基于第二代测序技术兰州鲇线粒体基因组全序列测定与分析

研究采用高通量第二代测序技术,构建获得兰州鲇(Silurus lanzhouensis)线粒体基因组全序列,并对全序列特征和结构进行了分析。研究结果表明,兰州鲇线粒体基因组全序列长度为16523 bp,碱基组成具有高A+T低G+C含量的偏向性,具有脊椎动物典型的结构组成。13个PCG基因中存在2种启动子(ATG、GTG)、3种终止子(TAG、TAA和T或TA)。除t RNA-Ser^(AGN)基因二级结构中DHU臂缺失,其余21个t RNA基因可折叠成典型三叶草结构。12S rRNA二级结构由45个茎环结构组成4个结构域,16S rRNA由54个茎环结构组成6个结构域。含有关键序列标签的控制区(CR)可分为3个不同的结构域:终止序列区(TAS1、TAS2)、中央保守区(CSB-F、CSB-E和CSB-D)和保守序列区(CSB1、CSB2和CSB3)。非编码区含有一段保守的控制轻链复制起始的序列区(O_L)。基于线粒体基因组全序列和通用标签COX1基因标记可区分兰州鲇同其他鲇形目鱼类种质进化关系。

不同杂交组合猪肥育性能的比较研究

本试验通过对长×大(L×Y)、杜×长大(D×LY)、皮杜×长大(PD×LY)3个杂交组合猪的生长肥育、胴体品质及肉质性状进行研究,结果表明:PD×LY杂交组合的日增重、料肉比及屠宰率最优,日增重、屠宰率与L×Y组间差异显著(P<0.05);PD×LY的眼肌面积、后腿比例分别为48.09 cm2、34.23%,为3组合中最高,与L×Y组的差异显著(P<0.05),与D×LY组的差异不显著(P>0.05);D×LY组的肉色评分、嫩度测定结果最佳,组间差异显著(P<0.05);PD×LY组的失水率、熟肉率、嫩度最差,其中熟肉率、嫩度与其它组间差异显著(P<0.05)。综合评定:导入皮特兰猪的血液在提高了日增重、屠宰率、眼肌面积、后腿比例等性状的同时,却导致了肉质的下降;D×LY作为一个经典的杂交组合,生产性能总体稳定。

磁珠富集法筛选兰州鲇微卫星分子标记

兰州鲇（Silurus lanzhouensis）又名黄河鲶，隶属于鲇形目（Siluriformes）、鲇科（Siluridea）、鲇属（Silurus），是我国黄河中上游特有的大型经济鱼类。肉质细嫩、少刺、味道鲜美，具有很高的营养价值，俗有“黄河鲶鱼活人参”之称[1]。但由于过度捕捞、水利工程等因素，兰州鲇野生种群数量日益减少，已被《中国物种红色名录》列为濒危物种[2]。

合作猪肉质常规性状分析

对合作猪肉品理化特性、食用营养特性等肉质常规性状进行了测定与分析,结果表明:合作猪肉色鲜红,45 min内肉色值评分为3.44;肌肉大理石纹适中,系水力强;失水率和滴水损失均值分别为:11.05%、1.33%;剪切力值小,具有良好的肌肉理化特性.合作猪食用营养价值较高,脂肪含量、蛋白质含量测定均值分别为2.11%、21.09%;并富含多种人体必需的矿物质元素及微量元素,具有较高的研究与开发价值.

砷对兰州鲇组织中代谢酶活性及RNA和蛋白质含量影响

采用毒性试验方法,研究了安全浓度(1.288 mg/L)条件下亚砷酸钠(NaAsO2)对兰州鲇(Silurus lanzhouensis)脑、鳃、肝脏、肌肉4种组织中6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PDH)和乳酸脱氢酶(LDH)活性,以及RNA和蛋白质含量的影响。结果表明,染毒21d时,As(Ⅲ)可显著降低4种组织中G-6-PDH和LDH活性、RNA和蛋白质含量(P≤0.05)。撤毒后21d,除脑和肝组织中蛋白质含量未恢复到对照组水平(P≤0.05),肝脏中G-6-PDH活性超过了对照组水平(P≤0.05)外,其余各组织中G-6-PDH和LDH活性、RNA和蛋白质含量均可恢复到对照组水平(P>0.05)。以上结果表明,As(Ⅲ)对兰州鲇组织中代谢酶活性具有明显的抑制作用,可致组织细胞RNA损伤和可溶性蛋白质减少,但这种影响是可逆的,撤毒后一定时间内可恢复到正常水平。

放牧型合作猪生态特性的初步研究

对放牧型合作猪品种特性及其生物学特性和生态环境适应性进行研究,并探讨了放牧型合作猪品种形成与生态环境的关系。结果表明,放牧型合作猪是适应特殊生态环境的产物;不同性别生理生化指标无显著性(P>0.05)差异;不同生长阶段部分指标有显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)差异。研究显示放牧型合作猪对高寒草原气候具有较强的适应性。

合作猪肌肉胶原蛋白发育性变化及其与肉质关系的研究

对合作猪肌肉胶原蛋白特性及其与肉质的关系进行了研究.结果表明,随着月龄的增长,肌肉总胶原蛋白、可溶性胶原蛋白、不溶性胶原蛋白的含量均随之增加,而胶原蛋白溶解度出现下降趋势,从而使胶原蛋白变得坚硬,导致肌肉老化.肌肉总胶原蛋白、不溶性胶原蛋白和可溶性胶原蛋白含量分别与剪切力值呈极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)正相关;胶原蛋白与熟肉率呈极显著(P<0.01)正相关,而与肌肉水分含量呈极显著(P<0.01)负相关.

兰州鲇线粒体Cytb基因的克隆与序列分析

为克隆兰州鲇(Silurus lanzhouensis)线粒体Cytb基因全序列,根据欧洲鲇(Silurus glanis)线粒体基因全序列设计特异引物进行兰州鲇线粒体Cytb基因的PCR扩增,得到1138 bp兰州鲇线粒体Cytb基因序列。对兰州鲇和其他13种鱼的线粒体Cytb基因核苷酸和氨基酸序列之间进行同源性比较,结果显示具有较高的同源性,核苷酸同源性介于61.38%—91.12%,氨基酸同源性介于76.62%—95.52%。对兰州鲇、欧洲鲇、大口鲇(Silurus meridionalis)、鲇(Silurus asotus)、越南鲇(Silurus cochinchinensis)的Cytb基因之间进行碱基替代分析,结果显示兰州鲇Cytb基因与鲇之间替换率最低,值为8.87%,转换/颠换值为3.21;与越南鲇之间替换率最高,值为14.41%,转换/颠换值为1.83。对本文克隆的兰州鲇Cytb基因与王庆容等测定的兰州鲇线粒体Cytb序列进行序列差异分析,结果显示两者之间替换率为11.16%,存在127个变异位点,转换/颠换比为4.08,遗传距离为0.1230。由NJ法基于兰州鲇和其他13种鱼的Cytb基因序列构建的系统进化树,结果显示与传统的分类地位基本吻合。

猪SLC6A14 c . 1483G>A多态性与脂肪沉积和生长性状相关性研究

SLC6A14基因是影响猪脂肪沉积的候选基因,本研究利用白色杜洛克×二花脸资源家系祖代的17头二花脸母猪和2头白色杜洛克公猪的池DNA,通过直接测序法在猪SLC6A14基因第10外显子1483 bp处检测到1个G→A错义突变,导致相应编码的氨基酸由缬氨酸转换成异亮氨酸。采用引物创造性酶切法,通过HpyCH4 IVPCR-RFLP判型技术,检测了白色杜洛克×二花脸资源家系3代623个个体在此错义突变位点的多态性,并开展了与脂肪和生长性状的相关性分析。结果表明:该突变位点与腹脂重和46日龄个体重存在显著的相关性。

基于胡鲇科和鲇科ESTs序列初步筛选兰州鲇EST-SSR分子标记

利用SSRHunter软件对现已公布的鲇形目（Siluriformes）中胡鲇科（Clariidae）和鲇科（Siluridea）共2002条EST（Expressed Sequence Tag）序列筛选兰州鲇（Silurus lanzhouensis）微卫星标记,并分析其序列丰度和分布特征。结果共发现209个微卫星序列,占整个ESTs数据库的10.44%;其中三碱基重复序列数量最多,占ESTs数据库中发现微卫星序列总数的35.62%;二、四、五、六碱基重复序列分别占微卫星序列总数的28.31%、25.57%、7.76%、2.74%。根据侧翼序列,设计125对引物,随机选取58对进行扩增鉴定及多态性筛选。结果显示29对引物能稳定扩增,16对引物具有多态性,每个位点等位基因数2-7个（平均3.75）,观测杂合度（Ho）0.133 2-0.732 2（平均0.405 1）,期望杂合度（He）0.198 2-0.848 3（平均0.560 2）,多态信息含量（PIC）0.124 1-0.794 5（平均0.506 5）。研究表明,借用已有鲇形目鱼类ESTs数据库筛选到的兰州鲇微卫星标记质量较好,可为兰州鲇种质资源保护、微卫星连锁图谱构建、经济性状的QTL定位及分子标记辅助育种奠定基础。

兰州鲇(CAG)_n、(GATA)_n微卫星文库构建与鉴定

应用磁珠富集法构建兰州鲇（ Silurus lanzhouensis） CAG重复和GATA重复的微卫星文库，并分析其序列特征。兰州鲇基因组DNA经MseI酶切，选取200～800 bp的片段与生物素标记的探针（CAG）8和（GATA）6杂交，捕获到含有微卫星序列的目的DNA片段连接到pMD19-T载体，转化到大肠杆菌DH5α菌株中构建微卫星富集文库，经PCR检测筛选出阳性克隆进行测序。从126个阳性克隆中随机选取96个进行测序，获得59个微卫星序列（ GenBank登录号： KJ545973～KJ545998， KJ598088～KJ598120）。其中完美型31个（52.54％）、非完美型20个（33.9％）、混合型为8个（13.56％）。根据侧翼序列，成功设计48对引物，选取25对微卫星引物在10个个体进行扩增与多态性筛选，共获得10对多态性引物。结果表明，经优化的磁珠富集法能够高效地获得兰州鲇微卫星标记，这些标记将为兰州鲇种质资源保护、微卫星连锁图谱构建、经济性状的QTL定位及分子标记辅助选育奠定基础。

运用灰色关联度法评价皮特兰猪在商品猪生产中的种用价值

目的:以评价皮特兰在商品猪生产中的种用价值。方法:本文运用灰色关联度法对含皮特兰血的5个组合杂交猪(皮杜、皮杜B、皮杜大、皮杜长大和杜长大)的瘦肉率、熟肉率、大理石纹评分、肉色评分、pH值、失水率和嫩度等7个肉质指标按等权关联度进行了综合评定。结果:"皮杜B"肉质最优,其次是"杜长大"和"皮杜长大"。结论:说明以提高瘦肉率为目标利用"皮杜"公猪,"皮杜长大"四系配套组合和"皮杜"公猪与培育品种杂交肉质最佳。

猪SLC6A14g.21063G>T多态性与脂肪和生长性状相关性研究

SLC6A14是影响人肥胖症的功能基因之一。利用白色杜洛克×二花脸资源家系F0代的17头二花脸母猪和2头白色杜洛克公猪的DNA池,通过直接测序方法在猪SLC6A14基因第21063号核苷酸处搜寻到1个G→T突变(SLC6A14g.21063G>T)。使用PacIPCR-RFLP技术检测了白色杜洛克×二花脸资源家系3代637个个体在此突变位点的多态性,并分析了与脂肪和生长性状的相关性。结果表明:该突变位点与腹脂重和46日龄个体重存在极显著相关性。

合作猪背最长肌肌内脂肪酸组成及含量的研究

试验选取放牧饲养的合作猪25头,按6月龄、12月龄、18月龄3个阶段分别屠宰后取背最长肌,经甲酯化后用气相色谱法测定肌内脂肪酸含量.结果表明:合作猪肌肉脂肪酸组成主要是C16和C18脂肪酸,以棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)和亚油酸(C18∶2)为主.另外,十三酸(C13∶0)、十五酸(C15∶0)、十七酸(C17∶0)、十九酸(C19∶0)含量相对较高,占总脂肪酸的10%左右.随月龄增长,不饱和脂肪酸有下降的趋势,而饱和脂肪酸则有递增的趋势;多聚不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率达到或超过了人类营养学认为的最佳比例(0.45).

宁夏赤眼鳟人工繁育及苗种培育试验

赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus),属硬骨鱼纲,鲤形目,鲤科,雅罗鱼亚科,赤眼鳟属,俗称野草鱼、红眼鱼,国内各大水系均有分布[1]。赤眼鳟具有生长快、适应性强、抗病性强等优点[2],其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富,深受消费者青睐,是黄河优质土著经济鱼类之一,也是近年来国内技术研究与养殖开发领域的重要经济鱼类之一。

大鼻吻鮈胚胎发育特征和初孵仔鱼形态观察

【目的】为建立大鼻吻鮈(Rhinogobio nasutus)规模化人工繁育技术,并为其生产性育苗工艺和种质资源保护等提供科学依据。【方法】采用野生的大鼻吻鮈经人工催产获得受精卵,记录并分析其胚胎及仔鱼发育各时期的形态特征。【结果】大鼻吻鮈成熟卵呈圆球形,浅绿色,为漂流性卵,卵径(0.60±0.08)mm,受精卵吸水充分膨胀后卵径(0.76±0.08)mm。在水温(23.2±1.0)℃,pH 8.71~8.86条件下,受精卵3.67 h发育至囊胚期,5.95 h发育至原肠期,9.55 h胚体形成,13.38 h器官开始形成,19.98 h出现肌肉效应情况,24.05 h心跳出现,40.43 h完成出膜,至仔鱼期。大鼻吻鮈初孵仔鱼全长3.00~4.00 mm,心跳101~132次/min;在水温26℃条件下,仔鱼2 d全部吸收完卵黄,部分泄殖孔已开,3 d全部开口摄食。【结论】利用人工催产的方法记录、分析和描述了大鼻吻鮈的胚胎发育过程,并且成功获得了大鼻吻鮈初孵仔鱼,其胚胎发育过程经历胚盘期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期及孵化出膜7个阶段,每个发育阶段又有若干个发育时期。

兰州鲇精液超低温冷冻保存技术研究及细胞损伤检测

为保护兰州鲇(Silurus lanzhouensis Chen)种质资源,促进新品种选育,文章开展了兰州鲇精液超低温冻存抗冻剂筛选及程序保存技术研究,并通过精子解冻激活率、核DNA检测、扫描电镜和透射电镜检测技术对冻存效果和冻存损伤情况进行了评测。结果表明:兰州鲇精液以10%DMSO为抗冻剂, 4℃平衡20min,–80℃平衡30min后立即置于液氮超低温保存,并于40℃水浴解冻时精子冻存效果较佳,冻精激活率达(75.56±3.91)%。SCGE检测DNA损伤结果显示超低温冻存10d、20d及30d兰州鲇精液的彗星率和损伤系数无显著差异。扫描电镜检测显示兰州鲇精子明显分头部,中段及尾部3部分,属于单鞭毛型,无顶体,无侧鳍,中心粒相互垂直呈"T"形,鞭毛为典型的"9+2"微管结构。冻存结构损伤主要表现为膜损伤,细胞质膜与染色质膜发生破损、折皱、囊泡化或整体脱落,细胞核膜与质膜空隙加大,核发生变形,核质疏散,线粒体结构弥散,线粒体内容物外流,中心粒复合体易位,鞭毛外膜变形脱离,中段位置断裂,微管结构基本完好。研究筛选的超低温冷冻保存技术可长期有效保存兰州鲇精液,为兰州鲇种质资源保护及今后精液超低温冷冻保存技术改良提供理论依据和技术基础。

兰州鲇生长激素(GH)基因的克隆及序列分析

利用长片段PCR及T-A克隆技术,从兰州鲇(Silurus lanzhouensis)基因组DNA中首次克隆兰州鲇GH基因全序列并提交至Genbank获得登录号KM215221,同时,使用DNAstar等生物信息学软件进行序列分析研究。兰州鲇GH基因全长2 067 bp,由5个外显子和4个内含子组成,完整编码序列(Complete coding sequence,CDS)为603 bp。5个外显子大小分别为10、140、117、132和204 bp;4个内含子大小分别为229、103、565和103 bp;内含子与外显子的连接区序列遵循基因组成规则。编码区编码1条由200个氨基酸残基组成的蛋白质多肽。5个科8种鲶形目鱼类生长激素基因编码区序列同源性比较表明,它们之间GH基因编码区序列有较高的同源性,平均达到了92.4%,其中,兰州鲇和南方大口鲇之间的同源性最高,为99.5%,兰州鲇和革胡子鲇之间的同源性最低,为90.0%,并构建了系统发育进化树。同时也表明,GH基因编码区序列具有较高的保守性,系统发育研究中具有较高的参考价值。

基于线粒体COX1和ND1基因顺序的黄河上游大鼻吻鮈遗传多样性分析

为探究黄河上游大鼻吻鮈(Rhinogobio nasutus)群体遗传多样性和遗传分化现状,本研究以永宁、平罗、磴口3个不同地理群体145尾大鼻吻鮈为研究对象,利用线粒体DNA COX1和ND1基因序列进行了遗传多样性分析。结果显示:COX1和ND1基因序列长度分别为1 466 bp、975 bp, A+T含量(57.25%,56.81%)均高于G+C(42.75%,43.19%)含量,具有明显的碱基组成偏向性;3个群体145尾样本中分别界定了11个和9个单倍型,均存在共享单倍型现象。在COX1和ND1基因序列中3个群体的平均单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(π)及平均核苷酸差异(K)分别为0.745 3、0.001 3、1.841和0.364、0.000 48、0.472,3个群体遗传多样性呈现出磴口群体最高、平罗群体次之、永宁群体最小的特征。基于COX1和ND1的遗传变异分析(AMOVA),表明3个群体中遗传变异均主要来自群体内,且COX1基因序列中磴口群体与永宁群体之间存在显著性明显的遗传分化。基于线粒体COX1和ND1基因单倍型序列,采用邻近法(Neighbor Joining, NJ)构建系统进化树与单倍型网络结过具有一致性,表明3个群体之间无明显的谱系分化,结构比较单一,未发现形成单独分支的群体。中性检验结果显示,大鼻吻鮈进化历程符合中性进化假设,且可能存在群体扩张。因此,为了有效地保护大鼻吻鮈野生资源,建议将大鼻吻鮈从整体上进行就地保护。

兰州鲇NPY基因的克隆和表达分析

针对兰州鲇人工驯食转化率、苗种培育成活率低等问题,为利用基因编辑技术创制和培育易驯食兰州鲇新种质,开展了兰州鲇神经肽Y基因(NPY)的克隆及其表达分析研究。结果表明:兰州鲇NPY基因cDNA序列全长为775 bp,包括288 bp的开放阅读框,编码95个氨基酸,含有1个跨膜螺旋和1个信号肽胰腺激素类识别结合位点。兰州鲇NPY蛋白序列与南方鲇的一致性最高,为98.95%。荧光定量PCR检测发现NPY mRNA在脑组织中表达量最高,其次是下丘脑,肌肉中表达量最低。不同年龄雄性各组织中NPY mRNA表达水平均高于雌性;且雌雄性别组间均表现出随年龄的增长NPY mRNA表达下降的特征。利用原位杂交技术进行脑组织细胞定位发现,脑细胞中NPY主要在细胞质中表达;不同部位脑组织中主要以前脑的视前区、视顶盖和脑垂体,小脑的豆状核区域以及延脑的尾状核区域表达量较丰富。进一步进行饥饿补偿验证发现,饥饿可引起脑组织NPY表达量显著升高,摄食后NPY表达量显著下降。上述结果表明,NPY基因可能在兰州鲇生长和摄食过程中都具有重要作用,可作为对后续功能基因进行编辑的重要验证并创制新种质,对加快兰州鲇良种新品种选育具有重要的理论意义和技术支撑作用。