抗水禽呼肠孤病毒σC蛋白抗体间接ELISA方法的建立及鹅群血清学调查

为提供水禽呼肠孤病毒病早期诊断的精准快速检测方法,该试验通过BL21(DE3)原核表达系统稳定表达水禽呼肠孤病毒σC蛋白,并将纯化的重组σC蛋白包被ELISA酶标板,经进一步反应条件优化。结果显示,该试验建立的ELISA检测方法最优反应条件是:抗原包被含量为1μg/孔,待检血清最佳稀释度为1∶50,孵育时间为45 min,酶标二抗最佳稀释度为1∶500,孵育时间为30 min,最佳底物显色时间为20 min,OD_(450)值≥0.3判定为阳性。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,对水禽呼肠孤病毒基因Ⅰ型和基因Ⅱ型血清具有一定的交叉反应。对105份临床健康鹅群血清样品进行检测,阳性率高达77.33%。该研究提供了一种敏感高效的快速检测水禽呼肠孤病毒中和抗体的方法,为鹅群临床血清大规模检测提供方法,为研发商品化的ELISA检测试剂盒提供基础。

鹅源鼠伤寒沙门菌crp、hfq基因缺失株的构建及生物学特性分析

为构建鹅鼠伤寒沙门菌单基因缺失株并鉴定其生物学特性,本研究以广东地区鹅源鼠伤寒沙门菌流行株A29为研究对象,采用λ-Red同源重组技术,分别构建crp、hfq基因缺失株(A29Δcrp和A29Δhfq)及相应基因回补株,并分别采用相应引物经PCR鉴定。通过细菌培养,对各菌株生物学特性进行比较;通过PCR鉴定各菌株的遗传稳定性;采用K-B纸片扩散法检测各菌株的药物敏感性;将各菌株纯培养物经腹腔注射4周龄小鼠,测定各菌株对小鼠的毒力,并观察感染后小鼠的临床症状及各组织剖检病变与组织病理变化。PCR和测序结果表明,正确构建各基因缺失株和相应回补株。生物学特性试验结果显示,与亲本株相比,A29Δcrp菌落直径极显著变小(P<0.001),不产酸、不产生H_(2)S,菌体极显著变短(P<0.001);A29Δhfq菌落边缘不整齐,不产生H_(2)S,菌体极显著变长(P<0.001),表明crp、hfq基因影响细菌的菌落形态、生化特性和形态特征。菌株遗传稳定试验结果显示,菌株传至60代时,基因缺失株仍能够稳定缺失。药敏试验结果显示,与亲本株比较,A29Δcrp对氨基糖苷类、碳青霉烯类、环丙沙星、甲氧苄啶、阿奇霉素等药物的敏感性降低,对四环素类药物的敏感性增强,A29Δhfq对除青霉素类、头孢唑啉以外的12种药物的敏感性增强。小鼠毒力试验结果显示,与亲本株的LD_(50)(2.479×10^(4)cfu)相比,A29Δcrp的LD_(50)(5.379×10^(5) cfu)和A29Δhfq的LD_(50)(5.012×106 cfu)均明显上升。各菌株感染小鼠后的临床症状及各组织剖检病变基本一致;组织病理变化观察显示,与亲本株相比,A29Δcrp组小鼠肝组织可见多量大小不一的坏死灶,脾组织红髓面积增大、白髓面积减小,A29Δhfq对小鼠脾脏、肝脏及脑组织损伤均较小。本研究为探究鼠伤寒沙门菌crp和hfq基因功能奠定了基础,同时也为进一步研发鹅沙门菌病疫苗提供了参考依据。

鹅源经典番鸭呼肠孤病毒的分离鉴定及致病性研究

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)近年来在维鹅中的分离率增加,造成了一定的经济损失。本研究从临床上表现出跛行、肝脏和脾脏出现白色点状坏死的雏鹅中采集肝脏和脾脏,采用PCR方法进行MDRV鉴定,对阳性病料经番鸭胚和鹅胚进行病毒分离,并对分离株进行鉴定和σC蛋白基因测序,将分离株对维鹅和雏番鸭进行致病性试验。流行病学调查结果显示:疑似感染MDRV维鹅的病毒阳性率为18.7%,病毒分离率为33%;禽胚分离结果显示,成功分离获得1株鹅源MDRV,命名为846-Goose-CHN-2020株,接种禽胚后,禽胚死亡时间在2~10d;846-Goose-CHN-2020株经禽胚传至第5代时死胚率下降;遗传进化结果显示:846-Goose-CHN-2020株与鸭源MDRV相似为91%~97.2%,与鹅源MDRV(GRV-GD2020)相似为99.8%;致病性结果显示,846-Goose-CHN-2020株对维鹅和维番鸭具有致病性,主要表现为脾脏出现白色坏死点。本研究完善了广东地区鹅源MDRV的流行病学和致病性信息,为鹅源MDRV的研究提供了一定的科学基础。