新医科与新工科融合背景下医学统计课程教学探索及实践

在健康中国建设以及新医科建设的大背景下,为临床医学和公共卫生提供实验设计和统计分析方法的医学统计课程的教学面临诸多困境,需要新的探索与实践。基于在医学统计学和实验设计方面的多年教学实践与经验,系统分析当前医学统计教学效果不佳的主要原因包括如下几个方面,医学教育对医学统计的重视程度不够、教材和教师与教学需求相关性弱、教学模式单一和学生主动学习和兴趣较低。并提出“六位一体”的教学改革思路和教学实践,包括增强思政教育和增加对医学统计学的重视程度、明确新医科背景下医学专业对医学统计的新需求、优化教师知识体系、修订教学内容、改革教学方法和强化过程管理等,以满足新医科建设的医学统计课程教学改革思路与措施。

震荡流促进内皮细胞炎症的染色质调控机制

目的以内皮细胞炎症为主要特征的动脉粥样硬化(AS)好发于血管的弯曲和分叉等震荡剪切应力(OSS)区域。课题组前期研究发现震荡剪切应力通过上调血管内皮细胞中应激颗粒关键蛋白G3BP2表达和应激颗粒形成介导内皮炎症,本研究主要是为了揭示应激颗粒调控内皮炎症的机制。方法使用微流控和平板流动腔系统进行力学加载,使用免疫荧光,活细胞实时示踪染色质等方法。结果首先发现震荡剪切应力促进内皮细胞细胞核变小,基于团队开发的细胞核力学检测FRET探针,发现震荡剪切应力降低细胞核的力学传递。随后对测序结果分析,发现调控染色质相关酶的表达改变显著,通过建立H2B和H3K9me2/3标记染色质和异染色质的稳定细胞株,利用超分辨显微镜观察EC染色质重排过程,结果显示异染色质快速下降,并且向核质扩散,引起染色质重排。进一步通过构建G3BP2敲除和过表达系统,研究应激颗粒对内皮细胞异染色质重排的机制,发现应激颗粒能调控染色质重排和内皮细胞炎症。结论本研究从无膜细胞器与细胞核合作的角度揭示了震荡剪切应力应激介导内皮炎症的新机制,有助于为血管病变提供临床诊断和防治的新思路。

血管内皮细胞吞噬不同电荷纳米颗粒的力学生物学研究

目的纳米颗粒(NPs)具有良好的生物分布、稳定性和持续释放动力学,已被广泛应用于生物医学系统。通过静脉给药的NPs会被血管最内层的内皮细胞吞噬。然而,NPs的电荷如何影响血管内皮细胞吞噬仍不清楚。因此,本研究旨在探讨血管内皮细胞对不同电荷NPs的吞噬情况。方法氨基和羧基修饰的聚苯乙烯NPs分别作为正电荷NPs(p NPs)和负电荷NPs(n NPs),人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为吞噬细胞,在低剪切应力条件(LSS)和层流切应力条件(NSS)下吞噬NPs3 h,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对吞噬后细胞内的荧光强度进行对比。利用Apo E-/-小鼠模型和小鼠部分颈动脉结扎模型,体内模拟振荡剪切应力(OSS),以研究不同剪切应力对HUVEC吞噬不同电荷纳米颗粒的影响。利用不同化学抑制剂抑制吞噬过程,以研究HUVEC吞噬两种纳米颗粒的路径。结果体内外模型证明,LSS和OSS条件下,与p NPs相比,HUVEC吞噬n NPs更多;吞噬后,大多数p NPs与溶酶体共定位。利用不同化学抑制剂抑制吞噬过程,发现HUVEC吞噬不同电荷纳米颗粒可能经历不同的吞噬路径。结论LSS和OSS条件下,HUVEC更容易吞噬n NPs,且HUVEC吞噬不同电荷纳米颗粒可能经历不同的吞噬路径。

细胞核骨架蛋白Lamin A对细胞命运的调控和机制研究

目的Lamin A作为细胞核骨架蛋白,由基因LMNA编码,是外界机械力刺激的细胞核内响应器。研究显示Lamin A在组织硬度较高的细胞和分化程度较高的细胞中高表达,而在较软的组织和细胞中表达量较低。本研究期待阐释调控Lamin A是否能直接诱导细胞命运转化及相关机制。方法通过课题组开发的细胞核力学FRET荧光探针来分析细胞核硬度,通过RNA-seq、实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹、免疫荧光以及CUT&Tag等实验研究细胞命运和机制。结果发现敲除成肌细胞或者成纤维细胞中LMNA后细胞和细胞核均变软,发现敲除LMNA后细胞中高表达神经相关基因,并且H3K9me2、H3K9me3标记的异染色质区域解散,H3K9me2在核周的富集减少,H3K9me3斑点变小变多。同时,视磺酸处理同样可调控核周异染色质下降和细胞命运改变。为了验证视磺酸调控染色质分布的机制,通过FHA2与全长Lamin A构建Lamin A磷酸化的FRET探针,结果显示视磺酸能调控Lamin A磷酸化参与细胞命运调控。结论本研究揭示了调控Lamin A表达和修饰能促进细胞命运转化及其表观遗传调控机制,对于再生医学有着重要的意义。

仿生SUN力传递的活细胞核张力FRET探针开发与应用

目的细胞核力学在生理和病理过程中发挥至关重要的作用,细胞核力学却难以测量。为此,本研究的目的在于开发一种能用于定量和可视化活细胞核力学传递的工具。方法根据FRET生物探针的设计原理,以公认的负责力学传递的LINC复合物中SUN蛋白为模型分子,开发了一种基于FRET的细胞核张力传感器(Nuclear Tension Sensor,Nu TS)。随后验证了Nu TS对细胞收缩性、LINC复合物完整性、ECM硬度以及细胞核形变(整体和局部)的响应,并利用Nu TS考察了细胞铺展、细胞核变形、细胞迁移以及胚胎发育或组织成熟过程中的细胞核力学特性。结果细胞收缩性降低可以减小细胞核受力,完整的LINC复合物有利于细胞核受力;与软基底相比,细胞核在硬基底表面受力更大;高渗条件使细胞核受力降低而低渗条件使细胞核受力增加;Nu TS对局部力学刺激过程中细胞核力学变化也具有快速而灵敏的响应。细胞核受力在细胞黏附铺展过程中会逐渐增大;而在细胞迁移过程中,相对于尾端,细胞核前端受力更大。体内实验表明,在斑马鱼胚胎中,不同部位的脊索组织及其成熟过程均呈现不同的细胞核力学特性。结论本研究开发的Nu TS可以快速灵敏地测量和动态可视化细胞核力学变化,为监测生理或病理过程中细胞核力学变化提供了一种可能。

血流剪切应力与内皮细胞命运

血管发育和稳态维持以及血管病理进程均依赖于血管内衬的内皮细胞(endothelial cells,ECs)。ECs与血液直接接触并受到血流剪切应力的作用,血流剪切应力通过调控ECs的发育和细胞命运等生物学过程来调节血管稳态。ECs命运转化主要包括生理条件下通过内皮-造血干细胞转化(endothelial-to-hematopoietic transition,EHT)产生造血干/祖细胞进入循环系统,以及病理条件下经内皮-间充质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)形成间充质细胞参与血管狭窄等,这两种命运转化的共同特点之一是细胞间黏附分子和黏附力的破坏。本文旨在概述血流剪切应力调控内皮细胞EHT和EndMT的分子机制,将提升对心血管发育和相关疾病发生机制的理解。

新工科背景下高校生物类实验室安全教育管理思考与探索

近年来,教育部多次强调高校要保障实验室安全建设,但实验室安全事故仍有发生,尤其是生物类实验室存在的隐患多、风险大。该文分析当前高校生物类实验室面临的主要问题,结合重庆大学实验室安全管理的经验,从管理机制建设、基础保障建设,安全文化建设、实验队伍建设、仪器设备管理、试剂药品管理、废弃物管理、安全监督检查等方面,探索在新工科背景下如何提升高校生物类实验室安全管理水平,更好服务于教学和科研活动。

血流动力学与动脉粥样硬化斑块的稳定性及其机制

薄纤维帽斑块破裂以及随后的血栓形成是心肌梗死的主要原因。文章通过总结斑块的特点、斑块处的血流动力学环境,分析血流动力学因素在动脉粥样硬化的形成、发展以及破裂中的地位和作用,认为切应力是斑块形成过程中的重要因素,斑块所承受的周向应力和斑块的内应力是斑块破裂的重要因素。

分化抑制因子1参与氧化型低密度脂蛋白调控的血管新生

目的探讨分化抑制因子1(Id1)蛋白是否参与氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)调控的血管新生,并阐明Id1参与血管新生的机制。方法通过体外内皮细胞管腔形成和大鼠胸腹主动脉血管环实验来研究低密度脂蛋白对血管新生的调控作用,West-ern blot分析ox-LDL对Id1表达的影响,免疫荧光检测ox-LDL对Id1分布的调控。并通过信号通路抑制剂来分析Id1受ox-LDL调控的分子机制。结果低浓度的ox-LDL促进血管新生,而高浓度的ox-LDL抑制血管新生。ox-LDL上调内皮细胞Id1蛋白的表达,当ox-LDL浓度为5 mg/L时,Id1蛋白的表达显著上调,并且随着ox-LDL浓度增加,Id1蛋白表达继续上调,但相互之间并没有显著差异。高浓度的ox-LDL显著上调Id1蛋白的表达而抑制血管新生。我们进一步研究ox-LDL对内皮细胞Id1分布的影响,发现低浓度的ox-LDL促进Id1蛋白出核,而高浓度的ox-LDL抑制Id1蛋白出核。通过使用蛋白出核抑制剂lyptomycin B,我们发现ox-LDL调控Id1蛋白出核受CRM1/exportin信号控制。进一步通过使用PKA抑制剂H89和PI3K抑制剂LY294002研究发现低浓度的ox-LDL促进Id1蛋白出核是受PI3K信号通路控制的。结论 PI3K信号通路通过促进Id1蛋白出核参与低浓度ox-LDL上调的血管新生。

Id1-p53调控血管新生参与高切应力介导的易损斑块形成的机制

目的本课题组针对至今难以解释临床上动脉粥样硬化(As)易损斑块发生在高切应力区域的现象,在前人和本室前期研究基础上,从血管新生的视角入手,提出血管新生是导致As易损斑块发生在狭窄上游高切应力区域的重要因素、切应力通过Id1-p53信号通路调控血管新生的理论假设,并通过实验予以验证。方法通过动物模型和体外实验相结合研究切应力如何调控斑块内血管新生和易损斑块的形成及Id1-p53信号途径调控血管新生的机制。结果通过构建兔颈动脉狭窄模型发现,易损斑块主要发生在狭窄血管近心端的高切应力区域,高切应力区域斑块内有大量的血管新生,并且大部分的新生血管为周细胞、外膜不完整的容易破裂的微血管。体外实验的研究发现转录因子Id1蛋白的表达和分布受切应力和氧化型低密度脂蛋白的调控。并且Id1-p53信号通路是切应力和氧化型低密度脂蛋白调控血管新生的重要信号通路。目前正进一步通过使用血管新生抑制剂TNP-470在体验证血管新生就是高切应力引起易损斑块形成的重要因素。结论斑块形成引起的狭窄血管近心端的高切应力主要是通过促进斑块内血管新生引起易损斑块的形成,Id1-p53信号通路是切应力调控血管新生的重要信号通路。本研究不仅有助于阐明易损斑块在高切应力区域的发生机制,明确动脉粥样斑块内血管新生在切应力介导的As易损斑块形成中的作用,而且将为易损斑块的临床治疗提供新的靶点。

水平回转培养对斑马鱼血管发育的影响

随着空间生命科学的发展,微重力对生命体的影响已成为科学家们日益关注的问题。多数研究表明,微重力对生物体胚胎早期发育有着重要影响,而血管系统作为胚胎最早行使功能的系统备受关注。目前关于微重力对血管发育影响的研究大多来自对离体培养细胞的体外回转模拟实验,在体实验相对较少。文章利用斑马鱼作为模式动物,在体探究水平回转培养环境下斑马鱼胚胎早期发育及水平回转培养对其血管系统发育的影响。在斑马鱼受精后24 h(24 hpf)时进行水平回转培养处理,至36 hpf时收集胚胎,通过体视显微镜观察斑马鱼表型变化,通过半定量RT-PCR、qPCR及全胚原位杂交等手段对比水平回转培养环境下与对照组血管相关因子的表达情况,并通过BrdU掺入及TUNEL法进行斑马鱼全胚细胞凋亡及增殖检测。结果表明,在90 r/min水平回转培养环境下,斑马鱼死亡数量没有差异,24 hpf时破壳数量显著降低(10.3±0.41 vs.0.0,P<0.05),心率显著加快(223.5±2.32 vs.185.0±3.23,P<0.05),黑色素明显增加,动静脉发育紊乱,且在120 r/min转速下,胚胎血管特异性表达因子flk1、flt4及ephrinB2的表达均显著降低,斑马鱼细胞凋亡明显增加,而细胞增殖无显著差异,提示水平回转培养对斑马鱼胚胎发育特别是早期血管发育具有重要影响。

血管内皮细胞屏障功能的血流动力学调控及其与动脉粥样硬化的关系

动脉粥样硬化是心脑血管疾病的重要病理基础。内衬于血管的内皮细胞是血管壁与血流之间的一道具有选择通透性的屏障,对于维持血管内环境稳态发挥重要作用。血管内皮屏障功能的紊乱是动脉粥样硬化发生发展的重要环节之一。近年的研究表明血流动力学能明显影响血管内皮细胞屏障功能。扰动流和振荡流等异常血流形态能改变血管内皮的通透性,甚至形成动脉内膜破裂。本文通过聚焦内皮细胞内外侧的物质交换、动脉内膜破裂方面的最新研究成果,评述血流动力学变化对血管内皮细胞屏障功能的影响,讨论了值得进一步深入研究的领域,以期为进一步阐明动脉粥样硬化发生发展机制以及有效防治策略的选择提供一个新的思路。

基底刚度对血管内皮细胞生长与增殖的影响

目的:以细胞生长所粘附的胞外基底的力学特性为对象,通过将人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)接种于不同刚度的基底上,借以阐明基底刚度对其生长和生物学活性的影响。方法:以双丙烯酰胺和丙烯酰胺复合物为原料,构建不同基底刚度基底膜,经灭菌且胶原交联后接种HUVECs,分别进行MTT试验、鬼笔环肽细胞染色以及流式细胞技术检测细胞的生长周期。结果:随着基底刚度的增强,HUVECs增殖的速度明显受到抑制(P<0.01);且细胞形态和生长周期也出现相应的变化。结论:基底刚度的改变在HUVECs的生长和增殖方面均有较大的影响,这可为进一步解释动脉粥样硬化中血管内皮细胞形态和功能紊乱提供了相应的生物力学依据。

支架植入位置对狭窄血管段支架内再狭窄影响的力学分析

背景经皮冠状动脉介入作为治疗动脉粥样硬化等心血管疾病最有效的方式,近些年在临床上得到广泛应用,但血管晚期血栓和支架内再狭窄等问题却并没有得到彻底解决。研究表明,支架植入会使血管壁产生非生理性组织应力,支架植入后血管内血流动力学微环境的改变会诱发支架内再狭窄。支架植入位置的不同也会对血管内力学环境产生重要影响,但相关研究却少有报道。因此,深入了解支架植入不同位置对血管力学微环境的影响,对于临床上优化支架放置以及缓解支架内再狭窄有重要意义。方法采用有限元方法模拟了支架扩张过程中狭窄血管的力学响应,通过球囊损伤法构建了兔颈动脉狭窄模型,并根据支架与狭窄血管中心区域的相对位置构建了支架植入的近心、中心、远心三种模型,对术后血管内血流动力学特征进行了分析。随后将支架段血管划分为前、中、后三个区域,对三个区域内的血流动力学参数进行了与支架植入位置之间的等级相关性分析,探究了支架位置的变化对于支架不同区域血流动力学特征的影响,并通过血管形态学观察对计算结果进行了验证。结果(1)计算模拟结果显示,血管壁最大应力出现在支架前、后端,而低剪切应力、高震荡剪切等血流动力学特征主要出现在支架前端,在支架后端血流动力学特征不明显,因此支架前端血管出现再狭窄风险较高。(2)支架前端血流动力学特征与支架植入位置存在显著相关性(rTAWSS=-0.718,rOSI=0.898,rRRT=0.818,P<0.01)。随着支架位置向远心移动,即从近心模型到远心模型,支架前端血管内膜增厚的程度加重,而支架中后端血管内膜增厚无显著差异,表明支架位置的变化对支架前端血管重构产生显著影响。结论支架植入会显著改变血管内的力学环境,在支架前端形成促动脉硬化斑块新生的区域,随着支架位置的不断靠后,支架前端对支架内再狭窄的影响更加显著。因此,临床支架介入术中需对支架的放置做进一步优化。

血流动力学调控血管重塑依赖性的斑马鱼尾部静脉血管的形成

血管新生是指血管内皮细胞在原有的血管基础上通过出芽、迁移和增殖等方式形成新的毛细血管网络。随后,为了进一步适应组织器官的氧和营养的需要,整个血管网络会进行血管重塑,在此过程中会选择性地修剪一些局部的毛细血管,进而成熟为具有明确分级的功能化的血管网络结构,这一过程叫做血管修剪(vascular pruning)[1-2]。越来越多的文献报道血流动力学在血管修剪过程中扮演了非常重要的角色[3]。然而,至今关于血流动力学调控血管修剪的机制尚未阐明。为了明确斑马鱼尾部静脉血管的形成是否涉及血管修剪等过程,首先观察了斑马鱼尾部静脉血管发育的整个过程。实验结果表明:在受精后24 h(24 hpf)左右斑马鱼尾部静脉开始血管新生,到32 hpf左右形成复杂的静脉毛细血管网络丛。随后,腹侧的斑马鱼尾部静脉血管丛开始进行剧烈的血管重塑,多个小毛细血管逐渐变成一个大的连续的血管,到60 hpf左右形成形态结构明确管腔较大的尾部静脉;一旦尾部静脉完全形成,剩余的尾部静脉毛细血管丛逐渐越来越少,在受精后7.5 d(7.5 dpf)基本消失。随后,又通过激光共聚焦显微镜对斑马鱼尾部静脉血管进行实时动态观察,结果发现斑马鱼尾部静脉血管的形成包括了l血管融合(vascular fusion)和血管修剪两个过程。在临近的毛细血管在融合过程中,他们之间的空腔先是很快变小,随后缓慢消失,最终形成尾部静脉血管。相反,在血管修剪过程中,其中一个分叉血管的半径逐渐变大保留下来变成了尾部静脉血管;另外一个血管的半径逐渐变小,最终被修剪掉。进一步研究发现,血流速度在血管融合和修剪过程中的作用不一样。当两根分叉血管中的血流速度相同时,分叉的血管进行融合;当两根分叉血管中的血流速度存在差异时,血流速度低的血管将进行修剪,血流速度大的血管将保留。进一步研究发现,轻微降低斑马鱼尾部静脉血管中的血流速度会明显导致有分叉的血管不能发育成完整的尾部静脉血管,这些结果表明血流动力学在斑马鱼尾部静脉血管发育中扮演了非常关键的作用。其次,发现转录因子klf6a响应血流动力学调控斑马鱼尾部静脉血管的发育。通过基因编辑技术建立了klf6a的突变体,结果发现敲除klf6a抑制尾部静脉内皮细胞的迁移,从而导致分叉的血管不能形成完整的尾部静脉血管。体外实验表明沉默KLF6不影响原代内皮细胞响应流体剪切应力的重排,但是明显抑制内皮细胞的迁移以及F-actin和VE-Cadherin在黏附连接处形成生物力学表界面[4]。机制上,通过RNAseq发现tagln2在klf6a下游调控斑马鱼尾部静脉血管的发育。体内和体外实验验证表明KLF6沉默导致明显的TAGLN2表达的下调。并且沉默TAGLN2抑制了内皮细胞的迁移以及流体剪切应力诱导的F-actin和VE-Cadherin在黏附连接处形成生物力学表界面。最后,在斑马鱼胚胎中沉默tagln2明显抑制尾部静脉内皮细胞的迁移,从而导致分叉的血管不能形成完整的尾部静脉血管。总之,结果表明斑马鱼尾部静脉血管的发育是一个受血流动力学调控血管修剪和融合的过程,这将为血管重塑的研究提供了一个比较好的模型。

过氧化体增殖物激活型受体y激动剂罗格列酮对血管新生的影响及作用机制

目的抑制病理性血管新生是减缓肿瘤和动脉粥样硬化等血管相关疾病发生发展的重要策略。过氧化体增殖物激活型受体1（PPARy）激动剂罗格列酮作为治疗1I型糖尿病的有效药物，对血管新生有显著的调控作用，但是目前研究对罗格列酮和血管新生的关系存有较大争议。本研究利用斑马鱼等在体、离体和体外的血管新生模型探讨罗格列酮对血管新生的调控作用及可能机制。方法和结果结合斑马鱼在体血管新生模型、大鼠腹主动脉环离体血管新生模型、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）体外血管新生模型综合研究PPARy激动剂罗格列酮对血管新生的影响，

分化抑制因子调控血管新生参与易损斑块形成的力生物学机制

目的本研究旨在了解分化抑制因子（Idl）参与切应力和脂蛋白调控血管新生的作用，为阐明狭窄血管近心端的高切应力通过刺激内皮细胞血管新生进而引起易损斑块形成及其分子机制提供科学依据。方法采用小鼠左颈总动脉狭窄模型．给小鼠饲喂高脂饲料，进而研究斑块的组成，血管新生数量。通过血管新生抑制剂（TNP-470）对模型组注射治疗，研究治疗组斑块的形成和血管新生情况。在正常和模型组血管中分别对血管新生8个相关基因Idl、VEGF等免疫染色检测其表达量。检测Idl和VEGF过表达和干扰条件下血管新生的情况。结果数值模拟显示，狭窄血管近心端为高切应力区域；进一步通过新西兰大白兔左颈动脉狭窄模型，测得狭窄血管近心端相对远心端为高切应力区域。