基于第三代PacBio测序技术的家蚕微孢子虫浙江株全基因组及其比较分析

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是危害家蚕养殖业的主要病原微生物,已在不同养蚕地区发现多种株型。本研究采用第三代基因组测序技术PacBio RSⅡ对分离自浙江地区的家蚕微孢子虫浙江株(N.bombycis Zhejiang)进行基因组测序,并对其基因组序列特征和基因功能注释进行分析。该微孢子虫基因组测序数据量为2.34 Gb,基因组大小为17.3 Mb,共拼接获得95个scaffolds,基因组覆盖深度达到138倍。比较基因组分析结果显示,N.bombycis Zhejiang与N.bombycis CQ1的基因组大小和GC含量相似,并且具有较好的基因组共线性关系。GO注释热图分析表明,不同微孢子虫基本功能分类基因丰度相似,但是浙江株在代谢过程等方面具有更高丰度。基于GLUT3氨基酸序列的系统进化分析显示,家蚕微孢子虫GLUT3蛋白主要分为2个亚家族,浙江株有3个GLUT3蛋白与CQ1株的亲缘关系最近,其余8个则与柞蚕微孢子虫形成进化支。利用实时荧光定量PCR对葡萄糖诱导后的浙江株GLUT3基因表达模式进行分析,结果表明,50 mmol/L葡萄糖诱导1 h后,A3834和A5849基因表达显著升高。各微孢子虫的GLUT3保守基序片段构成转运体的核心α螺旋结构,分子对接分析表明该片段氨基酸残基可能是葡萄糖结合和蛋白质稳定的关键位点。此外,家蚕微孢子虫2个GLUT3亚家族的蛋白序列长度、跨膜次数和平均疏水性均存在不同,推测2株家蚕微孢子虫在葡萄糖的摄取转运方面可能有所差异。研究结果为今后深入研究家蚕微孢子虫不同株型的进化机制和与宿主的相互作用提供了支撑。

家蚕模式生物研究进展

家蚕不仅是重要的经济动物和鳞翅目昆虫的典型代表,而且也凭借其独特的生物学特性成为重要的模式生物系统。本文总结了家蚕的特点及其作为模式生物的优势,综述了在抗菌、病理、毒理、环境监测、病虫害防治等领域中以家蚕为模式生物已取得的研究进展,其应用前景广阔,是发展具有中国特色的模式生物重要方向之一。

一种家蚕微孢子虫感染成品卵检测方法的研究

感染家蚕微孢子虫的成品卵检测是业内关注的技术问题之一。用磨碎管分装1000粒蚕卵并加海绵塞,进行一段式催青的实验室二日孵化率达98.25%或以上,对生产用不同蚕品种、越年或冷藏浸酸蚕种及不同单位生产蚕种的二日孵化率最低为94.40%。用含0.01%十二烷基磺酸钠和2.00%氢氧化钠的溶液浸泡和磨碎蚕卵样本(约1000粒),固形物去除率为83.38%。5龄起蚕添食感染5×10^(5)颗/mL家蚕微孢子虫孢子悬浮液后获取的混合蚕卵,在催青孵化后第7天检出率明显上升。1000粒蚕卵混入3000颗家蚕微孢子虫孢子的检出率为100%。蚕卵磨碎液用PBS缓冲液(pH=7.2~7.6)稀释40倍或以上时,qPCR法检测可稳定检出家蚕微孢子虫,检测灵敏度为4×10^(6)颗/mL,低于光学显微镜法的1.5×10^(3)颗/mL。105个一代杂交蚕种母蛾检疫批(166623张毛种)母蛾检测和蚕卵集团检测的检出情况类似。不论是母蛾检测还是成品卵检测都涉及家蚕微孢子虫的胚传率和流行病学风险管控的阈值确定,上述研究提供了一种成品卵集团检测的方法,但实际应用尚需更为丰富的流行病学调查数据。

鳞翅目昆虫肠道微生物的多样性及其与宿主的相互作用

作为地球上数量最多的动物群体,昆虫种类繁多、形态各异,其肠道内也栖息着大量的微生物,这些微生物直接或间接对宿主发挥着重要的作用,如参与消化、吸收利用营养物质、合成信息素,同时在抵御外来病原的侵入与定殖、提高宿主免疫活性的过程中也起着关键作用。鳞翅目是昆虫纲中仅次于鞘翅目的第二大目,其中既有严重危害农作物的害虫,又有能够授粉和产生经济效益的益虫,对生态系统和人类影响深远。近年来,随着新方法、新技术在肠道微生态学上的应用,国内外鳞翅目昆虫肠道微生物的研究也日趋热烈。本文将围绕家蚕Bombyx mori、海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis、小菜蛾Plutella xylostella等几种代表性鳞翅目昆虫,介绍目前为止针对鳞翅目昆虫肠道微生物组的研究,包括肠道的内环境、微生物的多样性及其研究方法,随后对已明确的鳞翅目昆虫肠道微生物的组成,以及共生菌具体对宿主代谢解毒、免疫健康等方面做出的贡献进行分析,以期为进一步深入探究鳞翅目昆虫肠道微生物打下基础,以及转化这些知识来控制害虫(海灰翅夜蛾、小菜蛾等),促进益虫(家蚕等)生长,确保农业和经济更好地发展。

家蚕胚胎期感染微粒子病的个体对健康群体的影响

胚胎期感染家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)的家蚕个体,其携带Nb在健康家蚕群体中的传播扩散规律是流行病学需要解决的问题,也是家蚕微粒子病检验技术的科学基础。采用流行病学的方法,通过混育和个体育试验,研究胚胎期感染Nb的家蚕个体对健康群体的影响。研究结果表明:胚胎期感染Nb的家蚕中,存在可以完成1个世代(即可以发育到化蛾产卵)的个体;胚胎期被感染的家蚕个体在健康家蚕群体中的感染扩散规律为"连续感染传播扩散"模式;病害在家蚕健康群体的传播扩散与胚胎期感染个体数量和感染程度有关,在幼虫期低剂量感染情况下,感病个体混入率≥5%对群体的化蛾率有明显影响,感病个体混入率≤2%对群体的化蛾率未见明显影响。上述结果可供感染Nb的家蚕子代对健康群体影响的风险阈值确定,以及家蚕微粒子病检验判别标准的评价和检验技术研究参考。

家蚕微粒子病防控技术研究的发展现状与趋势

家蚕微粒子病是养蚕业的毁灭性病害之一。对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)进入饲养家蚕群体的路径、在家蚕个体内繁殖扩散和在饲养家蚕群体中的扩散规律3个方面的研究进展,以及与此相关的家蚕微粒子病防控技术的发展进行了概述。提出在防止家蚕微孢子虫进入饲养家蚕群体方面,必须根据生产实际并掌握病害流行规律构建因地制宜的防控技术体系;在家蚕个体抗病能力提升方面,家蚕微孢子虫与家蚕的互作机制解明,新型育种技术和微生态技术的应用等非常值得期待;在控制微粒子病在家蚕群体中扩散方面,解明感染个体在蚕座内传播的基本规律,构建新型检疫体系与研发检测技术是迫切需要解决的关键问题。

家蚕微粒子病检验技术综述

家蚕微粒子病检验技术是防控该传染性病害流行的关键技术,该技术的建立和实施在我国家蚕微粒子病流行控制中发挥了重要的作用,如何改进与发展该技术对养蚕业的可持续发展具有重要意义。本文在综述家蚕微粒子病检验技术发展过程及存在主要问题的基础上提出:厘清技术管理体系,明确蚕种质量检验和监管主体与责任,构建良性竞争体系是基础;构建技术性和经济性符合生产实际的检测技术及配套抽样技术是关键;解明家蚕微粒子病蚕座内流行规律,以及科学设置风险评估参数是核心。

家蚕一代杂交种母蛾检测批规模类型对微粒子病流行的影响

家蚕一代杂交种的母蛾检测是控制微粒子病流行的基础性工作。根据2010—2014年某蚕区7个家蚕一代杂交种生产单位对母蛾中家蚕微孢子虫的检测数据,采用统计学方法对不同母蛾检测批规模类型的批次数量、毛种数量和微孢子虫检出结果的变化及其与各检测批规模类型间的相关性进行分析,得出如下结论:数据采集期间该蚕区毛种数量较多的母蛾检测批规模类型的批次数量和毛种数量呈上升趋势,2012年的检测批次数量已较2010年显著增加(P=0.049);未检出家蚕微孢子虫的合格蚕种(即无毒蚕种)比率,随检测批规模类型的毛种数量增加呈下降趋势;检出合格蚕种(即带毒合格蚕种)比率,随检测批规模类型的毛种数量增加呈上升趋势;检出不合格蚕种(即带毒淘汰蚕种)比率,未出现明显倾向性变化趋势;不同生产单位的母蛾检测批规模类型结构与家蚕微粒子病流行程度间可见明显差异。蚕种生产单位可通过母蛾检测批规模类型结构与检测结果间的相关性分析,反馈调控母蛾检测批规模类型,提高对家蚕微粒子病的防控效率。

不同母蛾微粒子病检验结果类型杂交蚕种的农村饲养试验

杂交蚕种的母蛾微粒子病检验结果的5种类型(未检出、一检合格、二检合格、一检淘汰和二检淘汰),体现了各检验批段蚕种的不同微粒子病携带程度,不同微粒子病携带程度的杂交蚕种在农村饲养中的表现,可以在一定程度上反映微粒子病携带程度对丝茧育的影响。为此,我们在2014年春蚕期、2014年中秋蚕期和2015年春蚕期,分别对未检出、一检合格、二检合格和淘汰(为一检不合格且母蛾检验显微镜观察时视野中微孢子虫较多的蚕种)4种不同母蛾微粒子病检验结果类型的杂交蚕种进行了农村和实验室饲养试验,同时对农村和实验室饲养的家蚕进行了微粒子病的抽样检测。结果显示:盒种产茧量和茧层率等指标未呈现未检出>一检合格>二检合格>淘汰的趋势,即未发现不同检验结果类型对农村饲养蚕茧产质量的影响存在显著差异;饲养过程微粒子病抽样检测虽呈现淘汰>二检合格>一检合格>未检出的趋势,但总体上这种趋势不明显。

基于抗性指数的家蚕对核型多角体病抗性评价研究

为更加有效地评价蚕品种对家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)病的抗性,采用Reed-Muench法对69个(次)蚕品种的BmNPV多角体的半数致死浓度(LC 50)进行了测定。结果证实,同一蚕品种在相同实验室的不同测定期别或同期试验,以及不同实验室的数据间存在差异。为减少这种蚕品种抗性评价中的困惑,通过不同数量参照蚕品种LC 50值校正待测蚕品种LC 50值的比较,提出以2对常用蚕品种正反交为参照的抗性指数评价方法,提高不同来源LC 50测定数据间的可比性,以期为新品种的育成和新品种的推广提供参考。

浙江省桑园土壤病原菌及其微生态调查

桑椹菌核病是果桑生产中的重要病害。为了解桑园土壤中病原菌的存在情况及其微生态,分别从浙江4个地域[德清县(DQ)、长兴县(CX)以及金华市多湖街道(JD)和江东镇(JJ),其中长兴桑园采用大棚栽培,其他为露地栽培]及四川1个地域[对照(CK),极少或未发生桑椹菌核病]的桑园采集土壤样本,并对样本中的真菌和细菌进行内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)和16S rRNA基因高通量测序。结果表明:德清(DQ)、江东(JJ)及多湖(JD)3个桑园土壤的菌核病病原杯盘菌属(Ciboria)的相对丰度分别为28.84%、60.17%、70.15%,未见桑椹菌核病病果的长兴(CX)和四川(CK)桑园土壤分别为0.02%和0.06‱。长兴(CX)桑园土壤的主要真菌类群为被孢霉属(Mortierella)、毛壳菌属(Chaetomium)和腐质霉属(Humicola),其相对丰度分别为36.46%、21.59%、15.93%;四川(CK)桑园土壤的主要真菌类群为青霉属(Penicillium)、镰刀菌属(Fusarium)和Fusicolla,其相对丰度分别为24.05%、15.35%、9.75%。各桑园土壤的细菌多样性丰富,其中假单胞菌属(Pseudomonas)是唯一在5个地域桑园土壤样本中均有可鉴定序列的细菌,但相对丰度最高的江东(JJ)桑园土壤也仅有6.81%。综上所述,杯盘菌属的相对丰度、真菌和细菌的多样性既揭示了桑园土壤菌核病病原与土壤微生态之间的复杂关系,也暗示了通过改变土壤微生态结构来防控桑椹菌核病的可能性。

家蚕人工饲料来源毕赤酵母菌的分离及对饲料酸碱度的影响

为探明真菌繁殖对家蚕人工饲料酸碱度的影响,采用常规分离纯化技术,从人工饲料育养蚕环境的蚕座上获得1株可碱化饲料的真菌,经形态学和ITS序列鉴定,为库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudravzevii)。该菌株接种至家蚕人工饲料,使饲料pH在5 d内由初始值上升至7.54;接种至不同pH和葡萄糖含量的液体YPD中,其能适应繁殖基质pH的变化,碱化培养基质,使酸性培养基pH在6 h内升高,在24 h内上升到7.86(pH 5.00)和8.26(pH 6.00);培养基质中葡萄糖含量影响碱化,低浓度葡萄糖(<0.6%)培养基碱化现象明显,高浓度葡萄糖(>1.2%)培养基碱化现象消失。菌株接种至pH为3.00、5.00和7.00的不含葡萄糖YPD培养基中培养不同时间,对环境中氨气释放量、碱化相关基因表达及谷氨酸脱氢酶活性进行研究,结果表明,与添加2%葡萄糖相比,固体培养基中氨气释放量在培养24 h(pH 5.00)和4 h(pH 7.00)时极显著上升(P<0.01),随后持续升至最高值280 mg/m^(3)(pH 7.00);谷氨酸脱氢酶活性逐渐升高,在12 h(pH 5.00)和24 h(pH 7.00)时达到最大值53.84 U/mL和24.84 U/mL,极显著高于对照组(P<0.01);液体培养基中碱化相关基因GDH2、DUR1,2和ATO3表达水平呈先升高后降低趋势,GDH2转录水平分别在8 h(pH 3.00)、4 h(pH 5.00)和8 h(pH 7.00)上调最高,极显著高于对照组(P<0.01),随后下降,ATO3转录水平分别在4 h(pH 3.00)、12 h(pH 5.00)和8 h(pH 7.00)显著上调,且最高(P<0.05),然后下降,DUR1,2转录水平均在8 h极显著高于对照组(P<0.01)。添加抗霉素A,碱化程度下降甚至消失。该研究可为解明家蚕人工饲料的保鲜机制及研发保鲜技术提供参考。

散卵一代杂交蚕种的均匀性调查

为了解散卵一代杂交蚕种的均匀性,对桐乡蚕业有限公司生产的10批华康2号和4批秋丰×白玉散卵不同后期处理(常规与混匀处理)或不同取样类型(成品前和笼内)的克卵粒数进行了调查。结果表明:华康2号的克卵粒数极显著多于秋丰×白玉(P=0.001);克卵粒数极差值的显著性比较中,在样点间华康2号生产批极显著大于秋丰×白玉(P=0.000),在生产批间未见显著差异(P=0.623);华康2号和秋丰×白玉笼样卵、常规卵和混匀卵不同批合计抽样点克卵粒数极差值的比较均未见显著差异,但有3个批笼样卵的批内出现显著差异(P=0.000、0.048和0.013);对2个生产批蚕种样点内克卵粒数观察值增加后的极差值比较发现,测定数增加到15个和20个时,1个批出现显著差异(P=0.033和0.025)。由此得出初步结论:批内的常规卵和混匀卵具有较好的均匀性,笼样卵的均匀性较差。

鳞翅目昆虫病原微孢子虫研究进展

微孢子虫广泛存在于鳞翅目昆虫中,是一类重要的病原微生物。微孢子虫病一方面影响野外昆虫种群的自然平衡,另一方面对家蚕、柞蚕等经济和资源昆虫造成了严重的危害。微孢子虫分子生物学研究基础相对薄弱,再加上微孢子虫表面坚厚的孢壁,无疑增加了研究难度。随着核酸、蛋白质等生物大分子分离制备方法和高通量测序技术的不断更新发展,基于各种组学(Omics)研究微孢子虫的工作方兴未艾,并且有了一些重要的发现。本文综述了微孢子虫与鳞翅目昆虫寄主的相互作用及寄生于鳞翅目昆虫的病原微孢子虫基因组、转录组和蛋白质组进展情况,以期为微孢子虫的深入研究提供参考。这些昆虫微生物研究将为鳞翅目害虫生物防治提供新的思路,并对家蚕等经济昆虫微粒子病的诊断、防控及治疗产生积极影响。