基于网络药理学的刺五加抗帕金森病的作用机制研究

目的基于网络药理学与分子对接方法探究刺五加治疗帕金森病(Parkinson's disease,PD)的作用机制。方法检索ETCM数据库获取并筛选刺五加活性成分,通过Swiss Target Prediction平台预测活性成分对应靶标,构建“刺五加-活性成分-靶点”网络图;检索GeneCards、DisGeNET数据库获取PD相关基因靶点,针对其与刺五加交集靶点,根据度值、中介中心性和接近中心性筛选核心靶点;使用STRING数据库构建PPI网络图,并进行GO与KEGG富集分析;最后使用AutoDock Vina进行分子对接。结果共检索出61种刺五加活性成分,确定了652个潜在靶点,506个可能适合治疗PD的潜在疾病靶点。分子对接结果表明,刺五加苷B、槲皮素和β-谷甾醇是刺五加治疗PD的核心活性成分,可分别作用于排名前3位的核心靶点GAPDH、AKT1和TNF。结论推测刺五加可能主要以神经活性配体-受体相互作用及cAMP信号通路来发挥治疗PD的作用。

利用模型构建开展遗传学教学的实践

在遗传学教学过程中,为了能够将抽象的内容以直观、形象的方式呈现给学生,帮助学生更好地理解遗传学理论知识,从明确任务、合作学习、制作模型、分析模型、完善模型、应用模型六方面将模型构建引入课堂教学.以问题驱动引导学生构建模型,使学生在构建模型的过程中理解遗传学概念,在分析模型中领悟遗传规律的实质,在应用模型中内化遗传学知识,从而提高教学质量,发展学生的科学思维.以“连锁与交换”一节内容为例,讲述遗传学教学过程中开展物理模型构建的具体流程.

刺五加甘油醛3-磷酸脱氢酶基因的鉴定与分析

刺五加(Eleutherococcussenticosus)为我国名贵中药,甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)参与光合作用和能量代谢,可能对药用活性成分合成有着重要影响。为了深入理解刺五加的生物学机制,本研究使用ExPASy、TBtools、MEGA11和EasyCodeML等工具对刺五加的GAPDH基因家族进行鉴定和分析。共得到26条GAPDH基因,其编码蛋白普遍呈中性且具有较好的脂溶性,主要分布于细胞质和叶绿体。蛋白结构中,α螺旋占多数,推测其起主要作用。系统发育分析发现26条GAPDH基因可分为三大分支,基因结构中包含较多外显子,推测拥有更加丰富的多肽加工机制以实现不同的生物学功能。基因在染色体上均匀分布,共线性分析得到17个染色体间共线性基因对。压力选择分析显示相关基因受到负选择压力,保守基序高度相似,在进化过程中的高度保守。蛋白互作网络发现GAPDH与多个蛋白关系密切。这些结果揭示了GAPDH在刺五加光合作用、能量代谢和次生代谢等方面的重要性和功能多样性,为深入理解刺五加的生物学机制提供了有力支持。

刺五加DNA甲基转移酶基因的适应性进化分析

本研究以刺五加(Eleutherococcussenticosus)的DNA甲基转移酶(cytosine-5DNA methyltransferase,C5-MTase)基因为研究对象,探究其适应性进化的特征。在刺五加的基因组中共鉴定出11条C5-MTases序列,对其进行生物信息学分析和系统发育分析,并分别利用PAML软件的分支模型、位点模型、分支-位点模型以及MEC模型、SLAC(singlelikelihood ancestorcounting,SLAC)和FEL(fixed effects likelihood model,FEL)等方法对刺五加C5-MTases基因的选择位点进行检测。生物信息学分析结果表明刺五加C5-MTases的基因结构高度保守。系统发育分析结果显示,11条C5-MTases基因序列可分为CMT、MET和DNMT三大分支。适应性进化分析结果表明,纯净选择在刺五加C5-MTases基因的进化过程中占主导地位。

刺五加鲨烯合酶基因家族两成员的表达及其与皂苷含量的关系

为了探明刺五加鲨烯合酶(SS)基因家族2成员对皂苷含量的作用机制,以actin为内参基因,利用real time PCR技术,分析刺五加不同生长发育时期、不同器官及茉莉酸甲酯(MeJA)处理对SS1、SS2基因表达及皂苷含量的影响。结果表明:刺五加SS基因家族的SS1和SS2在整个生长期和各器官中均有表达,且表达量差异显著(P<0.05),其中,在萌芽期两者的表达量差异最大。SS1在叶片、叶柄和根器官中的表达量显著高于SS2的表达量(P<0.05)。MeJA处理可显著提高SS1和SS2基因的表达量。刺五加SS1的表达量与皂苷含量间的相关系数低,未达显著水平。SS2的表达量与皂苷含量呈显著的正相关关系(P<0.01)。SS2表达量的高低决定了皂苷含量的高低,是刺五加中三萜皂苷生物合成中的关键酶。

刺五加的体细胞胚胎发生研究

目的用不同质量浓度2,4-D和外植体类型对刺五加体细胞胚胎诱导进行研究,为刺五加的资源保护和遗传工程提供理论依据。方法以刺五加的萌发3周幼苗和层积处理种子合子胚的胚根、下胚轴和子叶为外植体,考察不同激素对刺五加体细胞胚胎发生的影响。结果来自层积处理种子合子胚的外植体接种于附加0.5 mg/L2,4-D的MS或1/2MS培养基中体细胞胚胎诱导率(57.1%)和数量(3.3)最高。体胚在原培养基中即可发育成熟,转入降低2,4-D质量浓度的培养基后更有利于新体胚的产生和原有体胚的成熟。刺五加体胚的发育历程与合子胚相似。结论刺五加可以通过来自合子胚的外植体实现体细胞胚胎发生,体胚诱导率取决于2,4-D质量浓度和外植体的发育程度。

刺五加幼叶原生质体的分离法

将室内盆栽的刺五加幼苗叶片以含1%纤维素酶和0.5%果胶酶的酶解液酶解6h后,其游离原生质体的产量和活性分别为2.22×105个·g-1(FW)和92.8%,酶解液中加入的渗透压稳定剂——甘露醇浓度以0.5mol·L-1为最适宜。

刺五加皂苷合成关键酶基因表达的半定量RT-PCR分析

根据已克隆的刺五加鲨烯合酶(squalene synthase,SS)、鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)和β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthase,bAS)基因序列信息设计引物,通过半定量RT-PCR分析了SS、SE和bAS基因在刺五加不同生长发育时期和不同器官中表达量的变化。结果表明,SS、SE和bAS基因在各生长发育时期和各器官中均有表达,但表达量差异显著(P<0.05),三者均在盛花期表达量最高,之后降低,进入果实成熟期后SS和bAS的表达量迅速回升,SE无显著变化。SS和bAS在叶片和根中的表达量较高,SE表达量的最大值出现在叶片和幼茎中。刺五加SS、SE和bAS基因的表达间存在显著的正相关关系(P<0.05)。研究结果为进一步分析关键酶基因对刺五加三萜皂苷生物合成的影响奠定了基础。

刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

利用RACE技术克隆刺五加甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)基因的全长cDNA序列,运用生物信息学方法对该基因进行分析,并通过RT-PCR法检测MDD在刺五加不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果表明:(1)刺五加MDD基因cDNA序列全长1 769bp(GenBank登录号为JQ905594),开放阅读框全长1 263bp,编码420个氨基酸残基,包含GHMP激酶超家族的特异性识别序列;刺五加MDD蛋白的二级结构中含有161个α螺旋,占38.33%;68个延伸链,占16.19%;19个β折叠,占4.52%;172个无规则卷曲,占40.95%;刺五加MDD蛋白无跨膜区域,定位于膜外。(2)刺五加MDD基因在不同生长发育时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。在整个生长期中,MDD的表达呈现高-低-高-低的变化趋势,第一个表达高峰出现在萌芽期至叶片完全展开时,第二个高峰出现在果实体积快速增长期,最高表达量(叶片完全展开期)为最低表达量(叶片衰老期)的4.51倍;不同器官中,幼茎的表达量最高,为最低表达量(叶片)的7.22倍,但叶片、叶柄和根中的表达量差异不显著。研究结果为阐明刺五加皂苷的生物合成及对其进行表达调控奠定了基础。

刺五加鲨烯合酶基因的表达及其对皂苷含量的影响

为了了解刺五加鲨烯合酶基因(squalene synthase,SS)的表达特点及其对刺五加中皂苷含量的影响情况,以GAPDH基因为内参照基因,采用实时定量PCR技术,分析了SS基因在刺五加不同生长发育时期不同器官中的表达量及茉莉酸甲酯对其表达的影响情况;还利用SPSS 17.0软件分析了SS基因的表达量与刺五加中皂苷总含量的相关性。结果表明,在刺五加的整个生长期中,SS基因的表达量呈现出"低—高—低—高—低"的变化趋势:萌芽期(4月26日)该基因的表达量最低,而盛花期(6月26日)该基因的表达量最高,为萌芽期的3.11倍;SS基因在刺五加根中的表达量显著高于茎、叶和叶柄中的表达量(P<0.05),其在茎中的表达量最低,仅为根中表达量的51.88%。茉莉酸甲酯可提高SS基因的表达量,但其与对照组的差异未达到显著水平。刺五加中的皂苷总含量与SS基因的表达量间呈现出同升同降的变化趋势,存在极显著的正相关关系(P<0.01)。文中初步判定,鲨烯合酶是刺五加皂苷生物合成的关键酶。

刺五加组织培养与细胞工程进展

综述了国内外对刺五加组织培养与细胞工程研究的现状。分别从体细胞胚胎发生的影响因素外植体的发育程度和类型、培养基、植物生长调节剂的种类和浓度以及作用特点、体细胞胚胎的形态发生过程与解剖学和人工种子的包埋与萌发;茎尖外植体的离体培养与快速繁殖;根癌农杆菌和发根农杆菌对愈伤组织和新生体胚的遗化转化;毛状根培养生产刺五加次生代谢产物的研究现状进行了评述,并进一步分析了其中存在的问题,提出了一些建议。

刺五加HMGR基因的克隆与表达分析

根据已报道的人参HMGR(3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶)基因cDNA序列设计引物,利用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加HMGR基因的全长cDNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析。通过RT-PCR法检测HMGR在刺五加不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果克隆到长度为2 217 bp的刺五加HMGR基因cDNA序列,开放阅读框全长1 713 bp,编码570个氨基酸残基,包含HMGR家族的特异性识别序列。HMGR蛋白存在2个跨膜区域。RT-PCR结果显示,刺五加HMGR基因在各生长发育时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异,其中萌芽期的表达量最高,盛花期最低;各器官中,幼茎中表达量最高,是根中的1.58倍。

刺五加的无菌发芽研究

为了克服刺五加种子的深休眠特性,我们切开层积处理和未经层积处理的刺五加种子后,培养在添加了0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L BA的MS和1/2 MS培养基中进行无菌发芽试验。结果表明,层积处理是刺五加种子萌发的必须条件,切去子叶端1/3后,使培养7、14、21 d的发芽率分别由5.0%、42.5%和72.5%提高到34.0%、69.1%和90.1%。BA显著促进了刺五加种子的萌发。10 g/L蔗糖处理的发芽率显著高于0和30 g/L处理的发芽率。MS和1/2 MS培养基的发芽率间无显著差异。

三萜皂苷的生物合成

异戊烯二磷酸在香叶二磷酸合成酶、法呢二磷酸合成酶、鲨烯合成酶和鲨烯环氧酶催化下合成2,3-氧化鲨烯,再经氧化鲨烯环化酶催化形成各种三萜类,三萜类经细胞色素P450、糖基转移酶和β-糖苷酶的修饰,形成各种类型的三萜皂苷。

刺五加内生真菌对刺五加苷B和E含量的影响

[目的]分析内生真菌对刺五加中刺五加苷B、E含量的影响。[方法]以分离自不同产地的刺五加内生真菌为试材,以伤口法回接,HPLC法测定刺五加苷B、E含量。[结果]结果表明,25株内生真菌中有16株为致病菌,9株为非致病菌。其中来自产地吉林省梅河口市刺五加的菌株P116-1a、P109-4、P116-1b和P312-1均不同程度地提高了刺五加茎、根茎中刺五加苷B、E的含量。[结论]刺五加内生真菌可通过产生的代谢物调节刺五加苷B、E的含量。

不同性别刺五加皂苷合成酶基因表达及其对皂苷含量的影响

为了解不同性别刺五加中3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(mevalonate diphosphate decarboxylase,MDD)和法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因的表达特点及其对皂苷含量的影响,以GAPDH基因为内参照基因,通过实时定量PCR技术分析了不同性别类型刺五加中HMGR、MDD和FPS的表达量,并利用SPSS 17.0软件分析了其与刺五加总皂苷含量的相关性。结果表明,HMGR、MDD和FPS基因的最高表达量和皂苷含量的最大值均出现在短花丝类型刺五加中,中花丝类型的次之,长花丝类型的最低。HMGR、MDD和FPS的表达量和皂苷含量间存在显著正相关关系。HMGR、MDD和FPS是决定不同性别刺五加中皂苷含量高低的关键酶。

刺五加葡萄糖基转移酶基因的克隆与表达分析

刺五加是中国的珍贵药用植物,UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase,GT)是催化其三萜皂苷类成分生物合成的关键酶。利用RT-PCR和RACE技术,从该植物中分离出全长为1 959bp的GT基因cDNA序列,该基因开放阅读框为1 827bp,编码一个含608个氨基酸的蛋白质,分子量为6.672 3×104ku。生物信息学分析结果显示,该蛋白包含GT家族的标志性序列,不存在跨膜区域,定位于细胞质中,属于参与植物次生代谢的GT-B型。表达分析的结果表明,刺五加GT基因在各生长时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。最大表达量出现在盛花期,为最低表达量(叶片衰老期)的1.81倍。各器官中,叶片的表达量最高,是最低量幼茎的1.64倍。

刺五加Cu/Zn SOD的克隆及内生真菌对其表达的影响

利用RACE技术从刺五加(Eleutherococcus senticosus Harms)中克隆到铜锌型超氧化物歧化酶基因(Cu/Zn SOD)的cDNA序列。获得的刺五加Cu/Zn SOD的cDNA长641 bp。基因内部含有1个长度为459 bp的开放阅读框,编码长度为152个氨基酸残基的蛋白质,预测分子质量为15.162 ku,理论等电点为5.29。刺五加Cu/Zn SOD氨基酸序列与其它植物的Cu/Zn SOD具有很高的相似性。相对定量RT-PCR的结果表明,回接内生真菌菌株P116-1a、P116-1b、P109-4和P312-1后可显著提高刺五加Cu/Zn SOD基因的表达量(P<0.05),最大表达量出现在菌株P312-1回接60 d时,达对照的4.99倍。

不同温度、时间层积处理对刺五加种子发芽的影响

为了提高刺五加种子的发芽率,将两个不同产地的刺五加种子进行不同温度、时间的促进生理后熟和打破休眠的处理。结果表明,高温处理虽然能够促进种胚个体大小的发育,但不能打破种子的休眠,因此和低温处理一样发芽率为0。变温处理使胚长由最初的0.2mm伸长到3.1mm,发芽率达到12.0%。随促进生理后熟处理时间的延长,种子的胚长和发芽率均呈上升态势,处理160d的平均胚长(2.9mm)和发芽率(62.7%)达到了最高。打破休眠处理的时间以60d的平均发芽率为最高(27.1%)。

利用随机扩增多态性DNA技术分析刺五加的遗传多样性

目的从DNA水平对收集的4个产地的刺五加进行遗传多样性分析，为更好地开发利用刺五加资源奠定基础。方法随机扩增多态性DNA（RAPD）技术分析遗传多样性，UPGMA进行聚类分析。结果10个随机引物扩增得到72条片段，多态性位点比率为88．89％。不同产地间的遗传相似系数在0．4693—0．7851之间，均值为0．6293，同一产地不同居群间的遗传相似系数在0.5630-0.9542之间，均值为0.7644。不同产地刺五加之间的遗传多样性高于同一产地不同居群的个体，其中产地穆棱的刺五加与产地和龙、本溪、尚志之间的相似性较低，单成一支。产地之间的相似性与地理距离呈不完全相关性。结论刺五加种群内部具有较高的遗传多样性，利用RAPD技术分析刺五加的遗传多样性是可行的。