淤胆血清“病理微环境”诱导胚胎干细胞向肝细胞分化

目的 :探讨淤胆血清“病理微环境”培养体系诱导胚胎干细胞 (ESC)向肝细胞分化的可行性。方法 :将小鼠ESC细胞系E14在无白血病抑制因子培养基中培养 ,使其自发分化为拟胚体 ,加入FGF - 4和HGF初步诱导 ,然后置于 5 %淤胆鼠血清“病理微环境”筛选培养液中继续培养 2周 ,然后进行细胞形态学观察 ,白蛋白和CK8/ 18免疫组化染色 ,白蛋白与转甲状腺蛋白RT -PCR检测 ,细胞糖原染色及尿素合成功能分析。结果 :经初步诱导分化的ESC置于 5 %淤胆血清“病理微环境”筛选培养液中培养 ,初期细胞生长受抑制 ,2周后分化为肝细胞样细胞 ,细胞呈现良好的均质性 ;免疫组化染色显示白蛋白和CK8/ 18表达 ;RT -PCR显示有白蛋白、转甲状腺蛋白等的mRNA转录 ;细胞有糖原和尿素合成功能。结论 :采用含淤胆血清的病理微环境培养体系从经FGF - 4和HGF初步诱导的胚胎干细胞中有效筛选出了具有功能的肝细胞 ,细胞有较好的均质性 ,为临床肝细胞替代治疗、获取丰富供体细胞来源提供了新思路。

胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植对宿主肝功能的影响及安全性评估(英文)

背景：体外诱导胚胎干细胞分化为肝细胞已有不少成功的报道，但其体内移植后能否有效整合入宿主肝板、在肝内能否进一步生长分化并表达肝细胞功能以及成瘤的风险等情况目前还不清楚。目的：应用治疗性肝再生模型进行胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植．观察其在肝组织替代、体内的生长分化及成瘤性情况。设计：随机对照动物实验。单位：中山大学附属第二医院小儿外科。材料：选用BALB／c小鼠24只为受体，鼠龄6～8周，体质量20～352，雌雄不拘购自广州市实验动物中心。实验所用胚胎干细胞源性肝干细胞由作者所在课题组诱导胚胎干细胞分化而成。小鼠胚胎干细胞株E14由本院干细胞中心提供。方法：实验于2006-07／2007-06在中山大学附属第二医院干细胞研究中心完成。将24只小鼠随机分为2组：肝再生模型＋干细胞移植组和肝切除＋干细胞移植组，每组12只。前组分两次按50mg／kg剂量腹腔内注射倒千里光碱（retrorsine），间隔2周，第2次注射4周后行70％肝部分切除制造肝损伤；然后经门静脉分别移植1×10^5羟基荧光素乙酰乙酸（CFDA-SE）荧光标记的细胞入小鼠肝内进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植。后组在行70％肝部分切除制造肝损伤模型后进行胚胎干细胞源性肝干细胞移植。主要观察指标：荧光显微镜下观察移植细胞组受体鼠肝脏内分布、整合与体内生长分化情况。2周后行白蛋白荧光免疫组化（双荧光染色）、血清白蛋白水平检测其功能状况。将胚胎干细胞源性肝干细胞注入治疗性肝再生小鼠肝内，将未分化的胚胎干细胞移植入小鼠腋区皮下作为对照，观察胚胎干细胞源性肝干细胞体内成瘤情况。结果：①肝干细胞在受体鼠肝内生长情况：CFDASE标记的胚胎干细胞源性肝干细胞肝内移植1周，受体小鼠肝实质内可见散在绿色荧光分布。2周后，肝实质内绿色荧光分布区域明显扩大，且可见类似肝索样结构排列。②肝功能：共焦白蛋白荧光免疫组化（双荧光染色）结果表明，受体小鼠肝组织内可见标记细胞表达白蛋白阳性信号（呈黄色荧光），肝再生模型＋干细胞移植组和肝切除＋干细胞移植组血清白蛋白水平则无明显差异（P〉0．05）。③肝干细胞移植安全性：6周内未见畸胎瘤形成，而将未分化的胚胎干细胞移植入小鼠腋区皮下6周后则可见畸胎瘤形成。结论：胚胎干细胞源性肝干细胞移植入治疗性肝再生模型小鼠肝内后可有效在肝内能进一步生长分化并部分表达肝细胞功能：且此移植安全性较好。

miRNA-122促进小鼠胚胎干细胞源性肝前体细胞的分化与成熟

目的:通过miRNA-122(miR-122)转染胚胎干细胞(ESCs)源性肝前体细胞,观察及评估其是否能推进ESCs向肝细胞的分化过程。方法:采用丁酸钠、成纤维细胞生长因子4(FGF-4)及地塞米松(Dex)联合序贯诱导小鼠ESCs使之初步分化为肝前体细胞,然后利用Gateway技术构建出pAV.Ex1d-CMV>miR122/IRES/eGFP重组腺病毒表达载体,使其转染贴壁诱导第9天的小鼠ESCs源性肝前体细胞,获得稳定高表达miR-122的细胞后继续培养。采用荧光显微镜观察转染后细胞形态的变化;使用real-time RT-PCR检测肝特异性基因的表达;免疫荧光检测肝特异性蛋白表达水平;吲哚氰绿摄取实验、糖原染色及尿素合成功能实验检测肝细胞功能。结果:丁酸钠、FGF-4及Dex联合序贯诱导可将小鼠ESCs成功地诱导为肝前体细胞。转染miR-122后,细胞在形态学上更接近成熟肝细胞;肝特异性基因白蛋白(ALB)、甲状腺素运载蛋白、α1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、细胞角蛋白8、胆固醇7α-羟化酶及细胞色素P450 3A4的mRNA表达均增高;肝特异性蛋白ALB及细胞角蛋白18均表达增高,而甲胎蛋白表达降低;吲哚氰绿摄取实验、糖原染色及尿素合成功能实验结果均显示转染miR-122后肝细胞功能较对照组明显增强。结论:丁酸钠、FGF-4及Dex联合序贯诱导可将小鼠ESCs成功地诱导为肝前体细胞;miR-122能够有效地促进小鼠肝前体细胞的分化与成熟。

人参皂甙与肝细胞生长因子诱导骨髓间质干细胞分化为肝细胞的实验研究

目的探讨人参皂甙(CS)与肝细胞生长因子(HGF)体外诱导骨髓间质干细胞(MSC)分化为肝细胞的协同效应及分子机制。方法采用 Ficoll-Paque 液离心分离鼠 MSC,体外扩增,在 LDMEM 培养液中加入 HGF 和 GS 进行诱导分化。通过细胞形态学观察、免疫组化检测白蛋白、CK8/18的表达以及 RT-PCR 检测白蛋白、CK18等肝细胞特征性蛋白的 mRNA 转录水平、糖原染色等来分析诱导分化的效果。结果鼠MSC 体外扩增3代,细胞数可达(1～2)×10~7左右。加入 HGF 和 GS 诱导后,MSC 形态逐渐分化为肝细胞样,免疫组化染色见胞浆内出现棕黄色颗粒,表达肝细胞特有的白蛋白以及 CK8/18等蛋白。RT-PCR 显示有白蛋白、CK18等的 mRNA 转录。糖原染色亦呈阳性反应。结论人参皂甙与肝细胞生长因子在体外可以诱导骨髓间质干细胞分化为肝细胞样细胞。

胚胎干细胞源性肝干细胞在治疗性肝再生中的应用

目的:应用治疗性肝再生模型进行胚胎干细胞(ESC)源性肝干细胞肝内移植,观察其在肝组织替代、体内的生长分化及成瘤性等情况,为ESC移植在难治性肝病治疗中的临床应用提供实验依据。方法:倒千里光碱+70%肝部分切除建立BALB/c小鼠的治疗性肝再生模型。用荧光示踪剂CFDASE标记移植细胞,将经淤胆血清"病理微环境"筛选体系筛选出的ESC源性肝干细胞经门静脉移植入治疗性肝再生模型小鼠肝内。然后荧光显微镜下观察,检测移植细胞体内分布、整合与肝细胞替代、体内生长分化等情况。2周后行白蛋白荧光免疫组化(双荧光染色)、血清白蛋白水平检测其功能状况。并通过观察其体内成瘤性对筛选出的ESC源性肝干细胞的安全性进行评估。结果:CFDASE标记的ESC源性肝干细胞肝内移植1周,受体小鼠肝实质内可见散在绿色荧光分布。2周后,肝实质内绿色荧光分布区域明显扩大,且可见类似肝索样结构排列。共焦白蛋白荧光免疫组化(双荧光染色)结果表明,受体小鼠肝组织内可见标记细胞表达白蛋白阳性信号(呈黄色荧光),血清白蛋白水平则无明显差异(P>0.05)。6周内未见畸胎瘤形成,而将未分化的ESC移植入小鼠腋区皮下6周后则可见畸胎瘤形成。结论:经淤胆血清"病理微环境"筛选体系筛选出的ESC源性肝干细胞移植入治疗性肝再生模型小鼠肝内后可有效整合入宿主肝板、在肝内能进一步生长分化并部分表达肝细胞功能。其安全性较好,6周内未见畸胎瘤形成。

小儿坏死性肠套叠外科治疗93例分析

目的 :探讨小儿坏死性肠套叠的病因、诊断、低压空气灌肠复位的作用、手术治疗及并发症的防治。方法 :对经手术治疗的 93例小儿坏死性肠套叠进行回顾性分析。结果 :79例原发性肠套叠 ,14例继发性肠套叠。套叠类型为回 结肠型 73例 ,小肠型 15例 ,结 结肠型 5例。全组均行套叠复位加坏死肠段切除一期吻合术。术前误诊 5例 ,死亡 3例。结论 :①局部解剖因素是小儿肠套叠发生的主要原因 ;②B超检查有助于肠套叠的诊断 ;③对于复发性肠套叠不宜反复多次地进行低压空气灌肠复位 ;④手术原则是对于高度怀疑肠管坏死的不能姑息 ,应积极切除 ,但同时亦应尽可能多地保留有活力的肠管及回盲瓣。

胰十二指肠切除术治疗儿童胰母细胞瘤1例

胰母细胞瘤为儿童罕见恶性肿瘤,由于病灶隐蔽而难于早期发现.待其并发上消化道梗阻、出血或梗阻性黄疸等情况发生时往往又由于医生对本病认识不足而难于得到正确的诊断和治疗.现就本院最近收治的1例报道如下.

小儿坏死性肠套叠外科治疗84例分析

目的 探讨小儿坏死性肠套叠的病因、诊断、低压空气灌肠复位的作用、手术治疗及并发症的防治。方法 对经手术治疗的84例小儿坏死性肠套叠进行回顾性分析。结果 本组原发性肠套叠73例,继发性肠套叠11例。套叠类型回-结肠型68例,小肠型12例,结-结肠型4例。全组均行套叠复位加坏死肠段切除一期吻合术。术前误诊5例,死亡3例。结论 ①局部解剖因素是小儿肠套叠发生的主要原因;②B超检查有助于肠套叠的诊断;③对于复发性肠套叠不宜反复多次地进行低压空气灌肠复位;④手术原则是对于高度怀疑肠管坏死的不能姑息,应积极切除,但同时亦应尽可能多地保留有活力的肠管及回盲瓣。

脾内肝细胞移植(综述)

脾内移植的肝细胞不仅能在脾内长期存活和增殖,同时也具有一定的功能.借自体或同种异体肝细胞移植以形成肝化脾有可能成为终末期肝病、难治性肝病的一种可供选择的治疗方法.本文就脾内肝细胞移植的研究进展及临床应用做一简要综述.

三七总皂甙对大鼠肝化脾增量的影响

目的:探讨促进肝化脾增量及缩短其再生周期的新途径。方法:应用三七总皂甙于自体肝细胞脾内移植(IHAT)的动物模型上,分别于移植术后2周对病理组织学、电镜形态、肝化脾匀浆谷丙转氨酶(ALT)含量及^(99m)Tc-HIDA 摄取试验进行观察分析。结果:三七总皂甙组(A 组)脾内肝细胞水肿、变性程度较轻,肝化脾匀浆 ALT 含量达(928.0±268.1)u/g,明显高于对照组(P<0.05),且^(99m)Tc-HIDA 摄取试验时 A组离体肝化脾显影较清晰,其放射性计数明显高于对照组(B 组,P<0.05)。结论:三七总皂甙在移植早期对脾内肝细胞有一定的抗损伤保护作用,从而促进了肝化脾的增量。

肝细胞生长因子与三七皂苷对自体肝细胞脾内移植的影响

目的：探索促进肝化脾增量及缩短其再生周期的新途径。方法：应用肝细胞生长因子（ＰＨＧＦ）与三七皂苷（ＰＮＧＳ）于自体肝细胞脾内移植（ＩＨＡＰ）的动物模型上，分别于移植术后２周、１２周时对病理组织学、电镜形态、肝化脾匀浆谷丙转氨酶含量及脾内肝细胞增殖指数等指标进行观察分析。结果：移植术后２周，三七皂苷组脾内肝细胞水肿、变性程度较轻，肝化脾匀浆丙氨酸转氨酶（ＡＬＴ）含量达（９２８．０±２６８．１）Ｕ／ｇ，较对照组［（６３９．４±１３８．４）Ｕ／ｇ］明显增高（Ｐ＜０．０１）；移植术后１２周，肝细胞生长因子组脾内肝细胞生长好，数量、面积大，肝化脾匀浆ＡＬＴ含量达［（２３２４．８±４００．８）Ｕ／ｇ］，增殖指数（Ｉｐ达３．８３％±０４２％［对照组分别为（１８３９．４±３６８．４）Ｕ／ｇ、２．８９％±０．４４％］，与对照组相比差异均有显著性意义（Ｐ＜０．０５）。结论：三七皂苷在早期对脾内肝细胞有一定的抗损伤保护作用，而肝细胞生长因子对加速肝化脾增量及缩短其再生周期有明显作用。

促肝细胞生长素对肝化脾增量的影响

本实验在大鼠肝大部分切除加自体肝细胞脾内移植的动物模型上应用促肝细胞生长素(PHGF)。通过术后2周、12周时病理组织学、电镜形态、肝化脾匀浆谷丙转氨酶含量、同位素^(99)mTc-HIDA摄取率及增殖指数等指标的对比分析,以观察PHGF对肝化脾增量的影响。发现:①移植术后2周,PHGF组肝化脾的组织形态学、谷丙转氨酶含量与对照组相比差异无显著性意义;②移植术后12周,PHGF组脾内肝细胞生长好,数量、面积大,肝化脾匀浆谷丙转氨酶含量达2 324.8±400.8U/g、放射性计数达2 780.0±868.8、增殖指数达3.83±0.42％(对照组分别为:1 839.4±368.4U/g、868.7±169.0、2.89±0.44％),与对照组相比差异皆有显著性意义(P<0.05).实验结果表明,PHGF对加速肝化脾增量及缩短其再生周期有明显作用。

肝细胞生长因子诱导骨髓间质干细胞分化为心肌细胞

目的 :探讨肝细胞生长因子 (HGF)体外诱导骨髓间质干细胞 (MSC)定向分化心肌细胞的一种新方法。方法 :分离SD大鼠骨髓MSC ,培养至 4 - 6代后 ,添加HGF(终浓度 10 μg/L)持续培养 30d ,倒置显微镜下动态观察分化细胞的自律性搏动和对 0 1%异丙肾上腺素和无Ca2 + 孵育液的反应 ,并行心肌肌凝蛋白表达鉴定。结果 :分化第 14 - 2 0d骨髓间质干细胞增殖形成集落 ,10 % - 5 0 %克隆中开始出现持续节律收缩的细胞群体 ,节律频率为 70- 90次 /min ,异丙肾上腺素加快其搏动速率 ,无Ca2 + 孵育液则抑制之。细胞心肌肌凝蛋白表达鉴定为心肌细胞。结论 :HGF可诱导骨髓间质干细胞分化为心肌细胞 。

改良腹腔镜Swenson与Soave术对儿童短段型先天性巨结肠疗效差异

目的对腹腔镜Soave术(LS)和改良腹腔镜Swenson术(MLSw)在儿童短段型巨结肠的治疗效果和并发症进行比较分析。方法回顾分析我科自2007年3月至2016年12月收治的77例儿童短段型巨结肠临床资料。LS术26例,MLSw术51例。收集两组术前、术中和术后临床资料进行分析,随访12~48个月。结果 MLSw组平均手术时间、术中出血量和住院时间比LS组少。两组术后平均进食时间无明显差异。MLSw组术后早期并发症的发生率较LS组低,但两组术后晚期并发症发生率无明显差异。结论 LS和MLSw术都适用于儿童短段型巨结肠的治疗。但MLSw操作更简单,术后早期的排便控制更好。更重要的是,MLSw术可完全切除无神经节细胞肠段,而无需保留直肠肌鞘。

丁酸钠体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为肝细胞

目的:探讨分化刺激剂丁酸钠对体外培养的小鼠胚胎干细胞(ES细胞)分化为肝细胞的影响,并分析其可能机制。方法:常规培养E14 ES细胞后,继续悬浮培养4 d以形成拟胚体,然后转移拟胚体到铺有明胶的6孔板中并添加3 mmol/L丁酸钠开始诱导分化,分化过程中用倒置相差显微镜观察细胞形态学的改变;免疫荧光染色观察肝细胞特异性标志白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白18(CK18)的表达;RT-PCR检测肝细胞特异性标志基因ALB、AFP、甲状腺素运载蛋白(TTR)、α1抗胰蛋白酶(AAT)的mRNA表达;流式细胞技术检测ALB阳性细胞比例;糖原PAS染色和吲哚氰绿(ICG)摄取试验检测肝细胞功能。结果:诱导分化过程中ES细胞逐渐出现肝细胞样改变;诱导分化第7d仅检测到AFP和TTR在mRNA水平的表达,第14 d检测到ALB、AAT在mRNA水平的表达;分化14 d时免疫荧光检测显示ALB、AFP、CK18均为阳性;流式细胞技术检测ALB阳性细胞比例约为48.6%;糖原PAS染色和ICG摄取试验显示分化18d的肝细胞样细胞具有肝细胞功能。结论:丁酸钠可以高效诱导小鼠ES细胞分化为肝细胞样细胞,并且分化细胞具有肝细胞功能。

含淤胆血清的培养体系从大鼠骨髓细胞中筛选与扩增肝干细胞亚群

目的 :探讨采用含淤胆血清的培养体系从骨髓细胞中筛选与扩增骨髓源性肝干细胞的可行性。方法 :制备含 2 %、5 %、7%和 10 %淤胆血清的筛选培养液 ,培养大鼠骨髓细胞 ,4d时加入肝细胞生长因子促进肝干细胞生长 ,2周时行免疫组化与RT -PCR检测肝干细胞标志、糖原染色和尿素合成试验分析功能。结果 :在 2 %淤胆血清中 ,骨髓细胞不能形成克隆 ,7%与 10 %的血清则骨髓细胞逐渐凋亡。在 5 %的淤胆血清时 ,骨髓源性肝干细胞在此病理筛选培养液中能够生存并选择性生长 ,而其他类型细胞则脱落凋亡 ;第 2周时 ,形成肝细胞样集落 ,细胞表达胚胎时期肝细胞特征性蛋白 ,具有肝细胞特有糖原和尿素合成功能。结论 :含淤胆血清的微环境筛选培养体系能够有效地从骨髓细胞中筛选骨髓源性肝干细胞 ,为临床肝细胞替代治疗的获取丰富供体细胞来源提供了新的思路。

先天性胆总管囊肿宜早手术

康医生：我儿子刚满1岁,前几天我们无意中发现其右上腹部明显隆起,摸起来软软的,压着不痛,也没有别的什么不适。到当地医院就诊,CT检查结果显示为胆总管囊肿,医生建议我们带孩子到上一级医院手术。请问,我儿子这种情况一定要做手术吗？什么时候手术合适？

RNAi抑制NANOG表达对肝癌细胞HepG2中MDR1表达及阿霉素敏感性的影响

目的探讨抑制NANOG表达对肝癌细胞HepG2中多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)表达及阿霉素敏感性的影响。方法将靶向NANOG基因的特异性siRNA转染肝癌细胞HepG2,Real-time PCR和Western blot检测siRNA沉默NANOG基因后NANOG、MDR1 mRNA和蛋白的表达,平板克隆形成实验检测沉默NANOG基因后对细胞增殖能力的影响,流式细胞术检测沉默NANOG基因后对细胞周期的影响,CCK-8法检测沉默NANOG基因后HepG2细胞对阿霉素的敏感性情况。结果靶向NANOG基因特异性siRNA转染肝癌细胞HepG2后,能有效抑制NANOG mRNA和蛋白表达,与Mock组比值分别为(0.32±0.05)和(0.38±0.08);与Mock组比较,沉默NANOG基因后,细胞克隆形成率下降[(8.51±3.63)%vs(17.13±2.24)%,P<0.05],进入G0/G1期的细胞比例增多[(75.33±8.21)%vs(57.81±5.05)%,P<0.05],HepG2细胞对阿霉素的敏感性增强(P<0.05),HepG2细胞内MDR1 mRNA和蛋白表达下降,与Mock组比值分别为(0.35±0.06)和(0.41±0.08)。结论抑制NANOG表达可引起肝癌细胞HepG2中MDR1的表达下调并增强细胞对阿霉素的敏感性。

应用淤胆血清“病理微环境”从ESC中筛选肝干细胞的研究

目的:探讨淤胆血清"病理微环境"培养体系诱导胚胎干细胞(ESC)向肝细胞分化的效果及对肝干细胞的筛选作用。方法:将小鼠ESC细胞系E14在无白血病抑制因子培养基中培养,使其自发分化为拟胚体,加入FGF-4和HGF初步诱导,然后置于5%淤胆鼠血清"病理微环境"筛选培养液中继续培养2周,然后进行细胞形态学观察,ALB和CK8/18免疫荧光染色,电镜检查和吲哚氰绿(ICG)摄取试验。结果:经初步诱导分化的ESC置于5%淤胆血清"病理微环境"筛选培养液中培养,初期细胞生长受抑制,部分细胞坏死、凋亡并脱落。1周左右可见上皮样细胞集落呈优势生长。2周左右可见较多肝细胞样集落形成单位(H-CFU),大部分细胞分化为多角形的肝细胞样细胞,呈现较好的均质性,从中央到周边呈逐渐分化成熟的趋势;免疫荧光染色显示ALB和CK8/18表达;电镜检查可见与肝细胞相似的超微结构;吲哚氰绿(ICG)摄取试验可见大量ICG阳性细胞,提示这些细胞具备部分肝细胞特性,且筛选诱导组ICG阳性率显著高于对照组(P<0.05)。结论:采用含淤胆血清的"病理微环境"培养体系从经FGF-4和HGF初步诱导的胚胎干细胞中有效筛选出了具有功能的肝细胞样细胞。