泛耐药基因NDM-1在大肠杆菌中的克隆表达及耐药性检测

目的:构建bla(NDM-1)基因重组质粒,表达新德里金属β内酰胺酶1(NDM-1),并检测携带bla(NDM-1)基因重组质粒的大肠杆菌的耐药状况。方法:PCR扩增编码NDM-1的基因bla(NDM-1),构建表达载体pGEX4T-1-NDM-1,并转化至大肠杆菌,转化子经PCR后测序,以确认构建和转化成功;用Western印迹验证重组蛋白的表达;用药敏纸片法检测含重组质粒pGEX4T-1-NDM-1的大肠杆菌的耐药谱;用E-test法测定其最低抑菌浓度(MIC)。结果:PCR及测序结果显示载体构建和转化成功;含重组质粒pGEX4T-1-NDM-1的大肠杆菌在37℃时,经1 mmol/LIPTG诱导5 h后,SDS-PAGE可见目的条带;除对替加环素和粘菌素敏感外,该重组子对多种碳青霉烯类抗生素耐药,E-test检测其对亚胺培南的MIC为64μg/mL。结论:构建了含泛耐药基因bla(NDM-1)的重组质粒,转入大肠杆菌后表达了融合蛋白,并对多种碳青霉烯类抗生素耐药。为进一步研究bla(NDM-1)基因和蛋白的功能奠定了基础。

清开灵注射液提取物及清开灵注射液与抗生素联合对含blaNDM-1超级细菌的抑菌效果

目的体外初步研究清开灵注射液主成分提取液和清开灵注射液与抗生素联合用药分别对含产新德里金属β-内酰胺酶-1(New Delhi metallo-β-lactamase1,NDM-1)基因的耐药细菌(blaNDM-1细菌)的抑菌性。方法采用琼脂稀释法和K-B法对清开灵注射液主成分板蓝根、金银花、栀子、黄芩苷4种药物提取液和清开灵注射液与抗生素联合用药分别对耐药超级细菌进行抑菌实验。并测定各提取液的最小抑菌浓度(MIC)值。结果清开灵主成分提取液对含blaNDM-1基因的耐药细菌均有不同程度的抑制效果,其中以黄芩苷为最好,对含blaNDM-1基因的耐药菌不动杆菌属/乙酸钙不动杆菌(WD)、鲍曼不动杆菌(WX)、嗜麦芽寡养单胞菌(WJ)和大肠杆菌pGEX-4T-NDM-1/DH5α(GST-NDM-1)的MIC分别为0.015、0.020、0.005、>0.020g/mL,而各提取液的MIC值的大小依次为黄芩苷、金银花、栀子、板蓝根;清开灵注射液与抗生素联合用药后,对含blaNDM-1基因多重耐药菌的抑菌效果非常明显,大大提高了各类抗生素单独用药的抑菌能力,其中以与青霉素类(青霉素G、美洛西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨苄西林/舒巴坦)效果最好,抑菌效果提高10倍左右,其他抗生素类药物抑菌效果都有不同程度的提高。结论清开灵注射液主成分提取液和清开灵注射液与抗生素联合用药对含blaNDM-1耐药基因细菌都有很好的抑菌效果,此研究为药物开发及对blaNDM-1超级耐药细菌的用药和治疗提供了理论依据。

用环介导等温扩增技术快速检测粪便样本中的沙门菌

目的：建立快速检测粪便样本中的沙门菌的环介导等温扩增技术（LAMP），并着重在灵敏度和特异性方面对此方法进行评价。方法：利用LAMP针对沙门菌特定基因invA（靶基因）设计的6条特异引物，通过引物特异性识别特定基因invA上的8个独立区域来快速检测沙门菌；LAMP反应过程中会产生白色沉淀焦磷酸镁，故可以通过监测浊度来判定反应结果。结果：实时浊度仪监测反应结果表明，LAMP反应在60～65℃等温条件下50min内完成；如果在反应前添加羟基萘酚兰，蓝色阳性结果很明显区别于紫色阴性结果；LAMP的最低检出限为6．97pg/μL，PCR为69．7pg/μL，LAMP方法的检测灵敏度是PCR的10倍，且具有良好的特异性。结论：LAMP方法用于快速检测沙门菌，具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果肉眼可辨、灵敏度高、特异性强的特点，对非沙门菌菌株的结果呈阴性，表明引物设计有很好的特异性。对粪便样本进行检测，发现具有同样的敏感性和特异性。这表明LAMP法是潜在的和有价值的在粪便样本中直接检测沙门菌的方法，具有快速、简便、低成本的特点。LAMP法适用于快速临床诊断。

肝硬化小鼠肠道菌群结构及血清炎性因子的变化

目的:观察肝硬化小鼠肠道菌群结构及血清炎性因子水平的变化。方法:通过CCl4灌胃构建小鼠的肝硬化模型;采用酶联免疫吸附法检测肝硬化进程中血清内毒素及炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α水平的变化;采集肝硬化小鼠新鲜粪便,通过荧光定量PCR实验检测肠道目的菌群的改变。结果:肝硬化小鼠肠道中拟杆菌属和梭菌属细菌显著减少,韦荣球菌属、肠杆菌属和肠球菌属细菌显著增加;随着肝硬化进程的加重,小鼠血液中内毒素及炎性因子水平显著提高。结论:肝硬化导致小鼠肠道菌群失调,促进了血液中内毒素及炎性因子水平的提高,形成恶性循环。

双向电泳结合质谱分析长双歧杆菌XY01分泌蛋白质图谱

菌体的分泌蛋白质在宿主和菌体的相互作用之间起着重要的作用.本研究采用双向凝胶电泳的方法建立了长双歧杆菌XY01分泌蛋白质图谱,通过MALDI-TOF/TOF质谱鉴定和数据库搜索,对鉴定到的分泌蛋白进行了分析.共检测到21个蛋白质点,成功鉴定18个蛋白质点,分别代表14个不同的蛋白质,等电点分布在4.5～7.0之间,分子质量分布在20～65 kD之间;通过COGs分类和功能分析,信号肽和细胞定位及KEGG代谢通路分析.结果表明,这些蛋白质对菌体细胞壁/膜的形成、生物信号传导和物质代谢等起着重要作用.研究结果为长双歧杆菌蛋白质组学和基因组学的研究提供了参考.

PinX1的原核表达、纯化及其与hTERT的相互作用

目的:原核表达人Pin2/TRF1结合蛋白X1(PinX1),确定该蛋白与人端粒酶逆转录酶(hTERT)催化亚基的相互作用。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增PinX1基因的编码序列,克隆至pET-32a载体构建重组质粒pHisPinX1,经双酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21并进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹检测His-PinX1的表达;用His磁珠纯化His-PinX1,在人肾胚细胞293T内检测His-PinX1与hTERT的相互作用。结果:扩增得到980 bp的PinX1基因;Western印迹检测表明,相对分子质量约57×103的His-PinX1获得表达,且纯化的His-PinX1与hTERT具有相互作用。结论:表达并纯化得到了与hTERT相互作用的His-PinX1,为深入研究PinX1的功能奠定了基础。

乳腺癌雌激素受体β不同亚型表达载体的构建及其转录活性分析

目的:构建人乳腺癌中雌激素受体β(ERβ)3种亚型ERβ1、ERβ2和ERβ5的真核表达载体,测定不同亚型ERβ的转录活性。方法:以乳腺癌细胞MCF7的cDNA为模板,PCR扩增ERβ1、ERβ2和ERβ5基因,分别克隆到pXJ40-Myc载体,Western印迹检测克隆载体在293T细胞内的表达;将上述载体与含雌激素应答元件(ERE)的萤光素酶(Luc)报告基因载体(ERE-luc)共转293T细胞,测定各亚型ERβ的转录活性。结果:构建了Myc-ERβ1、Myc-ERβ2和Myc-ERβ5表达载体,转录活性结果显示上述表达载体均具有活性,雌激素可升高ERβ1的转录活性,不能升高ERβ2和ERβ5的转录活性。结论:该研究为进一步探讨不同亚型ERβ在乳腺癌中的功能奠定了基础。

基于量子点标记技术的免疫层析法检测新型冠状病毒N蛋白IgG抗体研究

背景基于目前新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(COVID-19),早诊断、早隔离、早治疗是防控传染的重要方法。建立方便快捷的免疫层析检测技术,对于防控SARS-CoV-2的传播十分必要。目的建立基于量子点标记技术的免疫荧光层析法检测抗SARS-CoV-2 N蛋白IgG抗体的方法,判断被检测者是否感染过SARS-CoV-2或者是否接种过SARS-CoV-2灭活疫苗。方法2020年8月将制备好的鼠抗人二抗和抗N蛋白抗体固定至硝酸纤维素(NC)膜上,分别作为检测线(T)和质控线(C),然后将量子点标记的SARS-CoV-2 N蛋白均匀喷洒在玻璃纤维上,干燥后组装、切割、包装成试纸条。用该试纸条分别检测35例COVID-19患者和50例健康人的血清,以酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒初筛结果作为对照,计算量子点荧光免疫层析法的检测特异度和灵敏度,并利用N蛋白抗体标准品检测试纸条灵敏度。结果本研究制备的试纸条特异度为100.00%,灵敏度为94.29%,灵敏性为8.53~17.06 ng/ml抗体浓度。结论采用量子点标记技术检测血清中的抗N蛋白IgG抗体,操作简单、快速,灵敏度及特异度强。

食源性致病菌核酸检测技术研究进展

近年来,食源性疾病的发病率逐年升高,已成为全球范围内的重大公共卫生问题。致病菌广泛存在于各种食品中,快速检测食源性致病菌,对提供安全的食物和预防食源性疾病具有重要的现实意义。由于传统食源性致病菌检测方法耗时耗力,因此建立食源性致病菌的快速检测技术尤为重要。食源性致病菌的核酸检测技术具有简便、耗时短、特异性强、灵敏度高等优点,已被广泛应用于食源性致病菌的检测。着重介绍近年来用于食源性致病菌检测的核酸检测技术,包括常规聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、多重聚合酶链式反应(multiplex-PCR,mPCR)、实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qPCR)、环介导等温扩增反应(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA),并对其优缺点,以及适用范围进行总结,旨在为开发出简单、快速、有效、准确的检测方法提供一定的理论依据。

基于HAND系统5种致腹泻大肠杆菌多重实时PCR初筛方法的建立

以实验室17株种属关系较近的菌株进行特异性评价,通过溶解曲线T m值对扩增产物进行分析表明,该方法具有高特异性,可同时检出5种致泻性大肠杆菌EAEC(aggR)、EHEC/EPEC(eae)、ETEC(LT)和EIEC(ipaH)的相关毒力基因。粪便模拟样本试验表明,其敏感性达10^4~10^6 CFU/mL。建立的多重实时PCR检测方法适用于5种致泻性大肠杆菌的初步筛选。

基于CiteSpace计量分析替加环素耐药性研究热点与趋势

目的自替加环素投入使用以来,临床上不断涌现对其耐药的菌株,其耐药性的研究一直备受关注。此研究基于CiteSpace的计量分析及可视化功能,探究替加环素耐药性研究进展、研究热点与发展趋势。方法数据来源于2012—2022年中国知网、万方数据知识服务平台、维普中文服务平台、Web of Science(WOS)共4263篇替加环素耐药性的中文、英文文献,运用CiteSpace 5.8.R3软件对纳入文献的发文量,期刊共被引及关键词进行分析,探究替加环素耐药性的研究历程与未来发展趋势。结果英文文献发文量高于中文文献;中国发文量最多,在此研究领域的国际学术影响力较大;全球国家均对替加环素耐药性保持一定的关注,但中文文献较关注替加环素耐药性的临床感染和防治问题,英文文献更侧重替加环素耐药机制的研究。结论国内外研究方向大致相同,但研究热点从替加环素的临床用药治疗和监测逐渐向分子层面的耐药机制转移。

1株多黏菌素和替加环素耐药的肺炎克雷伯菌基因组特征分析

目的本研究对1株分离自2009年的多粘菌素和替加环素耐药菌进行分析,探讨耐药质粒结构及基因遗传环境,为多药耐药菌的防控提供依据。方法对菌株进行多黏菌素和替加环素耐药基因筛查,获得1株mcr和tet(M)阳性菌株(编号为GZ12244)。使用vitek-2进行菌种鉴定,采用微量肉汤稀释法进行药敏试验,运用全基因组测序和生物信息学手段对其分子分型、耐药基因、插入序列、质粒结构、基因遗传背景进行分析。结果菌株GZ12244为肺炎克雷伯菌,对多黏菌素B、替加环素、头孢呋辛、四环素等耐药,并携带mcr-1、tet(M)等多种耐药相关基因,且部分具有抗生素外排和抗生素靶点改变作用的耐药基因存在氨基酸取代突变。mcr-1与tet(M)共存于一个质粒,mcr-1侧翼包括两个插入序列ISApl1,tet(M)基因上下游存在IS15、IS1D、ISEc63等插入序列。结论肺炎克雷伯菌GZ12244为多重耐药菌株,耐药基因存在于质粒中,上下游的移动元件使耐药基因存在潜在传播的可能。

2010—2022年疫苗稳定性研究热点及趋势可视化分析

目的分析并追踪疫苗稳定性研究领域的热点和未来发展趋势,为疫苗稳定性研究提供参考。方法选取中国知网、万方、维普和Web of science核心数据库,以疫苗和稳定性为主题词,2010年1月1日至2023年1月1日为时间限定,检索相关文献。运用CiteSpace6.1.R3软件对文献的数量、作者、机构,高频关键词、突现词以及时间线方面进行可视化分析。结果本次共纳入中文文献3253篇,英文文献4941篇,发文数量均呈上升趋势;中文文献发表数量最多的机构为南京农业大学,发表英文文献最权威的机构为堪萨斯大学;发表中文文献数量最多的研究人员是张春杰、李玉华,英文文献发表数量最多的是ZHANG Y;出现频次最高的中文关键词为稳定性,英文关键词为in vivo;中文关键词得到10个聚类标签,英文得到9个;中文文献近3年的突现词强度最大的是非洲猪瘟病毒,英文文献中是coronavirus。结论未来研究应更加关注疫苗稳定性的方法技术和机制原理方面,以提高疫苗的可及性和成果效益。

多重环介导等温扩增快速检测沙门菌、副溶血弧菌和单核细胞增生性李斯特菌方法的建立

目的建立能够同时检测沙门菌、副溶血弧菌(VPH)和单核细胞增生性李斯特菌(LM)的多重环介导等温扩增(mL AMP)方法。方法分别针对沙门菌bcfD基因、VPH的tlh基因和LM的iap基因设计mL AMP引物,以LAMP进行单重LAMP检测。实时浊度监测扩增结果,优化引物浓度配比,进而建立此3种食源性致病菌的mL AMP检测体系,以PCR检测灵敏性作为比较,进行特异性和灵敏性分析。结果实时浊度监测表明,该mL AMP体系具有良好特异性,可在45 min内一次性检测以上3种致病菌,且无非特异扩增产生。这3种菌的检测最低限分别为300 fg/μl、4.2 pg/μl和4.5 pg/μl,与PCR检测灵敏度相当。结论该多重LAMP可同时检测食品中的沙门菌、VPH和LM,可作为大规模样品的初筛或传统方法的辅助方法,用于快速判定样品中是否含有这3种致病菌。

基于颜色判定的环介导恒温扩增法快速检测副溶血性弧菌

利用DNA环介导恒温核酸扩增法(LAMP)针对副溶血性弧菌特异基因tlh基因设计4条引物,通过引物特异性识别tlh基因上的6个独立区域来快速检测副溶血性弧菌.LAMP反应的过程中会产生白色沉淀焦磷酸镁,故可以通过监测浊度来判定反应结果.实时浊度仪监测反应结果表明,LAMP反应在60～65℃恒温条件下50min内完成;如果在反应前添加羟基萘酚兰(HNB),蓝色的阳性结果很明显区别于紫色阴性结果;LAMP方法的最低检出限为9.74pg/μL,PCR方法最低检出限为97.4pg/μL,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法检测灵敏度的10倍,且具有良好的特异性.LAMP方法用于快速检测副溶血性弧菌具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果肉眼可辨别、灵敏度高和特异性强的特点,所以LAMP方法检测副溶血性弧菌特别适合用于现场和基层检疫及医疗单位的快速诊断.

乙肝肝硬化患者肠道微生物元基因组学的研究

目的比较分析乙肝肝硬化患者与正常人远端肠道微生物群的差异,探讨乙肝肝硬化与肠道微生物群变化的关系。方法选取11例乙肝肝硬化患者及20例正常人,提取其肠道微生物元基因组,采用高通量Solexa测序方法,通过基因比对、主成分分析、属种定量及功能代谢组成等生物信息学分析方法,找出疾病相关的属种和基因信息。结果与结论属种定量及组成分析发现,乙肝肝硬化患者存在不同程度的肠道菌群失调,表现为肠杆菌科(尤其是大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和志贺菌属)以及韦荣球菌属富集(P<0.05),拟杆菌属缺失(P<0.05);功能及代谢分析发现,乙肝肝硬化患者富集较多的执行氨基酸和碳水化合物膜转运及代谢功能的基因。

肝硬化患者肠道微生物代谢功能的宏基因组学研究

目的分析肝硬化患者远端肠道微生态菌群代谢功能的变化。方法选取16例肝硬化患者及20例正常人,提取其肠道微生物宏基因组DNA进行高通量Solexa测序,对测序基因进行代谢功能的注释,比较肝硬化患者与正常人之间的差异,找出疾病相关的肠道微生物代谢功能的变化。结果肝硬化患者肠道菌群功能多样性降低,对药物、必需氨基酸、丙酸盐等的代谢能力以及炎性反应显著增强,而对丁酸盐、胆汁酸的代谢能力以及细胞周期相关的功能显著降低。结论在肝硬化的影响下,肠道微生物的生长环境被破坏,肠道菌群为了适应环境,在功能和代谢方面表现出一定程度的代偿。

基于颜色判定的DNA环介导恒温扩增法快速检测金黄色葡萄球菌

目的建立基于颜色判定的DNA环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)快速检测金黄色葡萄球菌(SAU)技术。方法利用LAMP法针对SAU特异基因nuc基因设计7套引物,通过对7套引物扩增效率进行比较得到最佳引物组合来快速检测SAU,采用两种结果判断方法在50 min内完成反应。结果 LAMP方法检测核酸的最低浓度为7.16 pg/μl,灵敏度为PCR法的10倍(PCR法为71.6 pg/μl),同时采用22种同源或相似菌种进行特异性检测,结果表明具有良好的特异性。结论 LAMP方法检测过程简单,实验装置简便,反应结果肉眼可视化辨别,灵敏度高,特异性强,特别适合基层防疫与检疫部门对SAU的快速检测。

基于颜色判定的环介导恒温扩增法快速检测结核分枝杆菌

目的建立快速检测结核分枝杆菌环介导的恒温扩增法。方法针对结核分枝杆菌特异性保守靶序列IS6110,采用环介导的恒温扩增法(LAMP)引物设计原则设计6条引物,特异性识别靶基因序列上8个独立区域。LAMP反应过程中会产生焦磷酸镁白色沉淀,可以通过实时监测反应液浊度来判断反应结果。结果试验表明,在60～65℃恒温条件下,LAMP反应60 min内即可完成;如果在反应前添加钙黄绿素,可通过反应液颜色的变化来判断反应结果;LAMP方法的最低检出核酸浓度为101 pg/μl,其灵敏度是PCR方法最低检出浓度1.01 ng/μl的10倍,且具有良好的特异性。结论 LAMP方法检测结核分枝杆菌具有简单、快速、价廉、特异性强、灵敏度高等特点,适用于疾控工作及临床筛查或快速检测结核杆菌。

中国人群中替加环素耐药菌流行现况

临床上抗菌药物大量使用导致多重耐药和泛耐药细菌数量逐年上升,甚至出现了对替加环素耐药的“超级细菌”,这是临床治疗正在面临的巨大难题。目前我国替加环素耐药菌在人群中的分布尚不明确,且细菌对替加环素的耐药机制复杂且多样,可通过多种调控途径对替加环素产生耐药性。质粒、转座子、整合子等多种可移动遗传元件也可作为替加环素耐药基因传播的载体,对替加环素耐药菌在人群中的快速传播发挥至关重要的作用。因此本文对2018年1月1日-2022年12月31日5年间中国内地人群中替加环素耐药菌株的流行病学特征及耐药传播机制进行全面阐述,旨在为临床抗菌药物的合理使用及耐药菌的有效控制提供科学依据。