用无血清培养基在填充床生物反应器生产 rHuEPO

在填充床生物反应器用含５％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ：Ｆ１２培养基培养产重组人促红细胞生成素（ｒＨｕＥＰＯ）的细胞Ｃ２８～１０ｄ后，使用自制的无血清生产培养基（ＳＦＭｐ）生产ｒＨｕＥＰＯ。ＳＦＭｐ培养基既能维持细胞生长，又能生产ＥＰＯ，也便于纯化分离ｒＨｕＥＰＯ。使用填充床生物反应器培养细胞，能维持培养２０～２５ｄ，ｒＨｕＥＰＯ表达水平达１２～２８４ｍｇ／Ｌ之间，反应器的产率达到７１０ｍｇ／Ｌ／ｄ，比滚瓶的产率增加１２～１４倍。葡萄糖最高消耗量达到２１ｇ／Ｌ／ｄ，细胞培养密度最高达到３０×１０７／ｍｌ以上，每次可收无血清培养上清８０～８７Ｌ。由于细胞被固定在聚酯片上，培养上清中脱落细胞很少。观察了反应器的乳酸和氨的含量，其结果表明乳酸和氨含量分别低于３５ｇ／Ｌ和５ｍｍｏｌ／Ｌ，不影响产物的表达。经过多批培养和生长ｒＨｕＥＰＯ的结果表明，自行配制的ＳＦＭｐ培养基在该反应器能有效地维持细胞生长和生产ｒＨｕＥＰＯ。

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

构建了家蚕核多角体病毒新型载体ｐＢｍ９２，该载体将多角体蛋白基因的起始密码ＡＴＧ改变为ＡＴＴ，然后在多角体蛋白基因的＋１２位后连接有５个外源基因的克隆位点。将ＨｕＩＦＮ－β基因克隆在多角体蛋白基因的＋１２位后，构建了ｐＢｍＩＦＮ＋１２；同时构建了Ｈｕ ＩＦＮ－β克隆在－３位后的转移载体ｐＢ－ｍＩＦＮ－３。

用慢病毒载体制备转基因动物的研究进展

慢病毒是逆转录病毒的一种 ,具有逆转录病毒的基本结构 ,但也有不同于逆转录病毒的组份和特性 ,作为基因治疗载体发展起来 ,最近已用于转基因动物制备。慢病毒像其它逆转录病毒一样 ,其基因组经逆转录后能整合在宿主DNA上 ;由于病毒载体经改构后 ,不在宿主细胞增殖 ,不会导致寄主细胞的死亡 ,被它感染的或转化的动物细胞能够连续传代 ;这种载体的最大优势是能感染静止细胞和不产生嵌合体动物。详细介绍了慢病毒载体构建原理。

制备动物乳腺生物反应器的问题和对策

动物乳腺是理想的用于生产复杂的生物活性蛋白的生物反应器。目前,显微注射仍然是制备大型转基因动物的主要方法,但外源基因整合效率低下和位置效应还需要解决。要解决这两个问题,人们探索了几种策略。尽管使用转染的体细胞和基因打靶的体细胞作为核移植的供体的动物克隆技术还在改善中,但是这一技术是有应用前景的转基因牲畜的方法。在转基因载体中使用LCR和MAR序列可显著提高表达水平和转基因效率。YAC、BAC作为理想的转基因载体可能因为它们能容纳基因座的所有元件。虽然这些技术和方法还存在不完善之处,但其发展将极大地提高动物乳腺生物反应器的整合率和表达水平。

昆虫杆状病毒载体的细胞培养和重组蛋白生产

利用杆状病毒载体和昆虫细胞生产重组蛋白的研究日益增多,本文就杆状病毒的宿主细胞种类、培养条件、大规模培养方法和虫体表达以及昆虫细胞对表达产物的翻译后修饰加工的研究现况进行了概述。

阻遏钝齿棒状杆菌噬菌体感染T_(6-13)菌的化合物研究

前言 L—谷氨酸生产是当前最大的发酵行业之一,噬菌体污染是此行业的一个严重问题,往往造成生产中止和重大经济损失。就目前而言,要防止噬菌体的污染还存在许多难题,国内外不少人曾对此进行过探讨,尚未完全解决。要解决这一问题一般都认为应从三个方面着手:一、防止噬菌体污染环境。

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

家蚕核多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus.BmNPV)和家蚕细胞已成功地用来大量生产具有生物活性的重组蛋白。但是BmNPV的通用载体的类型较少。因此,本实验构建了BmNPV新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的+12位外连接有5个外源基因的克隆位点。将HuIFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的+12位后,构建了pBmIFN+12;同时构建HuIFN-β克隆在-3位后的转移栽体pBmIFN-3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm-N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN-β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN+12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性最高时可达2.0×10~6IU/ml,将BmIFN+12注射5龄家蚕虫体,表达水平为50×10~7IU/ml,是HuIFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒的表达量的2～4倍。家蚕体生产的rHulFN-β为糖基化蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。

昆虫杆状病毒载体的细胞培养和重组蛋白生产

昆虫杆状病毒表达载体已用来表达了多种外源基因,其宿主细胞的种类、培养条件和对表达产物的修饰加工是直接影响表达水平、表达产物的生物活性和生产可行性的重要因素。近几年,随着对杆状病毒载体的深入研究,对其宿主细胞这些方面的研究也获得可喜进展,本文将对这些研究现况进行概述。

IGF-I、TGF-α、bFGF对猪卵母细胞体外成熟和卵裂的影响

研究了IGF-I、bFGF、TGF-α3种细胞因子单独或者联合作用对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活后卵裂的影响,以确立猪卵母细胞体外成熟的最佳条件。结果表明,3种细胞因子对卵母细胞的成熟和激活后卵裂呈现双重效应(1)20ng·ml-1的IGF-I的成熟率和卵裂率显著的高于对照组和10、30、40、50、100ng·ml-1组[(85.3±2.11)%,(85.4±2.81)%;(71.1±1.91)%,(62.5±0.98)%;(77.5±2.5)%,(59.1±3.93)%;(61.9±1.72)%,(54.3±3.48)%;(58.6±4.26)%,(53.1±1.23)%;(44.4±5.10)%,(49.8±3.55)%;(33.9±3.48)%,(46.1±3.59)%,P<0.05),当IGF-I的浓度达到100ng·ml-1时,成熟率(33.9±3.48)%和卵裂率(46.1±3.59)%降低,与其它各组相比差异显著(P<0.05)。(2)20ng·ml-1的bFGF的成熟率(85.0±1.70)%和卵裂率(85.0±2.82)%最高,和其它各组相比,差异显著(P<0.05)。(3)15ng·ml-1的TGF-α的成熟率(86.9±0.46)%和卵裂率(86.3±2.01)%最高,和其它各组相比,差异显著(P<0.05)。(4)15ng·ml-1TGF-α和20ng·ml-1bFGF联用组,卵母细胞成熟率和分裂率显著高于20ng·ml-1bFGF和20ng·ml-1IGF-I联合组;15ng·ml-1TGF-α和20ng·ml-1IGF-I联合组;与20ng·ml-1bFGF、20ng·ml-1IGF-I和15ng·ml-1TGF-α三者联用组。[(89.2±1.44)%和(88.8±0.17)%.(75.6±0.98)%和(78.3±1.65)%;(77.2±2.54)%和(80.2±2.26)%;(76.4±1.28)%和(77.4±3.73)%,P<0.05]。

牛β-乳球蛋白基因调控序列指导组织型纤溶酶原激活剂在小鼠乳腺中的表达

用全长 8 4kb的牛 β 乳球蛋白基因 (BLG)作为调控序列 ,用 1 6kb的鸡溶菌酶MAR序列作为对抗转基因中位点效应的工具 ,构建了组织型纤溶酶原激活剂 (tPA)乳腺表达载体。对 2 30 0枚卵进行显微注射 ,经PCR和Southern Blot检测 ,在 170只出生小鼠中获得 9只整合有牛BLG tPA融合基因的转基因小鼠 ,并在转基因小鼠乳汁中检测到tPA的活性 ,tPA的表达水平最高达到 12 μg/mL。整合在小鼠基因组中的牛BLG tPA融合基因能稳定地遗传给子代。

内含子对提高转基因动物基因表达效率的影响

综述了内含子在转基因动物基因表达中的作用，对内源性内含子和异源内含子对转基因表达的影响进行分析，讨论了内含子提高转基因动物基因表达效率的三种可能机制，并指出在表达载体构建中应考虑到内含子的重要性．

山羊精子结合和内化外源DNA的特征及影响因素

外源DNA与精子相互作用后的定位及内化率是精子载体法制备转基因动物的关键环节。实验以标记的DNA片段为示踪材料，就精子与外源DNA相互作用的基本特征及影响因素进行了研究。结果表明：山羊精子可自发性结合外源DNA，外源DNA最初结合于顶体后区质膜外表面，随后部分内化进入细胞内。精子对外源DNA的结合和内化能力随供体的不同而差异明显，在实验所检查的35只公羊中，结合率（DNaseⅠ消化前）波动于4．6％～62．4％，内化率（DNaseⅠ消化后）波动于2．1％～53．8％，个体间差异显著（P〈0．01）。对于同一供体的精子而言，阻止DNA结合的最主要因素是精浆，与射出的原精液相比，洗涤后精子的结合率和内化率分别提高了3倍和5倍；其次精子获能也将导致结合率和内化率降低（P〈0．01）。死精子不能完成外源DNA的内化过程，但反复冻融导致质膜破裂的死精子具有更高的结合率，而且阳性率与动物个体无关。上述结果提示，筛选合适的精子供体，采用优化的转染处理方法是提高精子载体方法效率的前提和保证。

来源于线虫Caenorhabditis briggssae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的合成及其功能分析

ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFAs)是一类被广泛研究和关注的脂肪酸,对人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要,并且对于人类的多种疾病的预防和治疗亦有着明显的作用。在人和哺乳动物体内,ω-3PUFAs的含量与ω-6PUFAs(其代谢方式和功能与前者不同,通常其作用也相反)相比很低。而对于人体,无论ω-3PUFAs的过低还是ω-6PUFAs的过高都会带来极为不利的影响。所以人们一直在努力寻求提高人体中ω-3PUFAs含量的途径或者大量生产ω-3PUFAs的方法。本研究经过密码子优化后,用化学合成的方法获得了C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1,并构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-sFat1-EGFP,通过脂质体转染了CHO细胞系并对其进行抗性筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染sFat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的GC-MS分析表明,sFat1基因完全能够在CHO细胞中表达和发挥其ω-3去饱和酶的作用,即促使ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸(从十八碳到二十二碳)。ω-6不饱和脂肪酸总量从48.97%下降到35.29%,而ω-3不饱和脂肪酸总量则相应地从7.86%上升到24.02%。ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.23下降到转染细胞中的1.47。这说明C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1的合成是成功的,试验所获得的结果为今后的进一步的研究或应用其大量生产ω-3PUFAs奠定了基础。

ht-PAm基因在山羊β-酪蛋白基因座定位整合的研究

利用体细胞基因打靶与核移植技术制备动物乳腺生物反应器是当今转基因定位整合表达的一种新技术。分别克隆山羊的 β_酪蛋白基因 5′调控区的 6 3kb片段 ,外显子 7、外显子 8和 9三个基因片段 ,并与克隆的人tPA突变体cDNA一起构建了含有neo和tk正负筛选标记基因的 β_酪蛋白基因打靶载体PGBC4tPA,并验证了neo基因、tk基因以及Cre_LoxP系统的有效性。将线性化的PGBC4tPA通过电转染整合到山羊胎儿成纤维细胞基因组中 ,利用G4 18和GANC进行抗性细胞克隆的药物筛选 ,初步获得抗性细胞克隆 2 4 4个 ,PCR检测后获得阳性细胞克隆 31个 ,其中初步验证 2个细胞克隆转植基因整合位点重组后的基因序列正确 ,并且该细胞克隆能够有效扩增。这为下一步基因打靶体细胞核移植制备山羊乳腺生物反应器奠定了基础。

球孢白僵菌毒素的分离、毒力检测及结构鉴定

用吸附法从球孢白僵菌（Ｂｅａｕｖｅｒｉａｂａｓｓｉａｎａ）１００３－Ｖ的代谢产物中分离出导致昆虫患病的毒素粗提物，并对其进行了毒力检测。结果表明，该毒素对白纹伊蚊（Ａｅｄｅｓａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）幼虫有明显毒性；对棉铃虫幼虫口服毒性较弱。

转基因动物理论与技术的研究进展

转基因动物的出现,为生命科学研究提供了有力的工具。在过去的十多年里,已建立了许多整合有外源基因的转基因小鼠和大鼠,转基因兔、猪、羊、牛等也已诞生。使得在基础研究和实际应用方面展示出良好的前景。然而由于转基因动物的建立较为复杂、繁琐,需研究的问题也较多。迄今为止,以小鼠为模型的研究中,获得的转基因小鼠一般具有如下特征:

转基因动物乳腺定位表达重组蛋白质的研究现状(上)

介绍了转基因动物乳腺定位表达重组蛋白质研究的现状、存在的问题和未来发展前景。

牛α-sl酪蛋白基因序列指导htPA突变体小基因在小鼠乳腺中的表达

将包括α－ｓｌ酪蛋白基因的启动子、ＬＡｔＰＡ小基因、α－ｓｌ酪蛋白基因下游调控序列的融合基 因经显微注射至小鼠的受精卵中，获得了５只转基因阳性鼠，其中１只转基因阳性雌鼠乳清中 ＬＡｔＰＡ的含量为０．１８μｇ／ｍｌ，说明构建的ＬＡｔＰＡ小基因能够正确表达出有生物活性的ＬＡｔＰＡ， 并且可在酪蛋白基因调控序列的指导下在小鼠的乳汁中表达。

应用PCR-酶切连接法合成全长sFat1基因

人工合成基因在生命科学研究中有着重要的意义,因此基因合成是一项常用技术。长片段基因的合成比较困难,常常因为合成中碱基序列的错配、突变等原因而导致失败。研究者们所熟知的几种现行的方法仍然难以解决该问题。本研究在作者自身的工作经验中建立了一种新的基因合成方法,即PCR-酶切连接法。应用该方法成功地将化学合成的27个寡聚核苷酸片段(每个片段长60～68bp)拼接组装起来,获得了完整的总长为1226bp的基因sFat-1。整个过程仅采用3轮PCR(共7个反应)、2轮的酶切连接(3个反应),而且未曾出现任何偏离预期基因序列的差错。该方法步骤较少,技术简单,出错极少,是合成长基因序列很好的选择。

转基因动物乳腺定位表达重组蛋白质的研究现状(下)

转基因动物乳腺定位表达重组蛋白质的研究现状（下）卢一凡邓继先肖成祖马清钧（军事医学科学院生物工程研究所北京１０００７１）四、乳汁中表达产物的特征不论材料的来源如何，如细菌培养物、哺乳动物细胞培养液或转基因动物乳汁，对重组蛋白都需进行纯化，其所需的要求...