三角帆蚌瘟病的组织病理研究

对健康及患瘟病三角帆蚌的１３种脏器组织作了系统的形态结构观察和组织化学分析，结果表明，三角帆蚌瘟病的组织病理变化主要集中在病蚌的肝脏、胃和直肠等组织。病毒侵袭蚌体后，肝脏的吸收细胞、未成熟细胞以及胃、直肠的纤毛上皮细胞内出现病毒包涵体，ＤＮＡ和ＲＮＡ等正常代谢受到抑制，ＡＫＰ和ＡＣＰ酶的活性和分布发生异常，细胞内消化作用受阻，最后病变细胞解体，导致肝脏、胃和直肠等的广泛受损。病蚌因消化系统坏死和消化功能丧失而死亡。还就正常三角帆蚌消化系统的结构与功能作了探讨。

应用Dot－ELISA技术检测草鱼出血病病毒的研究

报道了斑点免疫吸附ＥＬＩＳＡ（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）快速检测草鱼出血病病毒（ＧＣＨＶ）的方法以及对提纯病毒、染毒细胞内病毒和病鱼组织的检测结果，并对该方法的灵敏度与ＳＰＡ－ＣｏＡ和常规ＥＬＩＳＡ法进行了系统的比较。结果表明，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检出ＧＣＨＶ的最低含量为３ｐｇ，该灵敏度比ＳＰＡ－ＣｏＡ和常规ＥＬＩＳＡ法分别提高１０倍和２０倍，而且快速易行，是目前检测ＧＣＨＶ最为有效的方法，并可在草鱼出血病临床诊断和病毒疫苗质量鉴定等方面得到应用。

病毒诱导草鱼产生干扰素活性因子的研究

采用细胞病变抑制法测定了病毒诱导前后草鱼外周血中干扰素的活性变化。结果表明，经病毒诱导的草鱼血清中出现明显的干扰素抗病毒活性，２５℃水温下诱导３天，其活性达到高峰，在草鱼细胞中的效价（Ｌｏｇ２ＣＰＥＩ５０／０．１ｍｌ）可达１１．０８±０．５８以上。草鱼血清干扰素具有１０００００ｇ离心不沉降，耐热，在ｐＨ２．０－１０．０范围内活性稳定，抗ＤＮａｓｅ和ＲＮａｓｅ，对胰蛋白酶、糖苷酶和ＮａＩＯ４敏感等性质，其抗病毒作用依赖于细胞内ＲＮＡ和蛋白质的合成。在鱼类细胞中具有抑制不同病毒的能力，但在人、哺乳类、鸟类和贝类等细胞中无抗病毒作用，表现出抗病毒的广谱性和相对的种属特异性。

三角帆蚌十六种同工酶系统的表型及其在瘟病病蚌中的病理变化

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对我国三角帆蚌(Hyriopsis cumingii Lea)11种组织中16种同工酶系统的酶谱表型、组织分布、活性含量和迁移特征进行了分析,并就不同酶谱特征与基因表达状况作了讨论。证实酯酶和α-磷酸甘油脱氢酶的表型和活性含量在病蚌体内有明显的紊乱现象,表明三角帆蚌瘟病的病理机制与消化系统脂类代谢异常有密切关系。消化系统两种酶谱的特异性变化,可作为瘟病早期诊断的生化辅助指标。

草鱼干扰素诱生条件的研究

草鱼干扰素 (IFN)诱生条件与规律的研究结果显示 ,病毒侵染草鱼后能迅速诱导IFN的合成 ,2 4h即可在血清中检测到IFN活性 ,3d后活性达到高峰。草鱼IFN的合成受温度、病毒种类、病毒剂量、鱼体营养状况等因素的影响。 2 5℃水温下诱生的IFN活性明显高于 15℃和 8℃。RNA病毒的诱生能力高于DNA病毒 ,其中以双链RNA病毒GCHV的诱生能力最强。在急性致死剂量以下提高病毒感染剂量以及维持鱼体的正常营养状况 ,有利于提高IFN的产量。用适量IFN或灭活GCHV预注射草鱼 ,作起动或预诱导处理 ,能显著促进IFN的诱生。病毒活性、鱼龄大小对IFN的诱生无显著影响。

从草鱼细胞分离到一种抗出血病病毒蛋白因子的研究

从人工诱变筛选的草鱼抗出血病病毒AHZC88细胞中检测到一种高效的抗病毒因子,经(NH_4)_2SO_4沉淀,PAGE洗脱和HPLC分离,得到纯化的抗病毒蛋白。该蛋白在出血病病毒的敏感细胞株ZC7901和CP80上表现出很强的抗病毒活性,平均滴度Log_4CPEI_(50)/0.1 ml在7.10±0.10(±S)以上。理化性质研究表明,该因子100000g离心不沉降,抗酸,不耐热,等电点为5.2。转译后分子量为29kD,经糖基化修饰成为38kD和36kD两种糖肽,未检出明显的磷酸化修饰,其沆病毒作用依赖于细胞内RNA和蛋白质的合成,并存在一定的细胞或病毒特异性。该因子在鱼体中有明显的抗病毒感染作用,能降低发病率,延缓发病时间。

PHA体外诱导草鱼白细胞产生γ-干扰素的研究

于 1 997年 1 0月— 1 999年 3月 ,采用半数细胞病变抑制等方法 ,进行植物凝集素(Phytoagglutinin ,PHA)体外诱导草鱼白细胞产生γ 干扰素的研究。结果表明 ,在PHA诱导的草鱼白细胞培养液中出现了一种抗病毒因子 ,经理化和生物学性质鉴定证明 ,该因子是一种干扰素活性物质。但它不同于病毒诱导的α/β 干扰素 ,主要表现为 :对 56℃、pH =2和0 1 %SDS敏感 ;其活性不能被病毒诱导的干扰素抗体所中和 ;其诱生剂为PHA ,来源于白细胞 ;在诱导条件上 ,佛波酯 (PMA)和白细胞介素 2 (IL 2 )能显著地促进其诱生 ,这些特性与人类和高等脊椎动物中报道的γ 干扰素相符 。

三角帆蚌瘟病病毒的精细结构与基因组及多肽的研究

从自然发病蚌分离的三角帆蚌瘟病病毒(Hyriopsis cumingii Plague Virus,HcPV)呈球形或多形态,直径40～210nm。病毒外被厚7.9nm的脂质囊膜,表面布满长12nm的棒状突起,内嵌有20nm的砂样颗粒。核衣壳由串珠状物构成。在包装入病毒前呈杆形核衣壳,直径约12nm,长度30～340nm不等。以后经3～5个圈的螺旋化,成为直径40～70nm的螺线管核衣壳,包装在病毒中。病毒基因组由33S,28S、22S、18S和5S等5个分节段的单链RN A组成,其中33S和22S RNA结合于核衣壳中,为病毒特异性基因片段。4个大片段RNA的分子量分别为2.4、1.9、1.2和0.7×10~6D。病毒多肽组分有4个,分子量为VP1 46kD,VP2 41kD,VP339kD,VP4 18kD。其中VP1为非糖基化的核蛋白,是核衣壳的多肽成分,VP2和VP3为糖肽,分别构成囊膜及囊膜外突起。VP4的含量较低。

草鱼干扰素的免疫调节功能

首次对草鱼干扰素 (grasscarpinterferon ,GcIFN)的免疫调节功能进行研究。结果表明 :GcIFN对草鱼巨噬细胞 (Mφ)具有显著的激活作用 ,它能提高Mφ内O-2 、H2 O2 和ACP的活性与含量 ,促进Mφ的吞噬和杀菌作用。GcIFN对Mφ的激活效应随剂量的增加而增强 ,激活所需要的时间则随剂量的增加而减少。与调节Mφ的规律不同 ,GcIFN对草鱼淋巴细胞无直接的激活作用 ,但可以调节由PHA、ConA引起的T淋巴细胞转化以及由SPA、LPS引起的B淋巴细胞转化 ,GcIFN对淋巴细胞的调节作用具有正负两方面的效应 ,当GcIFN浓度为 2 5 0～ 5 0 0U/ml和 5 0～ 5 0 0U/ml时 ,分别对T、B淋巴细胞转化表现为促进作用 ,而当浓度提高至 5 0 0 0U/ml时 ,则对两种淋巴细胞的转化产生抑制作用。

草鱼γ样干扰素的体内诱导

采用细胞病变抑制等方法 ,在植物凝集素 (Phytoagglutinin ,PHA)诱导的草鱼血清中检测到一种干扰素。理化和生物学性质鉴定表明 ,它不同于病毒诱导的α/ β 干扰素 ,表现在对 5 6℃、pH2和 0 .1%SDS敏感 ,其活性不能被α/ β 干扰素抗体所中和 ,其诱生剂为非病毒性质的有丝分裂原 ,诱生作用受佛波酯 (PMA)和白细胞介素 2(IL 2 )的调节 ,这些特性与人类和高等脊椎动物中报道的γ干扰素相符 ,表明是一种γ样性质的干扰素。草鱼γ样干扰素的体内诱导受环境温度、诱导时间、PHA剂量等因素的影响 ,2 5℃或 30℃水温诱导的干扰素活性明显高于 15℃或 8℃。高剂量 (每尾 0 .5～ 0 .8mg)PHA诱导的干扰素活性明显大于低剂量 (每尾 0 .1～ 0 .3mg) ,且达到活性高峰所需要的时间短 ,为 3d ,而低剂量为 5d。PMA和IL

草鱼干扰素的分离纯化及某些理化和生物学特性

通过DEAE Sepharose阴离子交换层析、SephacrylS 2 0 0凝胶层析、高效液相层析和梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳等技术 ,对病毒诱生的草鱼血清干扰素进行了分离纯化。纯化的草鱼干扰素在SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈现单一组份 ,分子量为 38kD ,等电点为 5 .2 5 ,过碘酸 Schiff试剂反应表现为典型的糖蛋白染色特征。理化和生物学特性研究表明 ,草鱼干扰素具有 1 0 0 0 0 0g(2h)离心不沉降、耐热、在pH2 - 1 0范围内活性稳定、抗核酸酶 ,但对胰蛋白酶、糖苷酶和糖氧化剂NaIO4 敏感等性质 ,在鱼类细胞中具有抑制不同病毒的能力 ,但在人、哺乳类、鸟类和贝类等细胞中无抗病毒作用 ,表现出抗病毒的种属特异性 ,与高等脊椎动物α/ β干扰素的特性相一致。

草鱼血清中一种新的凝集素免疫因子

于 1 998年 5月— 2 0 0 0年 3月 ,在浙江省杭州市采集草鱼 ,采用硫酸铵盐析和梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 ,从血清中分离出一种自然凝集素 ,对其理化和生物学性质进行研究。结果表明 ,该凝集素能够识别和凝集多种不同的红细胞、细菌和酵母 ,具有 1 0 0 0 0 0g离心不沉降 ,不被透析 ,耐热、耐酸、耐碱 ,抗DNase、RNase、SDS和乙醚 ,对胰蛋白酶、糖苷酶、糖氧化剂NaIO4 和β -巯基乙醇敏感等特性 ,是一种分子量为 67kD、等电点为 6.2的糖蛋白分子。其活性能被半乳糖、乳糖、甘露糖和N -乙酰葡糖胺所抑制 ,其抗原特异性不同于草鱼凝集抗体IgM ,表明两者是不同的物质。草鱼凝集素能显著地促进巨噬细胞的吞噬、杀菌能力 。

草鱼干扰素的体外诱生及其组织细胞的来源

草鱼九种组织干扰素 (IFN)体外诱生试验结果表明 ,从头肾、脾脏、外周血和胸腺组织中均能诱生出IFN。进一步对四种组织的细胞组分进行分离和IFN诱导 ,证实IFN由其中的白细胞所合成。理化性质、中和试验、Dot ELISA和Western blot等研究表明 ,体外诱生的白细胞IFN与体内诱生的血清IFN是同一种物质。在此基础上 ,又对白细胞组分进行分离和IFN诱导 ,并结合免疫荧光标记技术 ,证实IFN由白细胞中的淋巴细胞所合成。进而采用灭活增殖细胞法 ,对T、B淋巴细胞进行了功能性分离和IFN诱导 。

草鱼出血病两种病原病毒的分离和致病性的研究

通过PEG和鱼精蛋白沉淀等方法,从草鱼(Ctenopharynogon idellus)出血病病鱼组织分离纯化出两种病毒.一种是直径70—80nm的病毒颗粒,六边形,有双层衣壳,无囊膜;另一种直径仅20—30nm的小病毒颗粒,也呈六边形.前者是呼肠孤病毒(Reovirus),以前已有报道;后者拟初步鉴别为小RNA病毒科(Picornaviridae)病毒.将两者分别感染1足龄健康草鱼,能复制出典型症状的草鱼出血病而致鱼死亡.呼肠孤病毒主要导致肠道出血的出血病,而小病毒颗粒导致肌肉出血为主的出血病.由此可以初步解释生产上出现两类出血病的原因.

红拟石首鱼海豚链球菌分离、鉴定及致病性研究

2001年9月—12月,浙江舟山部分网箱养殖红拟石首鱼发生了陆续死鱼,发病鱼表现为眼球突出、浑浊,失去方向性,皮肤溃疡等症状。从病鱼的肾脏和肝脏中分离到菌株SO-2和SO-3,对两分离株进行了致病性试验,发现两者对红拟石首鱼、罗非鱼及小白鼠均有致病力,SO-2和SO-3对红拟石首鱼、罗非鱼及小白鼠的LD50分别为4.8×108CFU/尾和1.9×107CFU/尾2、.8×108CFU/尾和8.3×107CFU/尾及9.6×106CFU/只和4.2×106CFU/只,试验感染鱼出现眼球突出、浑浊及失去方向性等与自然发病相似症状,确定该两株菌为致病菌。两分离株为革兰氏染色阳性,呈链状球菌,β溶血,10℃生长,45℃不生长;接触酶阴性,水解七叶灵、精氨酸;VP试验、脲酶和马脲酸试验阴性,发酵葡萄糖、水杨苷、蔗糖和淀粉,不发醇阿拉伯糖、菊糖、乳糖、蜜二糖、棉子糖和山梨醇。分离株对氨卞青霉素、万古霉素和先锋Ⅴ等高度敏感,对庆大霉素、复方新诺明、林可霉素、氟哌酸等不敏感。应用16SrRNA基因进行的菌株PCR鉴定,确定该两株菌为海豚链球菌。

抗菌和细胞毒活性海洋细菌的筛选及其次生代谢基因证据

从不同海域的海水、海泥和海洋生物中分离海洋细菌,利用琼脂扩散法和MTT法对细菌培养液的乙酸乙酯提取物进行了抗菌和细胞毒活性筛选,并对具有细胞毒活性的细菌菌株进行了16SrRNA系统发生学分析和多聚酮合酶(PKSⅠ型)、非核糖体肽合成酶(NRPS)的筛选。结果显示,在分离到的346株海洋细菌中,42株细菌具有抗菌活性,12株具有细胞毒活性。对12株具有细胞毒活性的细菌菌株进行了16SrRNA系统发生学分析,它们分别属于Agrobacterium,Pseudoalteromons,Bacillus,Paracoccus,Rheinheimera,Aerococcus,Exiguobacterium和Alteromonas8个属。对这12株具有细胞毒活性的细菌菌株进行进一步的PKS和NRPS筛选,得到了4株含有PKSⅠ型的KS结构域或NPRS的A结构域的海洋细菌,为从聚酮和非核糖体肽等生物合成途径去深入研究其次生代谢产物提供了基因学的证据。

鱼类免疫学研究进展

鱼类免疫学研究进展李亚南，陈全震，邵健忠，毛树坚王冀平（杭州大学生物与技术系杭州３１００１２）（浙江省测试技术研究所杭州３１００１２）关键词鱼类，免疫学，进展ＡＤＶＡＮＣＥＳＩＮＲＥＳＥＡＲＣＨＯＦＦＩＳＨＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ￥Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｆｉ...

六种重金属离子胁迫诱导鱼类细胞凋亡的研究

以草鱼 (Ctenopharyngodonidellus)ZC790 1细胞为研究模型 ,选用六种重金属离子进行胁迫诱导鱼类细胞凋亡试验 .结果显示 ,在Cd2 + 、Cr6+ 、Hg2 + 、Cu2 + 、As5+ 、Pb2 + 的胁迫作用下 ,ZC790 1细胞均出现了明显的染色质凝集、趋边化、形成凋亡小体等凋亡形态特征 ,核酸电泳显示DNA发生特异降解而呈现电泳阶梯 ,用末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP切口末端标记 (TUNEL)法 ,检测到DNA的 3′ OH断端均被原位特异标记 。

胚胎干细胞分化为肝细胞的研究进展

目前 ,细胞移植作为终末期肝病的辅助治疗方法 ,移植的细胞必须满足在受体肝脏中存活、增殖并可分化为成熟肝细胞两个重要条件 ,但目前应用的肝细胞来源有限 ,其功能随着培养时间的延长而逐渐下降等问题限制了这一治疗策略的广泛开展。作为具有发育全能性和无限增殖能力的细胞 ,胚胎干细胞向肝细胞的分化研究近年来引起了广泛的关注 ,并取得了较大的进展 ,寻找合适、高效的分化诱导方法是目前研究的热点之一。胚胎干细胞向肝细胞的分化研究既可以为临床细胞替代治疗提供合适的细胞来源 ,也可以在药物评估和肝脏发育分化基础研究方面起到重要的作用。通过概括肝脏和拟胚体分化发育的分子机制 ,对体外胚胎干细胞向肝细胞分化的几种诱导体系作了介绍 ,并对分化肝细胞的应用前景和存在的问题进行了讨论。