人B7-H4-Fc融合蛋白的表达及其应用研究

B7-H4分子是近年发现的一个新的协同刺激分子，它通过抑制T细胞的增殖、细胞因子的分泌以及细胞周期的进行，进而下调T细胞的免疫功能。为获取人B7．H4IgG融合蛋白，研究其对T细胞的调节效应，采用PCR法分别从pEGZ—Term／PD—L1-Fc和含人B7．H4基因序列的重组质粒中扩增出人IgGFc恒定区基因及人B7＋H4基因的胞外段序列，将两者插入逆转录病毒载体pEGZ—Term中，构建pEGZ．Term／B7．H4一Fc逆转录病毒重组载体，用脂质体法与两个辅助病毒载体共转染293T包装细胞，用含病毒颗粒的培养上清反复感染CHO细胞。用Zeocin筛选能稳定分泌人B7-H4-Fc融合蛋白的基因转染细胞并亚克隆之，经大量培养增殖，裂解细胞后收集裂解上清用ProteinG柱纯化，再经Westernblot鉴定。以体外T细胞活化体系观察其对T细胞活化的抑制作用。结果表明，成功地构建了表达人B7-H4-Fc融合蛋门的重组逆转录病毒载体；获得的CHO／B7-H4-Fc细胞能稳定分泌人B7-H4-Fc融合蛋门，该融合蛋白可以有效地抑制T细胞的活化。

胰岛素样生长因子-1可以抑制氧化应激诱导的成纤维细胞的炎症反应

目的 探究胰岛素样生长因子-1（IGF-1）对氧化应激诱导的人皮肤成纤维细胞（BJ细胞）炎症反应的调控作用.方法 通过使用H2O2处理BJ细胞模拟体内氧化应激环境,通过检测TNF-α及其受体TNF-R1、TNF-R2的表达变化,以及IGF-1、p-Akt/Akt的表达变化,研究氧化应激对BJ细胞炎症反应及IGF-1信号通路的影响;IGF-1预处理BJ细胞,通过检测TNF-α的表达及细胞凋亡水平,研究IGF-1对氧化应激诱导的BJ细胞炎症反应和细胞凋亡的影响.结果 BJ细胞经H2O2处理后,TNF-α及TNF-R1的表达均明显增加,TNF-R2变化不明显,IGF-1及p-Akt/Akt表达下降;IGF-1预处理可以明显抑制TNF-α的表达和细胞凋亡.结论 在成纤维细胞中,IGF-1具有抑制TNF-α表达和抗凋亡的作用.

血小板活化白血病细胞L1210中AKT及ERK信号通路并降低其对多种药物的敏感性

目的:探索血小板对白血病细胞胞内信号通路及药物敏感性的可能影响。方法:分离小鼠血小板,应用流式细胞术观察血小板与白血病细胞L1210共孵育后是否发生相互作用;使用Western blot印迹法检测血小板对白血病细胞L1210胞内信号通路的影响;在共培养体系中分别加入甲氨蝶呤、长春新碱、多柔比星,通过细胞增殖活性试验检测血小板对白血病细胞L1210药物敏感性的影响。结果:新鲜分离的以及固定后的血小板都能与白血病细胞相互结合,并都能上调白血病细胞内AKT以及ERK的磷酸化水平。此外,血小板还显著降低白血病细胞L1210对三种化疗药物的敏感性。结论:血小板可与白血病细胞相互作用,激活白血病细胞AKT和ERK信号通路,并可能通过该途径降低白血病细胞L1210对多种药物的敏感性。

5-氟尿嘧啶诱导的造血损伤中骨髓基质重建相关基因的表达及其意义

目的:探究胞外基质重建相关基因在氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)诱导的造血损伤重建中的表达及其意义。方法:采用C57BL/6小鼠腹腔注射5-FU(200 mg/kg)建立造血损伤模型。注射后3、6、9、15、21、27 d常规检测外周血象;在相同时间点用TRIzol法提取骨髓总RNA,反转录后以实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测胞外基质重建相关基因的mRNA水平,包括细胞外基质(ECM-1)、明胶酶(MMP-2)、基质降解素(MMP-3)、胶原酶(MMP-13)、组织金属酶抑制剂(TIMP-1)基因。结果:小鼠经5-FU注射后外周血出现典型的造血损伤与修复过程,且红细胞、白细胞、血小板损伤修复的动态不同;RT-q PCR显示在5-FU损伤期骨髓胞外基质重建相关基因的表达均显著上调,MMP-2在注射5-FU后第3天时表达最高,MMP-3、MMP-13、TIMP-1、ECM-1在第6天表达最高;MMP-3在骨髓中表达较低,但损伤后上升幅度最大。结论:在5-FU建立的骨髓造血损伤模型中,胞外基质重建相关基因可能参与造血损伤和随后骨髓基质的重构过程,且不同基因发挥的时段和作用对象不同,但彼此协同为造血损坏后重建奠定基础。

主动脉瘤/夹层中内皮细胞影响平滑肌细胞功能机制的研究进展

主动脉瘤/夹层是由于各种原因导致的主动脉扩张(主动脉瘤)或内膜撕裂(夹层),致死率极高。目前主动脉瘤/夹层的发病机制尚不明确。既往对主动脉瘤/夹层发病机制的研究侧重于对中膜平滑肌细胞的研究,忽略了血管内膜的作用。本文概述了内皮细胞通过分泌生物活性物质、肌-内皮缝隙连接以及细胞外基质对平滑肌细胞增殖、迁移、表型等的影响,解析了主动脉瘤/夹层的发病机制,为预防和治疗血管重构性疾病提供了新的思路。

Stanford A型主动脉夹层相关基因KIF20A的共表达网络构建及作用靶点分析

目的筛选Stanford A型主动脉夹层中的差异表达基因并构建基因共表达网络,以深入解析该疾病的发病机制并筛选潜在的新型分子标志物。方法在GEO数据库获取Stanford A型主动脉夹层相关的基因表达谱芯片,采用R语言limma包筛选差异表达的mRNA(P<0.05、|log2FC|>1),并选取主动脉夹层发病相关的关键差异基因进行深入研究,继而通过实时荧光定量PCR、Western blot检测关键差异基因及其所编码蛋白在Stanford A型主动脉夹层血管组织中的表达情况。利用生物信息学构建该基因的基因共表达网络,并应用R语言ggplot2等包对共表达基因进行功能和通路富集分析,明确该共表达网络所参与的生物学功能。进一步通过对共表达基因进行蛋白-蛋白互作(PPI)网络分析,筛选该关键差异基因的直接相互作用基因,并验证其相关性。最终建立主动脉夹层相关的基因互作图谱,探讨主动脉夹层发病的可能分子机制。两组间比较采用独立样本t检验。结果通过WALD检验筛选出969个在Stanford A型主动脉夹层中差异表达的基因。共表达网络分析发现KIF20A可能作为关键基因在A型主动脉夹层的发病过程中发挥作用,实时荧光定量PCR、Western blot结果显示其在患者组织中表达上调。针对KIF20A的基因共表达网络共纳入53个基因,相关性分析显示其中20个基因表达与KIF20A呈正相关,33个基因表达呈负相关。功能富集分析发现KIF20A共表达网络基因主要富集在上皮、组织等极性的建立和调控、线粒体功能以及精氨酸和脯氨酸代谢等生物学过程。PPI网络分析发现CDK1与KIF20A相互作用,且2个基因的表达量呈正相关(r=0.83,P<0.001)。结论KIF20A基因在Stanford A型主动脉夹层组织中升高,可能通过与CDK1相互作用调控一系列基因表达,影响上皮、组织等的极性建立和调控、线粒体功能等生物学进程,介导主动脉夹层的发生发展。

鼠抗人B7-H4单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备鼠抗人B7-H4单克隆抗体,并对其生物学特性进行初步鉴定。方法用稳定表达B7-H4分子的L929/B7-H4转基因细胞免疫6-8周龄的Balb/c小鼠。取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后,采用流式细胞术筛选阳性克隆,制备稳定分泌抗B7-H4单克隆抗体的细胞株,并用Western blot和Dot blot鉴定其生物学特性。细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定T细胞增殖情况。结果成功获得1株稳定分泌抗人B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为5C8。Western blot和Dot blot结果表明,5C8能与人B7-H4蛋白特异性结合。CCK-8实验显示,5C8可以阻断B7-H4分子对T细胞增殖的抑制作用。结论成功获得鼠抗人B7-H4单克隆抗体,为研究B7-H4分子在肿瘤中的作用提供了手段。

间充质干细胞来源的外泌体通过TGF-β1/Smad2/3信号通路抑制高糖诱导的成纤维细胞转分化

心脏纤维化是糖尿病患者心肌功能障碍的主要原因。成纤维细胞转分化为成肌纤维细胞是心脏纤维化过程中的一个关键性事件。该研究的目的是探究高糖诱导成纤维细胞转分化的分子机制,并找寻抑制成纤维细胞转分化的方法。结果显示,经高糖处理的BJ细胞(人皮肤成纤维细胞系)与正常BJ细胞相比,α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达明显上调。通过使用SB525334或转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)si RNA抑制TGF-β1/Smad2/3信号通路的活化,发现α-SMA和胶原I的蛋白质水平及Smad2/3的磷酸化水平均降低。同时,SB525334也抑制了高糖诱导的BJ细胞增殖。大鼠骨髓间充质干细胞来源的外泌体(mesenchymal stem cell-derived exosome,MSC-Exo)通过降低Smad2/3磷酸化水平,抑制高糖诱导的α-SMA表达。综上所述,高糖通过激活TGF-β1信号通路导致BJ细胞的转分化,而MSC-Exo通过抑制该通路防止BJ细胞的转分化。

小鼠抗人CD160分子单克隆抗体制备及其生物学功能初步分析

CD160分子是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白,是免疫超家族新成员,与其特异性配体HVEM分子结合所提供的共刺激信号在T细胞的增殖,活化,细胞因子产生和B细胞增殖,活化,分泌抗体产生等方面发挥着重要的调节作用。目前,市面上效果较好的IgG亚型的CD160抗体并不多,通过常规的基因克隆技术,基因重组技术,小鼠免疫技术以及经典的B淋巴细胞杂交瘤技术,获得能持续稳定分泌特异性鼠抗人CD160分子的IgG亚型单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用westen blot和竞争结合抑制实验,对获得的杂交瘤细胞进行生物特性方面的鉴定;采用间接免疫荧光法和流式细胞术分析CD160在健康人PBMC中T细胞表面的表达;T细胞增殖实验表明,此株单抗对于T细胞的体外增殖具有抑制作用。为进一步研究CD160分子的生物学效应提供了新的工具。