NaCl胁迫下pH值和氮素形态对狗牙根生长及钠钾离子调控的影响

以狗牙根〔Cynodon dactylon(Linn.)Pers.〕品种‘阳江’(‘Yangjiang’)为实验材料、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)为pH缓冲剂,采用水培法研究NaCl胁迫下pH值和氮素形态(铵态氮和硝态氮)对狗牙根生长和钠钾离子调控的影响。结果表明:处理1周后,若不添加MES,铵态氮处理组培养液的pH值下降到pH 4.0左右,而硝态氮处理组培养液的pH值则上升到pH 9.0左右;添加20 mmol·L^(-1)MES的铵态氮处理组培养液的pH值也下降到pH 4.0左右,而硝态氮处理组培养液的pH值则接近pH 7.0。与0 mmol·L^(-1)NaCl处理组相比,300 mmol·L^(-1)NaCl处理组狗牙根的枝条长度和枝条干质量显著(P<0.05)下降,而根长度、根干质量、根和叶中Na^(+)含量和Na^(+)/K^(+)比、钠钾选择性转运系数、叶Na^(+)和K^(+)的分泌量及分泌物Na^(+)/K^(+)比总体上显著升高。300 mmol·L^(-1)NaCl胁迫下,硝态氮处理组狗牙根的枝条长度、根长度、根干质量、根冠比、根中Na^(+)含量总体上显著高于铵态氮处理组,而叶中Na^(+)和K^(+)含量及Na^(+)/K^(+)比、叶Na^(+)和K^(+)的分泌量明显低于铵态氮处理组。300 mmol·L^(-1)NaCl胁迫下,20 mmol·L^(-1)MES处理组狗牙根的多数生长指标显著高于0 mmol·L^(-1)MES处理组,而根和叶中Na^(+)和K^(+)含量及Na^(+)/K^(+)比、钠钾选择性转运系数在0和20 mmol·L^(-1)MES处理组间的差异不显著。三因素方差分析结果表明:3个因子的单一和交互作用对多数生长指标、叶中Na^(+)含量和泌盐量相关指标的影响具有统计学意义。研究结果显示:硝态氮能缓解NaCl胁迫对狗牙根的伤害,而用MES缓冲根际酸碱环境对NaCl胁迫下狗牙根生长有一定的促进作用,因此,施用硝态氮或添加MES均有利于提高狗牙根的抗盐性。

拟南芥铵转运蛋白AtAMT1.3的电生理功能

在生理条件下,植物铵的吸收主要由定位于细胞膜上的铵转运蛋白(ammonium transporter,AMT)介导完成,研究模式植物拟南芥AMT的功能特性及调控机制对于解析植物的铵吸收过程具有重要意义。本研究克隆了拟南芥AtAMT1.3并将其在蛙卵异源系统中表达,电生理结果表明,AtAMT1.3是一个典型的对铵有高度选择性、高亲和的铵吸收系统[Km=(25.5±3.2)μmmol/L]。同时,AtAMT1.3也能介导铵的同系物甲基铵的吸收[Km=(3.3±0.2)mmmol/L],对铵和甲基铵的吸收具有浓度依赖性和电压依赖性。AtAMT1.3的铵转运能力不受p H值调控,它的转运底物是NH_4^+,运输机制是NH4+单向运输。

杜梨铵转运蛋白基因的克隆表达及在梨属植物中的SNP分析

利用EST并结合RACE方法从杜梨幼苗克隆获得1个AMT基因(PbAMT1;2).分析显示,PbAMT1;2cDNA全长1 811 bp,开放阅读框为1 515 bp,其对应基因组DNA序列不含内含子.PbAMT1;2编码的蛋白由504个氨基酸组成,具有11个跨膜域,1个N-糖基化位点、3个酪蛋白激酶磷酸化位点和8个蛋白激酶C磷酸化位点.同源性分析发现,PbAMT1;2与其他植物的AMT具有较高的一致性,其中与百脉根LjAMT1;2的一致性为80.23%,与拟南芥AtAMT1;2的一致性为78.68%,与番茄LeAMT1;2的一致性为77.80%.系统进化树分析表明,PbAMT1;2属于AMT1亚家族.半定量RT-PCR结果显示,PbAMT1;2主要在根部表达,而在茎和叶中几乎没有表达.以杜梨、豆梨、砂梨、白梨、秋子梨和西洋梨等6种梨属植物的DNA为模板,高保真Taq酶PCR扩增AMT1;2基因ORF区DNA序列,发现6种梨属植物的AMT1;2 ORF区DNA序列长度均为1 515 bp,相似性高达99.48%,但在44个核苷酸位点中存在SNPs,导致18个氨基酸位点发生变异,多态性频率为1SNP/34.43 bp,核苷酸变异度为2.9%,氨基酸变异度为3.57%.

葡萄AMT基因家族生物信息学分析

运用隐马尔柯夫模型,对葡萄的蛋白质数据库进行搜索,共找到12个AMT蛋白同源序列。利用生物信息学方法对葡萄12个AMT基因进行染色体定位,进而预测它们的氨基酸组成成分、理化性质以及二级结构,并分析葡萄与拟南芥、水稻和杨树AMT基因家族之间的联系。基因组定位结果发现12个AMT基因分布在6条染色体上,较拟南芥AMT基因在染色体上的分布更为集中。12个葡萄AMT蛋白序列可分成2个亚族,AMT1亚族有3个成员,其余为AMT2亚族成员。研究中发现不同成员间氨基酸数目、氨基酸序列间的疏水性存在一定的差异;二级结构预测结果显示,12个AMT氨基酸序列以α-螺旋和无规则卷曲为主要组成部分。基因结构分析表明,仅有2个葡萄AMT基因家族成员不含内含子,其余10个AMT基因含有1～4个内含子。对葡萄AMT蛋白的亚细胞定位分析表明:12个VvAMT均定位于膜结构上。对获得的12个葡萄AMT基因进行EST分析,只有5个有对应的EST序列,而仅有2个有相应的电子表达谱。

水稻OsKAT2基因的克隆及表达分析

为获得抵抗逆境胁迫的相关基因,利用电子克隆方法从水稻中获得了1个新基因,将其命名为OsKAT2(GenBank登陆号为KJ010541)。生物信息学分析结果表明OsKAT2的cDNA序列开放阅读框长1 806 bp,编码蛋白质由601个氨基酸组成;OsKAT2蛋白质包含K+通道的保守结构域,属于Shaker家族第II组。通过实时定量荧光PCR分析发现,OsKAT2主要在地上部表达;在干旱、高盐和外源脱落酸(ABA)胁迫处理下,水稻地上部OsKAT2的表达量均降低。初步推测OsKAT2可能在水稻抵抗逆境胁迫中发挥作用,是一个水稻抗非生物逆境改良的候选基因。

利用异源酵母功能互补法研究水稻铵转运体OsAMT1;1功能及调控机制

水稻是一种以铵态氮为主要氮素营养的重要粮食作物,存在至少12个铵转运体,对水稻铵的吸收起着至关重要的作用,其中,水稻铵转运体1;1(Oryza sativa ammonium transporter1;1,Os AMT1;1)是一个在根部和地上部相对组成型表达的基因。通过异源酵母功能互补法研究水稻铵转运体Os AMT1;1的功能及其调控机制,结果表明,Os AMT1;1是一个功能型的铵转运体,和铵的同系物甲基铵(Methylammonium,Me A+)相比,Os AMT1;1对铵具有相对较高的选择性;Os AMT1;1介导铵的吸收不依赖于外界质子,转运的底物可能是铵离子;Os AMT1;1介导吸收铵的过程是一个依赖能量的主动运输过程,对铵的吸收可能不受钙离子参与的磷酸化过程调控。

OsAKT2/3基因的生物信息学分析

Shaker类型K+通道在植物钾的吸收、转运及其他生理过程中发挥着重要作用。AKT2/3是Shaker类型K+通道中唯一既主导K+内流,又允许去极化情况下K+渗漏性外流的通道。水稻Os AKT2/3蛋白的生物信息学分析表明,Os AKT2/3蛋白含有K+通道的标志性序列Txx Tx GYGD;该基因分子式为C4219H6693N1179O1233S35,理论等电点为6.64,氨基酸残基组成中亮氨酸残基含量最高;有一定的亲水性,为跨膜蛋白;可能存在31个翻译后修饰位点、5种结构域、52个磷酸化位点,不含信号肽;序列主要构件为α-螺旋和折叠延伸;该蛋白与其他植物的AKT2/3家族成员具有较高的同源性。试验结果为Os AKT2/3基因生理功能的深入研究提供一定依据。

空心莲子草铵转运体ApAMT1;3基因的克隆及功能鉴定

近年来,空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)因其对水体富营养化尤其是水体铵积累有潜在的修复能力而受到人们的关注。然而,目前对空心莲子草吸铵的分子生物学研究甚少。本研究利用简并引物和RACE技术分离了一条铵转运体cDNA,命名为ApAMT1;3;实时定量结果表明,ApAMT1;3主要在地上部表达,缺铵处理显著增强了ApAMT1;3在根、茎及叶部的表达水平;酵母功能互补试验表明,ApAMT1;3是一个功能型的铵转运体。本研究结果为研究空心莲子草NH4+的吸收和利用提供了新的基因资源,同时也为研究水生植物NH4+的吸收转运及调控机制奠定了分子生物学基础。

水稻钾素营养的基因型特征及分子机制初探

理解水稻(Oryza sativa)的钾素营养特征是提高水稻的钾素利用效率及其生产效应的重要环节。本文针对土壤钾素供应的时空非均匀性,采用水培和分根模拟试验,研究了日本晴(NB)、武育粳18(WYJ18)、南光(NG)及桂单4号(GD4)4个水稻基因型品种的钾素营养特征。结果表明:低钾(0.1 mmol/L K^(+))或高钾(5 mmol/L K^(+))条件均会显著抑制水稻的生长。与高钾条件相比,NB和GD4在低钾及正常供钾(1 mmol/L K^(+))水平下即可保持较高的生物量,推测NB和GD4有更强的钾吸收及转运能力。分根供钾试验表明,4种基因型水稻缺钾一侧的根长和根表面积均受到诱导,而地上部生物量与全根供钾时没有明显差异,说明局部根系供钾即可满足水稻生长需求。进而以NB为材料,通过实时荧光定量PCR,发现水稻根内钾转运基因OsKAT1;1主要定位于根部,且受高钾和低钾抑制,地上部钾分配基因OsAKT2/3主要定位于地上部且受高钾诱导,根–茎钾传输系统OsSKOR基因主要定位于距根尖大于1.5 cm的成熟区,且在根部的表达丰度受低钾诱导;水稻伤流试验结果表明,低钾条件下伤流液的强度和组分与根–茎传输基因OsSKOR的表达特征有较好的吻合度,推测OsSKOR基因可能在根–茎钾转运过程中发挥重要作用。

利用gs1.1和gs1.2突变体研究外源蔗糖对高铵胁迫拟南芥碳氮代谢的影响

以拟南芥野生型Col-0、谷氨酰胺合成酶敲除突变体gs1.1和gs1.2为实验材料,采取土培试验,比较正常培养液(4 mmol/L NH4^(+))培养(CK)、正常培养液(4 mmol/L NH4^(+))下外源添加5%蔗糖(T1)、高NH4^(+)胁迫(20 mmol/L)(T2)以及高NH4^(+)胁迫(20 mmol/L)下外源添加5%蔗糖(T3)对拟南芥各株系各生理指标的影响;通过测定地上部分的鲜重、叶绿素、游离NH4^(+)、可溶性糖、可溶性蛋白、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、矿质元素含量等指标,研究外源蔗糖对NH4^(+)胁迫拟南芥碳氮代谢的影响。结果表明,高NH4^(+)胁迫下,拟南芥生长受到严重的抑制,鲜重、GS、GDH酶活性降低,游离NH4^(+)含量、叶绿素含量、可溶性糖和可溶性蛋白含量增加,植株的N、P、K、Ca的含量增加,Mg、Fe的含量减少,其中gs1.1和gs1.2在高NH4^(+)处理下受到的抑制比Col-0更为显著。外源添加5%蔗糖显著缓解了高NH4^(+)毒害,提高了可溶性糖和可溶性蛋白含量,提高了GS和GDH的活性,降低了叶绿素和游离NH4^(+)的含量,提高了植株体内的N、P、K、Ca,Mg的含量,降低了植株Fe的含量,其中,外源蔗糖对gs1.1和gs1.2高NH4^(+)毒害的缓解更为显著。

光氮互作对拟南芥col-0和CS3721512突变体碳、氮代谢的影响

[目的]本文旨在了解光氮互作对拟南芥碳、氮代谢的影响。[方法]以野生型拟南芥col-0和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS1;1)的T-DNA插入突变体CS3721512为材料,采用水培方法,设置2种光照强度(正常和50%遮阳网遮阳处理)和2种NH_4^+水平(2和20 mmol·L-1NH4Cl),测定拟南芥鲜质量,分析叶绿素a含量、叶绿素b含量、叶绿素总量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、总N量和谷氨酰胺合成酶(GS)与谷氨酸脱氢酶(GDH)活性等生理指标。[结果]正常光照下,增加NH_4^+浓度,植株的鲜质量减少,而叶绿素a与叶绿素b含量增加,可溶性蛋白和可溶性糖含量增加,游离铵含量与总N量增加,GS和GDH活性升高;与col-0相比,CS3721512对高NH_4^+更为敏感,铵同化能力受到抑制,植株的长势更弱。弱光胁迫下,拟南芥的鲜质量下降,叶绿素a含量和叶绿素总量降低,可溶性糖和可溶性蛋白含量减少,游离铵含量与总N量降低,GS和GDH活性降低。弱光胁迫下增加NH_4^+浓度,可以增加拟南芥鲜质量、叶绿素a含量、游离铵含量和植株总N量,提高叶片中GS和GDH活性。[结论]光、氮及其互作对拟南芥的碳、氮代谢有影响,弱光胁迫条件下增加NH_4^+浓度可以增加叶片叶绿素含量,在一定程度上缓解弱光对植株的生长胁迫。与col-0相比,弱光下增加NH_4^+浓度,对CS3721512的生长更为有利。

外源蔗糖对高NH4^+胁迫下拟南芥碳氮代谢的影响

以拟南芥col-0、amt1.1和amt1.3为试验材料,采取基质培养的方法,以常规营养液(4 mmol/L NH4+)处理为对照,设置高NH4+(20 mmol/L)营养液中分别添加0%蔗糖(T1)、5%蔗糖(T2)处理,通过测定植株地上部分的鲜重,叶绿素、游离NH4+、可溶性糖、可溶性蛋白、矿质元素含量及谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸脱氢酶(GDH)酶活性等指标,研究外源蔗糖对NH4+胁迫拟南芥碳氮代谢的影响。结果表明:与CK相比,T1处理下,3个拟南芥株系植株生长均受到严重的抑制。鲜重及GS、GDH活性降低,游离NH4+、叶绿素、可溶性糖和可溶性蛋白含量增加;植株的氮、磷、钾、钙含量增加,镁、铁含量减少。其中col-0植株在T1处理下受到的抑制比amt1.1和amt1.3植株更为显著。与T1处理相比,T2处理增加了拟南芥植株的鲜重,显著提高了可溶性糖和可溶性蛋白含量,提高了GS和GDH活性;降低了叶绿素和游离NH4+的含量,提高了植株的氮、磷、钾、钙、镁含量,降低了植株铁含量,其中,外源蔗糖对col-0植株高NH4+毒害的缓解较两个突变体植株更为显著。

NaCl胁迫下不同耐盐型结缕草根系Ca^(2+)和H^(+)流动及Ca^(2+)分布特征

以耐盐结缕草(Zoysia japonica Steud.)Z011和Z015和敏盐结缕草Z004和Z103为试验材料,利用非损伤微测技术和X射线能谱仪对结缕草在NaCl胁迫(200 mmol·L-1 NaCl)下不同根区Ca^(2+)、H+流的变化以及Ca^(2+)在根系的分布情况进行了分析。结果表明:在对照条件下,4个结缕草材料根尖分生区、伸长区和成熟区Ca^(2+)以外排为主,其中分生区的平均Ca^(2+)流速明显高于伸长区和成熟区,且耐盐结缕草分生区的平均Ca^(2+)流速明显高于敏盐结缕草;NaCl胁迫后,总体上看,耐盐结缕草3个根区的Ca^(2+)由外排变为内流,而敏盐结缕草仅根尖成熟区的Ca^(2+)由外排变为内流,耐盐结缕草较敏盐结缕草有更多的Ca^(2+)内流参与离子调控。耐盐结缕草Z011与其他3个材料的H+流有明显区别,在对照条件下,Z0113个根区的H+均为内流,而其他3个材料3个根区的H+为微弱内流或外排,且其平均H+流速明显低于Z011;NaCl胁迫后,Z0113个根区H+内流明显减弱,而其他3个材料3个根区H+的内流或外排也减弱,但差异不明显。扫描结果显示:总体上看,NaCl胁迫后,4个结缕草材料根系表皮、皮层和中柱中Ca^(2+)相对含量显著降低,且随着处理时间的延长表现为先降低再升高的趋势;同一材料根系表皮、皮层和中柱间的Ca^(2+)相对含量存在差异,但区隔作用不明显。综合分析结果表明:耐盐结缕草有更强的Ca^(2+)调控能力,分生区为Ca^(2+)参与NaCl胁迫下离子平衡的关键调控区域,结缕草根系对Ca^(2+)没有区隔作用或区隔不明显。另外,耐盐结缕草Z011可能具有不同于其他3个材料的H+调控机制。

豆梨铵转运蛋白基因PcAMT1-1和PcAMT1-2的克隆与功能鉴定

为探明豆梨(Pyrus calleryana Dcne.)铵转运蛋白基因家族成员的序列特征、生理功能和表达特点,以豆梨幼苗为材料,运用电子克隆与3′-RACE技术获得2个铵转运蛋白基因PcAMT1-1和PcAMT1-2,采用酵母互补和半定量RT-PCR方法研究它们的生理功能与表达特点。结果表明:PcAMT1-1和PcAMT1-2开放阅读框为1 518 bp和1 515 bp,编码的蛋白分别含505和504个氨基酸残基。PcAMT1-1和PcAMT1-2分别与甜橙×枳后代CpAMT(ABI52423)和茶CsAMT1;2(AB114913)的同源性最高(81.96%和78.31%)。PcAMT1-1和PcAMT1-2转入酵母均能使铵转运体缺失突变菌株31019b恢复NH4+吸收能力,在酸性条件下(pH 4.8或5.8)PcAMT1-1和PcAMT1-2对31019b的互补效果均优于中性条件(pH 6.8)。NH4+有毒类似物MeA+可以显著抑制转PcAMT1-1酵母31019b的生长,该物质对转PcAMT1-2酵母31019b无抑制效果;谷氨酰胺合成酶抑制剂MSX可有效抑制PcAMT1-2对酵母31019b的互补效果,对PcAMT1-1的互补效果无显著影响。正常供铵,PcAMT1-1主要在叶中表达,PcAMT1-2主要在根中表达;无氮处理后,PcAMT1-1和PcAMT1-2在根中的表达先上调后下降;重新供铵后,它们的表达量恢复;地上部的表达对上述处理无显著响应。综上所述,PcAMT1-1和PcAMT1-2在豆梨中具有吸收或转运NH4+的功能,并可能具备不同的调控机制。