miR-130b在食管鳞癌中的表达及对食管鳞癌细胞增殖和迁移的影响

目的:检测微小RNA-130b(miR-130b)在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)组织中的表达并探讨其对ESCC细胞增殖、迁移的影响.方法:microRNA(miRNA)芯片筛选ESCC组织中异常表达的miRNAs,TaqMan MGB探针法定量PCR检测19例ESCC组织及配对癌旁组织标本中miR-130b的表达;通过脂质体转染模拟物miR-130b mimics(miR-130bm)促进ESCC细胞Eca109中miR-130b的表达,转染抑制物miR-130b inhibitor(miR-130bi)抑制Eca109细胞中miR-130b的表达;进一步采用CCK-8法和Transwell迁移实验检测ESCC细胞增殖、迁移的变化;生物学信息预测miR-130b的靶基因,双荧光素酶报告基因验证其靶向作用;采用SYBR Green定量PCR和Western blot检测靶基因mRNA和蛋白表达.结果:miR-130b在ESCC组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.01);转染miR-130bm可有效增加ESCC细胞Eca109中miR-130b的表达,进而促进Eca109细胞的增殖和迁移,平均迁移细胞数明显多于对照(112.9±2.4vs54.3±1.8,P<0.01);转染miR-130bi则降低细胞中miR-130b的表达;进而抑制细胞的增殖和迁移,平均迁移细胞数较对照明显减少(33.9±2.3vs56.2±1.9,P<0.01).miR-130b可作用于PTEN3'非翻译区抑制其表达.miR-130b可负向调控PTEN蛋白表达,并促进Akt磷酸化,但对PTENmRNA表达无明显影响.结论:miR-130b在ESCC组织中表达上调,增加其表达促进ESCC细胞Eca109增殖和迁移,降低其表达则抑制Eca109细胞增殖和迁移;miR-130b可在转录后水平负向调控PTEN的表达并促进Akt磷酸化.提示miR-130b有望成为ESCC治疗的新靶点.

临床及亚临床快速眼动睡眠期行为障碍与帕金森病认知功能的相关性

目的探讨快速眼动睡眠期行为障碍(REM sleep behavior disorder,RBD)及亚临床快速眼动睡眠期行为障碍(subclinical REM sleep behavior disorder,s RBD)与帕金森病(Parkinso's disease,PD)患者认知功能的关系。方法选择南昌大学第二附属医院53例PD患者,记录患者的年龄、性别、学历等一般情况。排除存在痴呆的PD患者,以面对面的方式进行相关量表评估,包括蒙特利尔认知量表评分(Montrealcognitive function score,MoCA)、帕金森病综合评分量表(Unified Parkinson Disease Rating Scale,UPDRS)、帕金森病睡眠量表(Parkinson Disease Sleep Scale,PDSS)等。使用多导睡眠图监测患者的睡眠质量,并进行分组:PD合并RBD组(PD-RBD)、PD合并s RBD组(PD-s RBD)、PD正常组(PD-REM),比较3组之间认知功能的差异。结果 (1)PD-RBD组的MoCA总分较PD-REM组低(P=0.032)。(2)PD-s RBD与PD-REM组的认知功能差异无统计学意义。(3)PD-RBD组病程较PD-s RBD组更长(P=0.021)。结论 RBD可能是PD患者认知功能障碍的一个重要相关因素;s RBD对PD的认知功能无明显相关;尚不清楚s RBD是否会进展为RBD,仍需进一步的研究。

帕金森病合并快速眼动睡眠行为障碍与认知功能相关性的研究进展

帕金森病（PD）的主要临床特征为静止性震颤、肌强直、运动迟缓及姿势步态异常,除了典型的运动症状外,PD患者还伴随众多非运动症状。认知功能障碍是PD不可忽略的非运动症状之一,PD早期即可出现认知功能受损[1]。近年来的研究显示,快速眼动睡眠行为障碍（RBD）可能是PD患者认知功能障碍的又一危险因素,为认知功能障碍提供早期识别和干预的机会,进而延缓PD痴呆（PD with dementia,PDD）的出现，提高患者的生活质量。

罕见病诊治思考与展望

近年来,随着医学技术的高速发展,罕见病的诊治取得了巨大进步,高通量测序技术在罕见病临床诊断中发挥了重要作用。通过基因诊断,临床医生对罕见病的基因突变谱系、临床表型等都有了新的认识,可采取有针对性的治疗和预后管理。文章结合“基因组技术与罕见病诊治”专题中的多篇报道,从罕见病表型分析、检测技术的合理应用、遗传检测结果及其临床意义的正确分析、罕见病药物研发等角度展开述评,以期为罕见病的临床实践提供参考。

五个遗传性血小板无力症家系的表型和基因型诊断

目的:对5个遗传性血小板无力症(GT)家系进行临床表型和基因型诊断。方法:通过止血和凝血指标检测、血小板(PLT)聚集试验和流式细胞术明确5个GT家系的诊断,用PCR扩增结合直接测序法分析先证者的αⅡb基因和β3基因的所有外显子及其侧翼序列,突变位点经直接测序证实排除基因多态性。同时选择100名健康人作为对照进行分析。结果:5个家系的先证者PLT计数均正常,凝血象正常,而出血时间(BT)延长;PLT对多种诱聚剂反应低下,而对瑞斯托霉素反应基本正常;流式细胞术结果显示,除家系3先证者为Ⅲ型GT外,其余4个家系的先证者均为Ⅰ型GT。基因分析共发现8种突变,均发生于αⅡb基因,分别为1750C>T(Arg553Stop)、2671C>T(Gln860Stop)、235G>T(Glu48Stop)、1084T>C(Phe331Leu)、1772A>C(Asp560Ala)、69-79del(移码突变)、2333A>C(Gln747Pro)和3060G>C(Lys989Asn)。结论:αⅡb1750C>T和αⅡb2671C>T复合杂合突变是导致家系1先证者发生GT的原因;αⅡb2671C>T和αⅡb235G>T复合杂合突变是导致家系2先证者发生GT的原因;αⅡb1084T>C和αⅡb1772A>C复合杂和突变是导致家系3先证者发生GT的原因;αⅡb69-79del纯合突变是家系4先证者发生GT的原因;αⅡb2333A>C和αⅡb3060G>C是家系5先证者发生GT的原因。235G>T、1084T>C、1772A>C和3060G>C突变为国际首次报道的发生于αⅡb基因的突变。

罕见病诊疗进展与挑战

罕见病的诊疗是全球医疗领域的重要挑战之一。近年来,随着科学技术的迅猛发展和相关政策的相继出台,罕见病诊疗相关研究取得了巨大进展。文章聚焦罕见病精准诊断过程中分子诊断技术的应用和遗传变异的解读,结合专题中的多篇报道展开述评,以期为罕见病诊疗工作的推进提供参考。

蛋白C P275S突变导致遗传性蛋白C缺陷症的分子机制研究

目的研究蛋白C(PC)基因P275S突变导致遗传性PC缺陷症的分子机制。方法构建PC基因野生型和P275S突变型表达质粒,并瞬时转染HEK293T细胞和COS 7细胞进行体外表达。ELISA检测转染细胞上清液和细胞裂解液的PC抗原;实时荧光RT-PCR(real time,RT-PCR)检测转染细胞PC mRNA表达量的改变;细胞免疫荧光染色检测PC在内质网和高尔基体内的分布。结果转染细胞上清液和细胞裂解液中的PC P275S抗原分别为野生型PC抗原的22.6%和78.9%;实时RT-PCR结果显示,与野生型PC相比,PC P275S突变体在mRNA水平没有减少;细胞免疫荧光染色显示,野生型PC蛋白在内质网和高尔基体中均有大量分布,而PC P275S突变蛋白主要位于内质网中。结论分泌障碍和细胞内降解是PC P275S导致PC缺陷症的原因。

小鼠尿激酶型纤溶酶原激活物与其受体结合关键氨基酸的鉴定

目的尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)在细胞表面介导多种生物学效应。本文目的是解析小鼠uPA蛋白结构中与其受体结合的关键氨基酸。方法包含小鼠uPA全长cDNA的质粒购于ATCC公司,小鼠cDNA序列进一步克隆至Puro-pMT表达载体。用定点突变法构建各类uPA突变体表达质粒。表达质粒用磷酸钙转染至S2细胞中,用10μg/ml嘌呤霉素筛选稳定表达细胞。表达的重组蛋白分别用CM sephadex柱和sephadex G75柱纯化。纯化后的蛋白分别用SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定。用表面等离子共振技术(SPR)检测重组uPA与uPAR的结合常数。结果用定点突变法成功构建小鼠uPA S22、Y23、K24、Y25、F26、S27、I29、R31、E41、S358分别突变为丙氨酸的突变体及R28、30、31突变为N28、H30、W31的突变体M3。经阳离子交换层析和分子筛纯化,重组蛋白的纯度均大于95%并能被小鼠uPA抗体所识别。结合试验表明野生型uPA和M3型uPA的KD值分别为0.467 nM和1.64 nM,10种点突变uPA的KD值范围为0.388 nM至36.5 nM。结论小鼠uPA中至少有7个氨基酸(Y23、K24、Y25、F26、S27、I29、R31)涉及小鼠uPA-uPAR的结合;Y23、Y25和F26是其中的关键氨基酸。

Cardio-facio-cutaneous综合征2例报告并文献复习

目的探讨Cardio-facio-cutaneous综合征(CFC)的临床表型及基因变异特征。方法提取2例CFC患儿及其父母外周血DNA,采用靶向基因高通量测序技术检测变异基因,并运用Sanger测序进行验证。结果 2例患儿均为汉族女性,分别为13个月和7岁半,有内眦赘皮、鼻梁塌平、头发稀疏等相似的颅面部特征,均伴有生长发育迟缓及癫痫发作史。1例心电图有T波变化,P-R间期正常高限;另1例心电图正常。基因检测显示,2例患儿在MAP2K1基因3号外显子上各有一处杂合的错义变异,分别为c.383G>T,p.Gly128Val和c.389A>G,p.Tyr130Cys,且均为新生突变(de novo),均系文献报道过的CFC变异位点。结论 2例为国内首次报道CFC病例,且均为MAP2K1基因突变型。因既往报道CFC患儿大多合并心脏病变,2例患儿均继续随访心脏功能。

一例遗传性蛋白C缺陷症家系的实验诊断

目的对1例遗传性蛋白C缺陷症家系进行临床表型诊断和基因突变检测。方法用发色底物法测定血浆蛋白C活性;用聚合酶链反应(PCR)法对先证者PC基因(PROC)的9个外显子及其侧翼序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。家系成员DNA在先证者PROC基因突变区域扩增后测序,进行家系调查以期发现遗传规律。结果先证者蛋白C活性为38.6%,抗原为45.3%。直接基因测序分析发现先证者PROC基因外显子7区存在杂合错义突变c.565C>T,该突变将引起编码的蛋白C 147位精氨酸被色氨酸替换(p.Arg147Trp)。家系分析发现先证者的c.565C>T突变遗传于其父亲。结论 c.565C>T杂合突变是导致该家系遗传性PC缺陷症的原因。

LIG4基因突变导致慢性腹泻1例报告并文献复习

目的探讨LIG4综合征的发病机制和诊断。方法回顾分析1例LIG4综合征患儿的临床资料及基因检测结果。结果患儿,男,19个月,慢性腹泻病伴病毒、细菌和真菌混合感染;小头外貌,发育落后,营养不良;血常规示白细胞计数,尤其中性粒细胞和淋巴细胞数显著减少,T细胞和B细胞减少,考虑为免疫缺陷病。二代测序发现患儿存在LIG4致病基因的复合杂合变异,即错义突变c. 833 G>T;p.Arg 278 Leu以及缺失突变c. 1271_1275 del, p.Lys 424 Argfs*20。结论慢性腹泻合并多重感染应警惕免疫缺陷病,基因检测有助确诊。

Pt—C—PTFE疏水性催化剂的H_2O—H_2同位素交换研究

本文简要介绍了Pt-C-PTFE疏水性催化剂的制备方法,采用此种催化剂进行了T-H交换实验,得到催化活性与温度、氢气流速的关系。同时对气/液并流和气/汽并流交换实验作了比较,后者活性大大高于前者。此外,在疏水性催化济中加入适量亲水性载体,可以大大提高催化剂的交换效率。

靶向基因高通量测序技术诊断儿童基因组病的可行性研究

目的·对10例临床怀疑基因组病的患儿进行临床分子诊断,初步探讨靶向基因高通量测序技术检测拷贝数变异(CNVs)的可行性。方法·对患儿进行外周血DNA靶向高通量测序,通过生物信息学分别分析其基因组CNVs,确定致病CNVs位点及大小,同时使用染色体基因芯片技术作为对照方法检测CNVs。结果·靶向测序分析结果表明:在其中1个患儿基因组的17号染色体q25.1—q25.3区域存在9 345 kb的重复(3个拷贝),而另1个患儿基因组中存在15号染色体q11.2—q13.1区域的8 232 kb的杂合缺失,其余8例患儿基因组未见可疑CNVs。染色体基因芯片检测结果与高通量测序结果相比高度一致。结论·借助于分子诊断技术,2名患儿被确诊为基因组病。临床应用靶向基因高通量测序技术检测CNVs完全具有可行性。

一个纤维蛋白原α链Arg 19 Gly突变导致的遗传性异常纤维蛋白原血症家系

目的对一个遗传性异常纤维蛋白原血症家系进行表型和基因型分析。方法采集先证者及其父母外周血进行常规出凝血检查,用Clauss法和免疫比浊法分别检测纤维蛋白原(Fbg)活性和抗原。抽提DNA,PCR扩增纤维蛋白原基因FGA、FGB和FGG所有外显子及其侧翼序列,DNA测序并与基因文库比对确定基因异常。结果先证者活化部分凝血酶原时间(aPTT)、凝血酶原时间(PT)正常,凝血酶时间(TT)为28.10 s,Fbg活性明显下降,抗原在正常范围内,活性显著低于抗原;其父表型检测结果与之相似。基因分析发现,先证者及其父亲Fbg、FGA基因第2外显子均存在A1211G杂合碱基置换,导致Arg19Gly错义突变。结论鉴定该病例为遗传性异常纤维蛋白原血症,Fbgα链Arg19Gly杂合错义突变是致病原因。

全基因组测序技术在临床诊断中的应用

全基因组测序技术以其技术原理和检测范围为主要优势,已经在遗传病基因诊断、肿瘤基因检测、个体化用药研究等不同场景中展现出强大的应用价值。虽然全基因组测序技术相对于其他基因检测技术拥有更好的诊断效率、检测灵敏度和准确性等特点,但作为新技术必然存在应用及推广过程中的困难与挑战。该文主要述评了全基因组测序技术在临床诊断及其他相关领域中的应用及部分实例,同时为进一步优化和完善该技术的应用前景,详细探讨了该技术的优势与挑战。

miR-195在食管癌中的表达及其对食管癌细胞株增殖的影响

目的:探讨microRNA-195(miR-195)在食管癌中的表达及其对食管鳞癌细胞Eca109增殖的影响。方法:采用Taqman探针实时定量PCR方法检测10对外科手术食管鳞癌标本miR-195的表达,用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将miR-195类似物转染入Eca109细胞,Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot检测蛋白表达水平。结果:与正常食管上皮相比,食管鳞癌组织miR-195表达明显降低(P<0.05)。在48、72、96 h,miR-195转染组细胞吸光值明显低于对照组(P<0.05),且miR-195转染组处于G0/G1期细胞的百分数明显高于对照组(P<0.05)。Western blot结果显示miR-195转染组Cdc42蛋白水平明显低于对照组(P<0.05)。结论:miR-195可阻滞Eca109细胞从G1期进入S期,抑制其增殖。

同一等位基因复合杂合突变导致Ⅰ型遗传性抗凝血酶缺陷症

目的对1例遗传性抗凝血酶(AT)缺陷症先证者及其家系进行表型诊断和基因诊断。方法采用免疫比浊法和发色底物法分别检测先证者及其家系成员的AT抗原(AT:Ag)和AT活性(AT:A),抽提外周血基因组DNA,PCR扩增AT基因(SERPINC1)7个外显子及其侧翼序列,应用直接测序法对先证者进行AT基因序列分析。针对先证者中发现的突变位点,对其家系成员进行相应基因突变检测,同时在100例正常人中筛查以排除多态性。结果先证者AT:Ag和AT:A分别为114 mg/L和54.8%。其AT基因外显子2区发现了2个杂合点突变,分别为c.134G>A和c.342T>G。其家系部分成员检测到相应的杂合突变。家系遗传分析表明,2个杂合突变位于同一等位基因。结论同一等位基因复合杂合突变是导致该家系Ⅰ型遗传性AT缺陷症的分子原因。

F9基因Arg327Ile新突变导致血友病B的分子发病机制研究

目的探讨F9基因Arg327Ile(R327I)突变导致血友病B的分子发病机制研究。方法对1名血友病B患者作实验室和基因诊断,定点突变法构建F9基因R327I突变的表达质粒;瞬时转染HEK293细胞,一期法检测细胞上清液中凝血因子Ⅸ活性(FⅨ∶C),ELISA法检测细胞上清液和裂解中FⅨ抗原(FⅨ∶Ag),Western blotting检测R327I突变蛋白的分子量及表达量;免疫荧光共定位染色法检测突变蛋白在内质网和高尔基体内分布。结果瞬时表达显示该患者突变细胞标本上清液中R327I突变型FⅨ∶C为野生型的4.49%,明显降低;细胞上清液和裂解液FⅨ∶Ag分别为野生型的31%和129%,为交叉反应物质减低型(CRMR)。Western blotting显示细胞上清液中R327I突变蛋白分子量与野生型相同,但含量比野生型明显降低;免疫荧光共定位染色显示R327I突变蛋白在内质网中分布较野生型多,而在高尔基体中较野生型少。结论 F9基因R327I突变影响蛋白质合成和分泌,突变蛋白较野生型表达量偏低,同时R327I突变蛋白存在凝血功能缺陷从而导致血友病B。

一例GPⅡb基因突变导致血小板无力症的诊断

目的对1例血小板无力症(GT)患者进行实验诊断,分析引起血小板膜糖蛋白(GP)缺陷的突变基因。方法通过对先证者凝血常规、血小板计数、血小板聚集功能、出血时间、GPⅡb/Ⅲa(CD41/CD61)含量等项目的检测和血涂片中血小板形态及分布的观察,进行临床表型诊断。通过聚合酶链反应(PCR)扩增结合测序的方法,分析先证者GPⅡb/Ⅲa基因的所有外显子区及其侧翼序列,家系成员仅在相应突变区域进行PCR扩增和测序。同时以100名健康人作为对照进行分析,以排除基因多态性。结果先证者凝血常规检测和血小板计数正常,但出血时间延长,血小板聚集功能异常;表现为对多种生理性诱聚剂反应低下,但对瑞斯托霉素反应正常,血块退缩不良;流式细胞术检测CD41、CD61含量显著降低;血涂片中血小板散在,无聚集现象。经测序,发现先证者GPⅡb基因23号外显子存在18183A>C杂合变异,导致GPⅡb蛋白Q778P替换。与100名健康对照者测序比较,排除基因多态性,证实其为基因突变。结论 GPⅡb基因的Q778P杂合突变是导致该先证者患GT的原因之一。

“限塑令”政策实施有效性的后评估调研

为掌握国务院＂限塑令＂政策的实施效果,评估＂限塑令＂政策的有效性,分别在2008年3月、10月及2011年4月这3个特征月中各选取1周的连续时间,对上海市杨浦区3个按房价高低划分的高、中等及普通收入水平小区中居民塑料袋的消费总量以及不同类型塑料袋的消费数量进行多次抽样调查。调查结果表明：＂限塑令＂实施3年来,居民塑料袋消费总量先下降后反弹,但总体低于＂限塑令＂实施前;塑料袋有偿使用制度执行部分有效;不同类型塑料袋使用数量变化趋势各异;超薄塑料袋禁止基本未实现;塑料袋收费的敏感群体有所转变。