白喉毒素突变体CRM197在白喉杆菌中的表达纯化

CRM197是一种白喉毒素突变体,第52位的甘氨酸突变为谷氨酸,作为载体蛋白广泛用于疫苗开发。将阐述一种新的生产CRM197方法。将合成的CRM197基因片段克隆到表达载体pCKM4.1中,表达质粒pCKM5.1电转化至大肠杆菌E.coli S17-1中,通过结合转移转化至白喉杆菌(ATCC?27010TM的白喉杆菌)中,载体上的导肽序列可以使得CRM197作为可溶性蛋白分泌到胞外表达,CRM197蛋白可占到菌体总蛋白的70%。增强对铁的调控,进一步优化培养基及发酵条件以提高产量。经过Q膜、硫酸铵沉淀、阴离子交换纯化步骤获得纯度达到95%的CRM197样品,提高了蛋白得率,节约了纯化时间和成本。

链球菌属的一个新种

自君子兰(Clivia miniata)软腐病病株的叶片病灶中分离到两株致病菌。经鉴定其中一株(85-2)多为双球状,也有呈单个存在,极少为四个细胞相连的短链。无芽孢,无鞭毛、不运动,革兰氏染色阳性,抗酸染色阴性,兼性厌氧生长;可从多种糖类产酸,但不产气;接触酶和苯丙氨酸脱氨酶均为阴性;不液化明胶,还原石蕊牛奶并凝固、胨化;生长温度范围为15—53℃,DNA中G+C含量为41.7mol%。由于其性状与链球菌属的各已知种均不相同,故定为一个新种,命名为君子兰链球菌(Streptococcus miniatus Zhou,Ping et Shao sp.nov.)。

铝佐剂类型及吸附率对吸附无细胞百白破联合疫苗免疫原性的影响

目的研究铝佐剂类型及吸附能力对吸附无细胞百白破联合疫苗免疫原性的影响,筛选最佳佐剂。方法用磷酸铝(AP)、不同浓度磷酸盐处理的氢氧化铝(PTAH)以及氢氧化铝(AH)佐剂吸附百白破抗原,检测不同佐剂对各抗原的吸附率。制备不同佐剂类型和吸附率的制剂,腹腔免疫NIH小鼠,ELISA法测定免疫后各组小鼠血清抗体滴度。结果百日咳丝状血凝素(FHA)在所有佐剂中吸附率≥95%,百日咳类毒素(PT)、百日咳溶血素(PRN)、精制白喉类毒素(DT)和破伤风类毒素(TT)则随着铝佐剂中磷酸根增多吸附率降低。动物实验产生PT抗体水平大小关系:AP/AH>PTAH/无佐剂组;产生FHA抗体水平大小关系:AP/PTAH-3/AH>PTAH-2/PTAH-3>无佐剂组;产生PRN抗体水平大小关系:PTAH/AP/AH>无佐剂组;产生DT抗体水平大小关系:AP>PTAH>AH>无佐剂组;产生TT抗体水平大小关系:PTAH>AH/AP/无佐剂组。结论铝佐剂吸附力不影响抗原(DT除外)免疫原性,磷酸铝更适合作吸附无细胞百白破联合疫苗的佐剂。

南京地区儿童患者肺炎链球菌的血清型分布

目的了解南京地区儿童患者的肺炎链球菌血清型的分布,为疫苗研发的血清型选择提供支持。方法采用多重聚合酶链式反应(PCR)方法,对从南京地区儿童中分离的323株肺炎链球菌株进行测定,以确定其血清型。结果南京儿童医院分离的肺炎链球菌共323株,分型检定结果表明,最常见的血清型为19 F,所占的百分比为31.3%,其次为19 A(13.3%),14型(12.7%)和6 A/B(10.8%)。结论南京地区儿童患者所携带的血清型以19 F、19 A、14和6 A/B型最为常见,现有7价疫苗的覆盖率较低约为62%,而13价肺炎结合疫苗(PCV13)的血清型覆盖率较高约为85%。

南京地区儿童肺炎链球菌临床分离株的PspA 蛋白分型

目的：调查由来自PspA家族1和PspA家族2的3个PspA蛋白组成的重组蛋白疫苗在流行的肺炎链球菌中的覆盖率。方法采用ELISA方法，分别用这3个蛋白的抗血清与159株南京地区儿童中的肺炎链球菌分离株（包括47株侵袭性菌株）进行反应，对PspA 蛋白分布情况进行研究。结果分属于9个血清型的47株侵袭性菌株中，10．7％的菌株为PspA家族1菌株，89．3％的菌株为PspA家族2菌株，而没有PspA家族3的菌株。在所有159个菌株中，属于PspA家族1的菌株为10．1％，属于PspA家族2的菌株为88．0％，另有1．9％的菌株不能用本研究中所采用的方法进行PspA蛋白分型，但仍然没有发现属于PspA家族3的菌株。结论这3个PspA蛋白组成的疫苗可以覆盖本研究中（南京地区）几乎所有的临床侵袭性和非侵袭性分离株。

基于Luminex技术的多组分百日咳疫苗血清抗体效价快速检测方法的建立

目的建立基于Luminex技术的多组分百日咳疫苗血清抗体效价快速检测方法。方法将百日咳类毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)、百日咳杆菌黏附素(pertactin,PRN)、百日咳菌鞭毛蛋白2,3型(fimbrial-2 and fimbrial-3,FIM 2,3)分别与4种不同型号的微球耦联,耦联的抗原在同一孔中与血清孵育,通过生物素标记抗体和链霉素标记藻红蛋白双重识别,用Luminex荧光检测得到荧光中位数值(MFI),进行效价分析,并通过百日咳标准血清建立五组分百日咳疫苗血清抗体检测的标准曲线。采用ELISA法检测同一组血清样品中的抗体效价,并对两种方法的检测结果进行比较。结果与ELISA法相比,Luminex法的线性范围更宽。两种方法检测五组分百日咳疫苗血清抗体效价的分布范围接近,Luminex法检测50份五组分百日咳疫苗免疫小鼠血清抗体效价的平均值分别为PT 65.365 IU/ml、FIM 15.052 IU/ml、FHA 545.236 IU/ml、PRN 7.876 IU/ml,ELISA法检测的平均值分别为PT 72.640 IU/ml、FIM 16.480 IU/ml、FHA 589.474 IU/ml、PRN 7.345 IU/ml,两种检测方法的检测结果具有良好的相关性,相关系数(R2)分别为:PT 0.905 8、FIM 0.979 1、FHA 0.930 9、PRN 0.997 6。结论与ELISA法相比,基于Luminex的多重分析物的检测方法具有减少样品消耗量、节省成本和测定时间、使多种目标分子之间相关性的分析更准确等优点,可用于五组分百日咳疫苗血清抗体效价的检测。

脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素(CRM197)结合物中游离多糖含量检测方法的建立及验证

目的 建立一种脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素（CRM197）结合物中游离多糖含量的检测方法,并进行验证。方法 根据脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate,NaDC）在酸性条件下可沉淀蛋白的原理,分别对标准蛋白溶液和CRM197蛋白溶液进行酸沉淀处理,考察其蛋白沉淀效果;向脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素结合物中标加多糖衍生物,计算加标回收率,验证方法的准确性;分别采用NaDC沉淀法处理脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素（A、C、Y、W135群）结合物,检测其游离多糖含量,试验重复6次,验证方法的重复性;向标准蛋白溶液中标加不同浓度的NaDC溶液,验证NaDC对蛋白检测的干扰,考察方法的耐用性。结果 不同浓度的标准蛋白溶液经NaDC沉淀法处理后,蛋白浓度在100-300μg/ml范围内,沉淀中蛋白回收率在90%-110%之间,蛋白浓度大于300μg/ml的样品回收率显著降低;4种脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物标加多糖衍生物后,再经NaDC沉淀法处理后的游离多糖含量回收率均在80%-110%之间;4种脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物6次检测结果的相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）均〈15%;当溶液中NaDC的浓度不高于2%时,对蛋白检测无干扰。结论NaDC沉淀法准确性、重复性和耐用性良好,可用于脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素结合物中游离多糖含量的测定。

四价脑膜炎球菌多糖疫苗中结合物多糖抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的建立一种检测A、C、W135和Y群四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群多糖蛋白结合物的双抗体夹心定量ELISA检测方法,并进行验证。方法以白喉类毒素无毒变异体（CRM197）特异性单抗为包被抗体,HRP标记的脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖特异性单抗为捕获抗体,建立可定量检测脑膜炎球菌各血清群结合物多糖含量的双抗体夹心ELISA法,确定方法的最佳线性范围和检测限,并对方法的特异性、准确性和重复性进行验证。结果定量检测A群脑膜炎球菌结合物（GAMP-CRM197）多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为3.75~120 ng/ml,检测限为3.75 ng/ml;定量检测C群脑膜炎球菌结合物（GCMP-CRM197）多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~30 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml;定量检测W135群脑膜炎球菌结合物（GWMPCRM197）多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为7.5~240 ng/ml,检测限为7.5 ng/ml;定量检测Y群脑膜炎球菌结合物（GYMP-CRM197）多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~60 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml。A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法均能特异性地检测相应的结合物多糖抗原含量,而不与其他群的结合物多糖抗原发生交叉反应;A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法的回收率均在80%~120%之间,检测相应的结合抗原样品时,变异系数（CV）均小于15%。结论建立的双抗体夹心ELISA法特异性较强,准确性较高,重复性良好,可用于四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群结合物多糖抗原的定量检测。

腺病毒为载体的新型结核病疫苗Ad5Ag85A

结核病是一个在全球范围内严重威胁人类健康的呼吸道传染性疾病。据世界卫生组织（WHO）估计，世界上约有1／3的人口受到结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的感染，其中1／10的人可能会最终患上结核病。全球每年的新病例超过900万，约200万人死于结核病[1]。

用于ACYW 135群脑膜炎球菌多糖-CRM 197结合物分子量检测的SEC-RI-MALS联用方法的建立及验证

目的建立分子筛层析(size exclusion chromatography,SEC)-示差检测(refractive index,RI)-多角度激光光散射(multi-angle laser light scattering,MALS)联用方法检测ACYW135群脑膜炎球菌多糖-CRM197结合物的分子量,并对方法进行验证。方法首先单机测定ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗中各血清群多糖-CRM97结合物的dn/dc值(折射率增量),再采用SEC-RI-MALS联用技术,以0.9%Na Cl为流动相,TSKgel G5000PWxl为色谱柱,在流速0.4 ml/min的条件下,对结合物的分子量进行测定。对方法的重复性和日间精密性进行验证,并通过对样品进行高温或冻融处理,分析SEC-RI-MALS法在监测分子量变化上的应用。结果各血清群多糖-CRM197结合物的高、中、低浓度样品平行测定3次重均分子量的相对标准偏差(RSD)均小于10%,不同浓度下测定的分子量大小无显著差异,其分子量分布曲线重合性好;连续5日检测各血清群多糖-CRM197结合物分子量的RSD值均小于10%,其分子量分布曲线重合性好。经沸水浴处理,各血清群多糖-CRM197结合物的分子量分布情况均发生了明显的变化;冻融处理对A、C群多糖-CRM197结合物的分子量无太明显的影响,W135和Y群多糖-CRM197结合物在冻融过程中出现了一定的分子聚集现象。结论建立的SEC-RI-MALS联用测定多糖-CRM197结合物分子量的方法具有良好的重复性和日间精密性,能够用于ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗中结合物分子量的检测,并可对结合物在不同保存条件下的稳定性进行监测。