对虾产品疫病双重荧光RPA方法的建立和初步应用

为实现对虾产品中两种病原体的简便、快速、高效检测,针对对虾传染性皮下及造血器官坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)和虾肝肠胞虫(EHP)进行双重荧光RPA(recombinase polymerase amplification,重组酶聚合酶扩增)检测方法的研究。根据IHHNV和EHP的保守序列设计引物、探针,建立双重荧光RPA方法,同时对方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。结果表明,所建立的方法只对IHHNV和EHP有明显的扩增;用IHHNV和EHP阳性质粒进行倍比稀释检测,结果表明双重荧光RPA方法对IHHNV和EHP质粒检测灵敏度可以达到1×10^(2)copies/μL;用10个重复质粒样本进行检测,结果证明方法重复性较好。使用该方法对进口的冷冻对虾样本检测,检测出1例EHP阳性和1例IHHNV阳性,同时样本用荧光PCR方法进行比对检测,两种方法检测结果一致。本研究中所建立的方法对于两种疫病的区分检测具有重要的临床意义,可应用于养殖场、对虾产品生产企业和口岸实验室疫病的快速筛查。

烧不断的棉线

棉被是用来御寒的。可在炎热的夏季,我们也会看到卖冰棍的商贩把棉被盖在冰柜上。为什么他们要这样做呢?让我们先来做一个简单的实验吧。取三块相同的冰块,分别放在倒扣着的搪瓷碗、陶瓷碗和一块泡沫板的上面,观察冰块融化的情况。

不同生长时期凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病的检出与病原鉴定

随着集约化生产、养殖环境恶化,急性肝胰腺坏死病(AHPND)成为了当前制约对虾养殖效益的主要疾病之一。本试验以凡纳滨对虾不同生长时期的亲虾、虾苗、成虾作为研究对象,将对虾的肝胰腺进行初步富集后,采用荧光PCR和普通PCR的方法,检测样品中pirA VP和pirB VP毒素基因;对虾苗AHPND的病原进行分离鉴定、药敏试验和动物致病性试验。结果显示,在116份样品中检测到亲虾AHPND阳性3份,虾苗AHPND阳性7份,成虾AHPND阳性9份;从虾苗AHPND样品中分离纯化获得1株弧菌,经生化鉴定为副溶血性弧菌;16S rRNA系统发育树分析显示,该分离株与副溶血性弧菌聚为一类。药敏试验结果显示,该分离株对头孢西叮、头孢呋辛、复方新诺明等11种抗菌药敏感,对头孢噻吩耐药,对阿米卡星中介。动物致病性试验结果显示,健康凡纳滨对虾浸染1.8×10^(8) CFU/mL浓度的副溶血性弧菌菌液后,24 h内全部死亡,对虾的肝胰腺小管上皮细胞出现萎缩、变性、坏死等特征。本试验进一步掌握目前粤西地区不同生长时期凡纳滨对虾中AHPND的流行病学数据和病原特征,为该地区乃至全国的对虾养殖业AHPND的预防和控制提供参考依据。

新时代加强高职学生劳动教育的路径研究

新时代高职学生对劳动的认可度较高,但部分学生劳动行为滞后于劳动意识。高职院校需采取多种措施加强学生劳动教育,注重培育学生劳动观念、劳动意识,锻炼其劳动本领、激发其劳动热情,促进高职学生全面发展,为实现中华民族伟大复兴的中国梦贡献力量。

盐干海参的2种核酸提取方法比对及其分子鉴定

目的建立盐干海参的核酸提取及其分子鉴定方法。方法选取5种盐干海参,采用直接处理、洗涤处理和浸泡处理3种处理方式,比较磁珠法和离心柱法两种核酸抽提方式的提取质量,并采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法对提取的核酸进行分析确认。结果同一种抽提方式不同海参处理组间核酸质量没有显著差异,而两种抽提方式间核酸质量差异显著,其中磁珠法提取的核酸得率高、纯度高,而离心柱法提取的核酸得率及纯度均偏低。经PCR扩增验证,磁珠法提取的核酸效果较佳。将扩增产物进行测序及系统进化分析发现5种海参实际种类与标注名称仿刺参存在较大差异。结论盐干海参处理方式对核酸提取结果影响不大,磁珠法提取核酸效果较好,单纯依靠细胞色素c氧化酶亚基I(cytochrome c oxidase subunit I,COI)和16S rRNA基因通用引物并不能对所有的海参种类进行鉴定。

环境DNA方法对进口亲虾携带水中宿主物种的鉴定

为深入了解进口亲虾携带水中物种情况,本试验设计凡纳滨对虾物种特异性引物,采用环境DNA(eDNA)方法对境外进口亲虾携带水进行凡纳滨对虾物种鉴定,分析不同过滤膜、不同样本体积对于获取eDNA浓度的影响;对比不同来源水样、不同过滤膜和样品取样时间等因素对水样中凡纳滨对虾物种鉴定的影响;用宏基因组测序方法对水过滤膜eDNA进行测序分析。结果显示,本试验所设计的凡纳滨对虾物种特异性引物特异性好、灵敏度高,可以有效地从虾体和水中进行凡纳滨对虾物种鉴定;硝酸纤维素膜、玻璃纤维膜均有不同的过滤优势,水样品体积增加,得到的eDNA浓度也随之增加;虾体生存时间、样品取样时间对于宿主物种鉴定均会产生重要影响;宏基因组测序所得的对虾属序列中,凡纳滨对虾的物种序列占40%,物种丰度占比最高。结果表明,eDNA检测方法具有较好的灵敏性和特异性,可以作为监测水生动物携带水外来物种入侵的一个有效手段。

湛江地区凡纳滨对虾肝肠胞虫检出实例分析

对虾肝肠胞虫对我国对虾养殖业具有极大影响,为了解肝肠胞虫感染与养殖水体环境的关系,研究选取了湛江地区凡纳滨对虾养殖场两口高位池和两口低位池,在放苗初期对池塘水体理化因子进行了一周的监测,并采集了不同养殖场的小虾进行肝肠胞虫巢式PCR检测。结果表明,采集的样品均为阳性,水质理化数据在不同养殖模式下具有显著差异,后续还需进行大量的试验调查才能进一步了解肝肠胞虫的流行病学情况。该病与其他疫病综合感染率较高,国内已有多例该病的报道,将该病列入我国动物疫病病种名录并制定相关的检测标准具有重要意义。

船舶压载水的生物入侵分析

船舶压载水的转运和排放是水生生物入侵的重要途径。为保障我国海洋生态和水产养殖安全,文章基于我国航运大国地位,介绍船舶压载水排放带来的生物入侵及其相关国际标准和法律规定,并对我国船舶压载水监管提出建议。研究结果表明:由船舶压载水引起的生物入侵主要包括浮游生物和微生物;目前国际对于船舶压载水排放主要执行D-2标准,很多国家均以法律手段对船舶压载水进行监管;我国在加快船舶压载水立法的同时,应加强基础数据研究、制定统一的规范标准和扩展关注领域。

肝肠胞虫和致AHPND的副溶血弧菌双重荧光PCR方法的建立及在环境DNA样品中的应用

为了快速检测致对虾急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌(VP_(AHPND))和肝肠胞虫(EHP)这2种病原,根据NCBI中副溶血弧菌pirAB^(VP)毒素基因和肝肠胞虫SWP1基因的保守序列设计并合成特异性引物和Taq Man探针,通过优化反应条件,评估方法的特异性、灵敏度、重复性,并且把该方法应用于环境DNA(eDNA)样品检测。结果显示所建立的双重荧光PCR方法特异性强,仅能扩增出V_(PAHPND)和EHP的阳性核酸,与对虾常见病原白斑综合征病毒、传染性皮下和造血器官坏死病毒、十足目虹彩病毒1等均无交叉反应;VP_(AHPND)和EHP的最低检测限分别为14和1.4 copies/μL;组内和组间重复的变异系数均≤1.9%。从56批e DNA样品检测结果发现,VPAHPND阳性7批(12.5%),EHP阳性4批(7.14%),其中VPAHPND-EHP双重感染2批(3.57%)。这表明基于e DNA识别技术,该VPAHPND和EHP双重荧光PCR可以大大提升临床实验室的对虾疫病诊断速度,为海关等监管部门提供可靠高效的快速检测方法。

对虾白斑综合征病毒荧光RPA检测方法的建立和临床应用

为缩短口岸通关检测时限,提高检测灵敏度,本研究对进出口重点监控动物疫病对虾白斑综合征建立重组酶聚合酶扩增荧光RPA方法。根据WSSV病毒基因组特异性序列设计引物探针,优化并建立荧光RPA方法,进行特异性、敏感性、重复性验证。结果显示:所建立的方法对对虾、鱼基因组和其他疫病无扩增,方法特异性高;用10个同样浓度样品做重复性验证,CT值变异系数为3.08%,所有样品扩增曲线均一致;将阳性质粒倍比稀释进行方法灵敏度测试,方法扩增最低浓度为1×10^(1) copies/μL。使用方法进行临床应用,每个样品用荧光PCR方法进行对比验证,结果显示,两种方法检测结果一致,而且弱阳性样品对应CT值相近。该方法的构建和临床应用数据可为口岸防控WSSV疫病提供重要技术参考。

湛江口岸进口冻虾携带病毒检测发现与分析

为了解印度、厄瓜多尔进口冷冻虾病原携带情况,掌握进口冻虾的疫情动态,为监控部门提供科学依据,对2019—2020年中301批进口冻虾进行WSSV、IHHNV、YHV、TSV和IMNV病原体检测,其中印度254批、厄瓜多尔47批。进口冻虾中WSSV的阳性率为23.92%,IHHNV的阳性率5.65%,WSSV和IHHNV共感染阳性率1.66%,而YHV、TSV、IMNV均没有检出。其中来自印度的冻虾中,WSSV阳性率达26.77%,IHHNV阳性率1.97%,WSSV和IHHNV共感染率是1.66%;来自厄瓜多尔的冻虾中,WSSV的阳性率8.5%,IHHNV的阳性率达25.53%,WSSV和IHHNV的共感染率8.5%。根据冻虾的形态分析结果显示,冻虾仁中WSSV的阳性率达25.6%,IHHNV的阳性率1.45%;带头带壳的冻虾中,WSSV的阳性率达20.21%,IHHNV的阳性率达14.99%,WSSV/IHHNV的阳性率是5.32%。结果提示,印度的冻虾主要以感染WSSV为主,厄瓜多尔主要以感染IHHNV为主,带头带壳的冻虾WSSV和IHHNV的阳性率都很高,因此亟须加强对进口冻虾产品的管控力度,防止给我国对虾养殖业造成潜在的传播风险。