型副鸡禽杆菌的毒力及免疫原性,本试验测定了该菌对5~6胚龄SPF鸡胚及35~40日龄SPF鸡的毒力,并用该菌株制备免疫原,免疫35~40日龄SPF鸡,用攻毒的方法测定菌株的免疫原性,同时对本菌株制备的抗原及目前国内、国外市场上销售的鸡传染性鼻炎A型、B型、C型三价或二价灭活疫苗的免疫效力进行比较。毒力试验结果显示,本菌株对SPF鸡胚的最小致死剂量为110 CFU,对SPF鸡的最小发病剂量为5.5×10^(3) CFU。免疫原性试验结果显示,本菌株制备的抗原免疫鸡能有效抵抗本菌株的攻击,说明本菌株的免疫原性良好,而市场上销售的鸡传染性鼻炎三价/二价灭活疫苗免疫鸡均无法抵抗本菌株的攻击,说明市场上销售的疫苗对本菌株的保护效果较差,B型菌疫苗间的交叉保护效果不理想。本试验为B型鸡传染性鼻炎疫苗的研究提供参考和物质基础。

猪丹毒活疫苗活菌计数参考品的研究

为了更加客观、科学地评价猪丹毒活疫苗活菌计数检验结果,在活菌计数检验中引入了参考品。研制并标定了一批猪丹毒活疫苗活菌计数的参考品,从性状、纯粹性、均一性、加速稳定性、运输稳定性、剩余水分测定、真空度等方面对参考品进行了评价,并对参考品的保存期限进行了探索。结果显示:参考品的性状、纯粹性、活菌计数、剩余水分含量、真空度均符合《中国兽药典》中猪丹毒活疫苗质量标准。通过协作标定,对参考品赋值为每头份含活菌数为8.5×108~12.5×108 CFU。均一性检验变异系数分别为7%和6%。参考品在夏季和冬季由泡沫盒加冰袋的方式进行运输不超过48 h,计数结果稳定。对参考品的保存期进行探索,发现参考品于-70℃保存时可在18个月内保持稳定。表明猪丹毒活疫苗活菌计数参考品符合国家标准物质的要求,可应用于检验。

沙门氏菌马流产凝集试验抗原参考品的研制

为研制沙门氏菌马流产凝集试验抗原国家参考品,提高沙门氏菌马流产凝集试验相关试剂半成品和成品检验的准确性和可重复性,按照有关最新规定,在以往各批次沙门氏菌马流产凝集试验抗原参考品的制备和标定技术基础上,规范了该抗原参考品的制备方法 ;采用3种效价血清进行标定,监测其保存期内的稳定性,并将其应用于生产检验实践。结果表明,用该方法制备和标定的沙门氏菌马流产凝集试验抗原参考品效价稳定、品质良好,可作为一种国家参考品使用。

大肠杆菌O抗原定型血清标定用抗原的制备

为研制用于标定大肠杆菌菌体抗原(O抗原)单因子定型血清效价的抗原,以大肠杆菌参考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)为菌种,经条件优化确定了抗原制备的工艺。检测结果表明,当菌液调整至OD_(600 nm)值为0.147±0.026时,各型抗原的浓度为1×10~9CFU/m L,将其热处理后制备成反应抗原。按此吸光值各自制备3批抗原,3批抗原与血清的凝集价均分别一致,分别达到2^(11)(O2)、2^(12)(O7)及2~9(O74)。用180种大肠杆菌O抗原单因子定型血清对制备的抗原进行检测,制备的抗原仅与其对应型的血清发生特异性反应,与其余179种血清均不发生反应。研究结果显示,制备的抗原具有较好的稳定性及特异性,可以用于大肠杆菌菌体单因子定型血清效价的标定。

大肠杆菌菌体O抗原单因子定型血清的制备

为研制大肠杆菌菌体O抗原单因子定型血清,以大肠杆菌参考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)为菌种制备抗原免疫家兔,获得了定型原血清,并通过比较不同免疫程序及剂量优化了定型原血清的制备工艺。进而按照优化后的定型原血清制备工艺,以大肠杆菌参考菌株CVCC1343(O1)、CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1405(O64)、CVCC1414(O74)、CVCC1439(O100)、CVCC1442(O103)、CVCC1455(O116)、CVCC1466(O128)、CVCC3801(O154)为菌种制备抗原免疫家兔,获得了10种O抗原型定型原血清。将定型原血清分别与180种微量凝集试验抗原逐一反应,明确各原血清与非特异性抗原的交叉凝集价,通过用吸收抗原对原血清进行吸收及稀释的方法消除非特异性凝集,最终制备成大肠杆菌菌体O抗原单因子定型血清。血清质量评价结果表明,新制备的单因子定型血清性状为无色、淡黄色或黄色澄明液体,个别有少量絮状物;无菌生长;特异性良好;凝集效价为1︰2。研究结果显示,制备的大肠杆菌O抗原单因子定型血清具有较好的特异性,可以用于对临床分离大肠杆菌进行O抗原血清型鉴定。

猪丹毒杆菌C43005株的制备及检定

为研究猪丹毒杆菌C43005株的菌种特性,制备了一批猪丹毒杆菌C43005株并对菌种的真空度、剩余水分、形态、培养特性、生化特性、血清学特性、毒力、免疫原性等参数进行检定,重点对该菌种的毒力进行重复试验并对影响毒力的因素进行分析。结果表明,菌种的真空度、剩余水分、形态、培养特性、生化特性、血清学特性、免疫原性均符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》二〇〇〇版相关质量标准的规定,毒力试验结果明显受培养基质量和动物个体差异的影响。本研究可以为猪丹毒杆菌C43005株的制备和检定提供参考依据。