滑液囊支原体与鸡传染性支气管炎病毒共感染对SPF鸡的致病性研究

为比较滑液囊支原体(MS)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)共感染对SPF鸡的致病性,本研究将144只28日龄SPF鸡随机均分为阴性对照组、MS感染组、IBV-M41感染组、IBV-M41+MS共感染组、IBV-QX感染组、IBV-QX+MS共感染组共6组,采用50μL/只剂量按相应分组点眼感染MS (106CCU50)、IBV(105EID50),阴性对照组以50μL/只点眼KM2培养基(左眼)和PBS (右眼)。感染后每天观察临床症状,在感染后7 d、14 d、21 d和28 d每组随机剖检6只鸡,观察气囊炎和气囊损伤评分,并采集气管进行病原再分离,其中MS经支原体液体培养基培养后进行PCR鉴定,IBV接种SPF鸡胚后进行RT-PCR鉴定。此外,各组鸡气管均经10%甲醛固定后进行粘膜厚度检测以及病理损伤评分。结果显示:除阴性对照组和MS感染组,其他组鸡在感染后4 d均出现一过性呼吸道症状。剖检结果显示MS感染组鸡在感染后21 d出现气囊炎,28 d仍可见气囊炎;而IBV-M41感染组和IBV-QX感染组鸡在感染后7 d或14 d出现气囊炎,且气囊炎的发生率均未超过50%。感染后14 d IBV-QX+MS共感染组鸡气囊炎发生率达100%(6/6),直至21 d并且大部分鸡气囊炎可持续至感染后28 d (5/6),而IBV-M41+MS共感染组鸡气囊炎仅可持续至感染后21 d,且气囊炎的发生率最高在感染后14 d (5/6)。IBV-QX+MS共感染组鸡平均气囊损伤评分在感染后14 d、21d和28 d均极显著高于单一感染组(P<0.001),而IBV-M41+MS共感染组鸡仅在感染后14 d极显著高于单一感染组(P<0.001)。病原再分离结果显示,各感染组鸡均在气管中再分离到MS(感染后28 d内)或IBV(感染后7 d内)。病理损伤检测结果显示,共感染组鸡较各单一感染组鸡气管粘膜增厚持续时间更长以及病理损伤更为严重。IBV-M41+MS共感染组鸡在感染后14 d平均气管粘膜厚度显著低于IBV-QX+MS共感染组(P<0.05),而在感染后21 d极显著低于IBV-QX+MS共感染组(P<0.001),其余各组鸡在感染后14 d和21 d均极显著低于IBV-QX+MS共感染组鸡(P<0.001)。IBV M41+MS共感染组鸡最早14 d出现气管病变,而IBV QX+MS共感染组鸡在共感染后7 d就可见气管病理损伤,且共感染组鸡的平均气管损伤评分均极显著高于单一MS或IBV感染组(P<0.01或P<0.001)。上述结果证实MS和IBV共感染较单一感染对28日龄SPF鸡的致病性更强,IBV M41或QX株与MS共感染对SPF鸡的致病性存在差异,本研究为临床IB和MS的防控提供科学参考依据。

基于黏膜sIgA抗体的非洲猪瘟病毒感染早期血清学检测方法的建立

目前的非洲猪瘟病毒(ASFV)血清学检测方法存在因采血引起交叉感染风险、抗体转阳滞后影响检测敏感性等问题,因此建立一种无创采样且可实现早期诊断的血清学方法对于在临床上ASFV感染的诊断与监测有重要意义。本研究以人工合成的方式构建了pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(SUMO-P30),用Ni柱亲和纯化后作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立一种以猪口腔液中黏膜sIgA抗体为靶标的ASFV抗体间接ELISA方法。结果显示,真核重组表达的P30蛋白(SUMO-P30)约为47 ku,Western blot鉴定显示其具有良好的反应原性;经优化确定了ELISA最佳反应条件:包被量为1.0μg·mL^(-1),5%脱脂乳为最佳样品稀释液,与待检口腔液的最佳混合比例为2∶8,样品反应时间为120 min,鼠抗猪IgA-HRP最佳稀释度为1∶5000,反应时间为60 min,最佳显色时间为15 min。该方法检测ASFV感染口腔液抗体效价可达1∶32,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒黏膜抗体阳性口腔液均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。利用该方法和ASFV商品化ELISA血清抗体检测试剂盒,分别检测感染ASFV强毒株或人工致弱株后同一头猪不同时间点的口腔液和血清样品,口腔液中黏膜sIgA抗体在感染后3~5 d S/P值就显著提升,而血清抗体在监测期内未检测到转阳。检测人工感染或同圈感染自然变异株后不同时间点的口腔液和血清样品,本研究建立的方法与商品化非洲猪瘟病毒血清抗体检测试剂盒检测的阳性符合率为100%,阴性符合率为37.5%,总符合率为61.5%。综上,本研究建立了一种无需采血,以口腔液为样品的ASFV黏膜sIgA抗体ELSIA检测方法,可实现ASFV感染的无创、早期、敏感诊断,为ASFV的监测和防控提供新的技术支持和补充。

猪肺炎支原体LAP的结构预测及其抑制剂Bestatin对支原体生长的影响

本研究旨在以猪肺炎支原体为代表,研究支原体LAP酶活中心的高级结构及其被抑制后对支原生长的影响。亮氨酸氨肽酶(LAP)是一类广泛存在于各类生物的氨基酸代谢酶,有研究表明病原微生物的LAP酶活中心被抑制后可以直接影响微生物的代谢和生长。本研究拟以猪肺炎支原体(Mhp)LAP为模型,研究其理化特性和高级结构,探索LAP抑制剂乌苯美司(Bestatin)对支原体生长的影响。本研究首先用Clustal Omega进行序列同源性比较,分析LAP活性位点在不同支原体中的保守情况。然后采用GST融合标签表达猪肺炎支原体LAP蛋白,通过GST亲和层析和分子筛层析纯化蛋白,圆二色谱测定LAP的二级结构,用Alpha fold 2预测三级结构。最后用Bestatin与猪、鸡、羊等不同种属的支原体共培养来观察其影响。结果表明虽然总体序列同源性不高,但是LAP酶活中心的关键位点在常见支原体相对保守。猪肺炎支原体LAP可以通过GST标签进行可溶性表达。酶切GST标签后,分子筛层析显示LAP是六聚体,圆二色谱表明LAP具有正确的二级结构。预测的LAP三级结构显示其具有保守的底物结合关键位点。Bestatin对不同种属支原体的生长均产生抑制,且呈现剂量依赖性,但在不同菌株间存在差异,最低在6μg/mL的浓度可通过抑制氨肽酶的活性抑制猪肺炎支原体的生长。该研究为新一代抗菌药物的研发提供了新的思路。

我国实验用猪的健康管理与应用前景

猪在生理生化指标、解剖结构、系统功能、营养代谢以及疾病发生和发展等方面与人类机体相对应的系统和功能相类似。目前人医和动物医学领域各项研究中,越来越多研究者首选使用猪进行科学试验。本文将着重讨论我国当下实验用猪猪群的健康管理,包括实验用猪猪群生物安全体系建立、生产管理、疫病监测机制、药物保健等,以提升实验用猪在饲养繁育和管理过程中的微生物等级与健康管理水平,减少其在实验过程中对科学实验造成的干扰。

猪肺炎支原体乳酸脱氢酶在诱导猪支气管上皮细胞凋亡中的作用

猪肺炎支原体感染会引起宿主上皮细胞的损伤及凋亡。上皮屏障的破坏往往导致细菌和病毒的继发感染,给养猪业造成严重的经济损失,但具体的致病机制及毒力因子尚未完全阐明。前期研究发现猪肺炎支原体乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)不仅参与猪肺炎支原体的代谢还与猪肺炎支原体的毒力相关。因此,本研究通过原核表达及亲和层析获得猪肺炎支原体乳酸脱氢酶重组蛋白(recombinant LDH, rLDH),之后分别用不同浓度的rLDH与猪支气管上皮细胞(porcine bronchial epithelial cell, PBEC)孵育,经显微镜观察rLDH对细胞形态的影响,通过CCK-8法检测rLDH对细胞活力的影响。选取对细胞形态及活力影响不显著的50和100μg·mL^(-1) rLDH分别与PBEC孵育,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,反转录荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法和免疫印记检测凋亡相关基因caspase 3、caspase 8、caspase 9、Bax、BCL-2的转录水平和蛋白水平。结果显示:猪肺炎支原体rLDH呈剂量依赖性地诱导PBEC凋亡,其作用与猪肺炎支原体菌株一致。用rLDH及Mhp 168孵育后,PBEC的促凋亡因子Bax、caspase 3和caspase 9的mRNA水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的mRNA水平显著下调,caspase 8的mRNA水平未发生显著变化。促凋亡因子Bax、caspase 3的蛋白表达水平显著上调,凋亡抑制因子BCL-2的蛋白表达水平显著下调。结果表明,猪肺炎支原体可能通过LDH诱导PBEC内源性细胞凋亡,凋亡相关因子caspase 3、caspase 9、Bax和BCL-2在其中发挥重要作用。

猪腹膜间皮细胞的分离培养及初步应用

本研究旨在建立猪原代腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cell, PMC)的分离和体外培养方法,并将其初步应用于猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)体外感染细胞模型。采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化猪大网膜组织分离猪PMC细胞,通过形态学、免疫学方法鉴定细胞。使用Mhr感染PMC细胞,观察细胞形态变化,并利用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)法检测细胞活性损伤情况。结果显示,倒置相差显微镜观察显示,分离培养的细胞早期呈拉网状,5~8 d后生长可达融合状态,细胞大小均一,呈多边形铺路石状;间接免疫荧光试验结果显示,细胞波形蛋白、角蛋白-18抗原呈阳性,第Ⅷ因子相关抗原、白细胞CD45抗原呈阴性;扫描电镜下可见细胞表面微绒毛。结果证实分离培养的细胞为猪PMC细胞,纯度达95%以上。Mhr感染后,光镜下可观察到细胞发生明显皱缩,感染组细胞的LDH释放量较对照组细胞显著升高。本研究成功建立了猪原代PMC细胞的分离培养方法,并初步用于Mhr体外感染,为研究Mhr等引起浆膜炎的病原与宿主的互作机制提供了体外细胞模型。

弓形虫ITS-1序列PCR诊断方法的建立

目的本文旨在为弓形虫感染的临床病例检测建立特异性PCR诊断方法。方法本研究以弓形虫ITS-1序列为种特异性遗传标记,采用有限稀释法稀释速殖子DNA,经PCR扩增,检测该方法的敏感性;用同一引物扩增鸡柔嫩艾美耳球虫原虫和弓形虫,检测PCR方法的特异性。人工感染小鼠和家兔,用组织触片法和PCR方法检测感染动物的组织,并检测10头临床疑似病猪的肺脏、肺门淋巴结、脾脏、肾脏和肝脏等组织,比较两者的敏感性。结果该PCR方法最低可以检测1pg弓形虫速殖子DNA(相当于10个速殖子的DNA);鸡柔嫩艾美耳球虫原虫未扩增出特异条带,仅弓形虫出现特异条带(300bp)。组织触片和PCR方法对人工感染小鼠组织DNA的检出率均为87.5%(7/8),对人工感染家兔的检出率分别为50%(3/6)和66.7%(4/6),对临床疑似弓形虫病猪检测的阳性率均为20%,两种方法的检查结果基本一致。结论本试验结果表明,PCR技术可以作为弓形虫感染动物的诊断与检测方法。

猪肺炎支原体168弱毒株P46基因的克隆和鉴定

猪肺炎支原体的表面抗原基因 Ｐ４６基因可引起宿主早期特异性免疫反应，其分子量约４６ ｋ Ｄａ。根据 Ｇｅｎ Ｂａｎｋ 公布的 Ｐ４６基因序列设计１对能扩增 １ ３７７ ｂｐ Ｐ４６结构基因的引物（５： Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ｇ Ｔ Ｇ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ，３： Ａ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ｇ Ｃ）作 Ｐ Ｃ Ｒ，成功地从猪肺炎支原体１６８弱毒株染色体 Ｄ Ｎ Ａ 中扩增出目的基因。 Ｐ Ｃ Ｒ 产物克隆于 ｐ Ｕ Ｃ１９质粒中，部分测序表明克隆基因与 Ｊ株基因同源性达９６％ 。其变异主要表现为 Ａ 碱基缺失或变为 Ｃ碱基；人工致弱株外显子基因中 Ａ、 Ｔ 碱基较 Ｇ、 Ｃ可能有更高的易变性。

鸡毒支原体人工发病封闭模型的建立

在透明塑料隔离器中，分别制造３０～１００ｍｇ／Ｌ的氨环境，观察其对ＳＰＦ“来杭鸡”的应激反应，结果氨浓度在８５ｍｇ／Ｌ以上时，鸡群发生严重伤害，而氨浓度在５０ｍｇ／Ｌ以下时则缺乏明显应激。氨环境作应激因素，对３０日龄无特定病原ＳＰＦ鸡以鸡毒支原体强毒株作人工发病，１２天后检查气囊病变，发病率为７５％（３／４）；以鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）、鸡传支病毒（ＩＢＶ）弱毒诱导，人工感染发病率为５０％（２／４）；经ＮＤＶ、ＩＢＶ弱毒诱导和７０ｍｇ／Ｌ的氨应激的联合作用，ＭＧ人工感染的致病率达１００％（７／７）。由此在隔离器内初步建立了鸡毒支原体人工发病的封闭模型。

南方夏季猪高热性疾病调查与回顾

2002年入夏以来，华东、华南每年夏初高温季节在大多养猪地区都会发生所谓的猪无名高热病，有明显的传染性，农村个体散养户和规模化猪场都有发生。2006年已造成猪百万头以上的损失，常规的抗菌和抗虫治疗几乎无效。对其致病原因，一直以来有各种诊断结果，但尚未能确定其病原。虽然疫情随着高温降低，已呈下降之势，但对周边地区仍构成侵袭。

猪气喘病实验猪模型的建立

目的研究建立猪气喘病人工发病模型。方法将分离得到的一株猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)Js株进行各种试验鉴定,证实其为Mhp强毒株。每头猪肺内接种Js株培养物2ml,15～25d后观察临床症状和病理变化,采集病变组织,经冻干制成攻毒用组织毒。安检合格,批号为20000324。给15头小梅山二元杂交猪分别气管内注射以KM_2培养基作10^(-2)、10^(-3)、10^(-4)和10^(-5)稀释的强毒,每头猪5ml,对照组注射培养基。攻毒后25d观察试验猪临诊症状,X线透视,记录病理变化。结果10^(-2)、10^(-3)、10^(-4)稀释的强毒试验组猪均出现了典型的猪气喘病临床症状和病理变化。结论人工发病试验测得Mhp Js株组织强毒接种气管内注射最小发病剂量为10^(-4)稀释5ml,正式试验人工发病可用100个最小发病剂量即强毒冻干物1:100稀释气管内注射5ml,可确保攻毒成功。

鸡败血霉形体SC克隆致弱株免疫原性试验

在透明塑料隔离器中进行了鸡败血霉形体人工发病试验，结果３０日龄ＳＰＦ来航鸡在ＮＤＶ、ＩＢＶ弱毒诱导和７０／１００００００（质量分数）氨环境刺激的联合作用下，致病率可达１００％（７／７）。经鸡败血霉形体Ｓ６克隆致弱株ＳＣＦ１５６代培养物点眼、滴鼻免疫后１０，２０，３０ｄ的ＳＰＦ来航鸡再以ＭＧ强毒攻毒，结果，保护率分别达８０．０％（４／５），７５．０％（３／４）和８７．５％（７／８）。近期免疫效果证明，鸡败血霉形体Ｓ６克隆致弱株ＳＣ有良好的免疫原性。

猪肺炎支原体的分子生物学研究进展

１分类地位、系统发育与物理图谱猪肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐ－ｎｅｕｍｏｎｉａｅＭｈｐ）是引起猪支原体肺炎（ＭｙｃｏｐｌａｓｍａＰｎｅｕｍｏｎｉａｅｏｆＳｗｉｎｅＭＰＳ亦称猪地方流行性肺炎、猪气喘病）的主要病原，对养猪业造成重大的经济损失...

高温季节猪高热病的重要防控原则

猪高热病是近年来严重影响我国养猪业健康发展的重要疾病,本文通过对我国猪高热病发生的历史回顾,探索发病原因,提出猪瘟控制的核心是免疫,蓝耳病的控制要用疫苗免疫,细菌病、气喘病与圆环病毒感染在高热病控制中不可忽视,而高热病防制的根本策略是加强猪场管理与执行。这些重要的防控原则,可为该病的防控提供参考和帮助。

鸡毒霉形体S_6株的致弱研究

鸡毒霉形体（ＭＧ）中毒株Ｓ６在固体平板上３次克隆后，在无细胞培养基上传１００代以上进行致弱培养。用ＭＧＳ６Ｆ１０８株培养物在雏鸡和ＳＰＦ鸡胚上作６次回归感染，证明ＭＧＳ６Ｆ１０８株不返强。通过气管环培养、纤毛运动损伤试验及对鸡点眼、滴鼻、左胸气囊注射不同代次培养物（Ｆ１０８、Ｆ１１３、Ｆ１２１、Ｆ１５０、Ｆ１５３），检查气囊病变和病原体再分离，结果证明Ｆ１０８以上代次的菌株低毒、安全。

猪肺炎支原体168菌株蛋白SDS-PAGE谱带和染色体DNAPFGE图谱比较

猪肺炎支原体(MycoplasmahyopneumoniaeMph)是猪气喘病的主要病原,现遍布于世界各养猪国家。国内外科技工作者对该病的防治作了大量的研究报道[1]。尽管如此,有关Mhp的致病性及毒力因子仍知之不详[2]。中国在Mhp的弱毒研究方面取得了突破性进展[3,4],经多年应用表明该弱毒...

鸡毒支原体SC克隆致弱株免疫原性测试——开放动物模型的建立与应用

对罗斯鸡和 Ｓ Ｐ Ｆ来航鸡用鸡毒支原体强毒攻击时，以鸡致病性大肠杆菌 Ｏ７ ８ 血清型菌株 １６ 小时培养物 ０２ｍ ｌ／羽皮下注射作人工诱导发病，试验鸡出现明显气囊病变，初步建立了以鸡致病性大肠杆菌为诱导因子的 Ｍ Ｇ 野外环境人工发病的动物模型。以此开放模型检测 Ｓ Ｐ Ｆ来航鸡以鸡毒支原体 Ｓ６ 克隆致弱株 Ｆ１５６ 代培养物点眼、滴鼻免疫后 ３０ 日、６０ 日龄的攻毒保护率，结果保护率分别达 ９０％ （１８／２０）、８４％ （４２／５０），而对照组为 ３０％ （６／２０）、５０％ （１５／３０），中期免疫效果证明，鸡毒支原体 Ｓ６ 克隆致弱株有良好的免疫保护作用。

家禽支原体的防控现状及研究新进展

支原体在我国被列为二类传染病,是进出口畜产品中必检的疫病之一。禽支原体在世界范围内流行,给我国的家禽养殖业造成了极大的危害。本文就我国家禽支原体感染的现状和防控中存在的问题、研究现状以及防控措施等方面进行概述。

死亡鹅胚中霉形体的分离与初步鉴定

死亡鹅胚中霉形体的分离与初步鉴定邵国青，毛洪先，金洪效，钱建飞，樊素琴，夏庆凤（江苏省农业科学院畜牧兽医研究所南京２１００１４）１９８３年，Ｓｔｉｐｋｏｖｉｔｓ首次报道从患阴茎炎的病鹅中分离出霉形体，并用以复制出相同疾病，再次分离出病原。用１５种已知...