链霉素残留检测ELISA试剂盒的研制及应用

本研究采用EDC法人工合成链霉素抗原（SM—BSA），免疫BALB／c小鼠，通过杂交瘤技术获得了分泌抗链霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，建立了快速检测链霉素（SM）残留的酶联免疫方法，并成功研制了试剂盒。然后对其灵敏度、准确度、特异性、基质效应性等技术指标进行检测，同时应用该试剂盒对生长猪尿液中的残留情况进行检测。结果表明：除双氢链霉素外，该试剂盒与其它抗生素类药物均无交叉反应；线性检测范围为1～1289g／L，相关系数R^2=0．9251，灵敏度为0．45μg／L，半数抑制浓度（IC50）为7．769g／L，检测限为19g／L；猪尿样的平均添加回收率为84．1％；基质对该试剂盒的检测结果影响不大。该试剂盒具有快速、敏感、特异、简便等特点，适合于SM残留的快速检测，具有较高的推广应用价值。

链霉素快速检测试纸的研制及其性能测定

以分泌抗链霉素(SM)单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株的建立为基础,应用胶体金免疫层析技术成功研制出SM残留快速检测试纸,并对其敏感性、特异性、重复性、符合性等特性进行了测定。结果表明,检测试纸的检测限为8μg/L;检测上线为100μg/L;与双氢链霉素的交叉反应为100%,与其他抗生素类药无交叉反应;其敏感性与ELISA试剂盒相当,与ELISA试剂盒的检测结果符合率为100%;检测试纸在10 min内显示结果。

链霉素人工抗原的制备与鉴定

链霉素经氧-羧甲基羟胺肟化处理后引入羧基,采用EDC一步法分别合成免疫原BSA-EDC-SM和包被抗原OVA-EDC-SM;用戊二醛法和1,4-丁二醇缩水甘油醚分别合成BSA-GA-SM和BSA-di-SM;采用SDS-PAGE凝胶电泳和紫外扫描测得BSA-EDC-SM、BSA-GA-SM和BSA-di-SM的BSA与SM的分子结合比分别为1∶23、1∶15和1∶10。用3种免疫原免疫Balb/C小鼠,获得了高价、敏感和特异的抗血清。BSA-EDC-SM免疫组中1#小鼠的多克隆抗体对SM的IC50为45.8μg/mL,对双氢链霉素(DHSM)的交叉反应为90.6%,与其他氨基糖苷类药物或抗生素药物的交叉反应均小于0.001%。BSA-di-SM和BSA-GA-SM免疫组的多克隆抗体对DHSM、其他氨基糖苷类药物或抗生素类药物的交叉反应均小于0.001%。

抗链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其免疫学特性鉴定

用EDC一步法和戊二醛法将SM偶联于载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和OVA,合成免疫原BSA-SM和包被原OVA-SM。用紫外线扫描、SDS-PAGE进行鉴定;用BSA-SM免疫BALB/C小鼠,用杂交瘤技术建立分泌SM mAb的细胞株3F9-C4;对SM mAb的效价、亲和性、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。结果表明,BSA-SM人工抗原分子结合比为1∶25;筛选出3F9-C4敏感特异的杂交瘤细胞1株,间接ELISA测定细胞培养上清,效价为1∶3.2×102,同种型为IgG2a/κ;腹水的亲和常数(Ka)为8.4×1011L/mol;IC50为8.99μg/L,与双氢链霉素交叉反应为109.6%,与其他SM结构相似物和功能近似物无交叉反应性。本试验获得了抗SM高价、敏感、特异的mAb,可用于SM的残留检测。