基于黏虫转录组的几丁质酶基因筛选和表达分析

昆虫的几丁质酶对昆虫的生长发育致关重要,是生物农药的重要靶标。本研究使用高通量测序技术对迁飞性害虫黏虫Mythimna separata的中肠和表皮组织进行了转录组测序、序列组装、功能注释及差异表达基因分析。对转录组数据库中鉴定出的几丁质酶基因进行了理化性质的预测,包括cDNA长度、蛋白质分子量、氨基酸序列、等电点、不稳定系数、跨膜结构和蛋白结构域等。使用MEGA软件构建了黏虫和其他昆虫几丁质酶的系统进化树,并通过q-PCR验证了黏虫基因在不同组织和发育阶段的表达模式。通过中肠与表皮的转录组测序,获得了19.42 Gb的数据,在COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swissprot、eggNOG、nr数据库注释到了25236个Unigene;基因表达分析结果表明,中肠和表皮的差异表达基因共有3137个,其中中肠高表达基因有1872个,表皮高表达基因有1265个。从转录组数据中鉴定出9个几丁质酶基因,其中7个是新的几丁质酶基因,这些基因的cDNA长度在1362~9816 bp,SMART结构预测表明几丁质酶含有1个或多个催化结构域。构建的系统进化树将昆虫几丁质酶基因分为9个亚家族。q-PCR结果表明MsCht2、MsCht5、MsCht6、MsCht7、MsIDGF1在表皮中表达量较高,MsCht4、MsCht11和MsChi-H在中肠中表达量较高,与转录组数据一致;多数几丁质酶基因在蛹期或预蛹期表达量最高,而MsCht4在5龄期表达量最高,在蛹期表达量很低。黏虫几丁质酶基因表达上存在不同的差异,不同的几丁质酶基因可能具有不同的功能。本研究筛选出了7个新的几丁质酶基因,为黏虫的生物防治提供了新的靶标。研究结果为进一步研究黏虫几丁质酶的功能奠定了基础。

转双价抗虫基因BmkIT-Chitinase玉米株系的获得

通过超声波辅助花粉介导法,将双价抗虫基因BmkIT-Chitinase分别导入以玉米自交系昌7-2及郑58的花粉为受体的不同基因型的自交系中。本研究共处理玉米雌穗1072穗,获得T0代种子1563粒,经卡那霉素初筛,T1代～T4代PCR及SouthernBlot杂交分子跟踪检测共获得20个转化株系,田间抗虫性鉴定表明共有16个转化株系与对照在抗虫性方面有显著差异,且此抗性随着各代稳定遗传。农艺性状调查结果表明,所获得的转基因玉米株系中大部分材料的农艺性状与对照无显著差异,除了N55材料及N20-1材料。N55材料的穗位高度与对照相比略低6±0.5cm,而穗粒数增加75±5粒。而N20-1材料百粒重增加5±0.5g。因此,转入此双价抗虫基因对玉米农艺性状影响不是很大。经过分子检测、田间抗虫性鉴定及农艺性状调查我们最终选育了9个转双价抗虫基因昌7-2自交系优良株系,6个郑58转双价抗虫基因自交系优良株系。

玉米自交系花粉生活力的研究

试验以玉米自交系478为材料,研究了不同温度,培养基中不同蔗糖浓度,GA3和硼酸等因子对玉米自交系花粉萌发的影响,以及超声波处理后花粉萌发情况.结果表明:24～27℃温度条件最适于玉米花粉萌发,15%蔗糖时花粉的萌发率最高,25～50 mg/L硼酸和40mg/L GA3对花粉的萌发有较好的促进作用.随着超声波处理强度的加大,花粉的萌发率也在降低.

微波预处理对小麦萌发及幼苗生长的影响

以冬小麦93-4736为材料,采用2 450 MHz频率下,不同功率及时间的微波对种子进行预处理,比较了不同处理对小麦种子萌发及幼苗生长的影响,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析了不同处理组幼苗叶片中过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)同工酶酶谱的变化情况。结果表明,微波预处理不仅有短期效应(影响了种子萌发),还表现出长期效应(对幼苗生长、生化代谢及生物量的积累产生影响)。低功率(30%)预处理对种子萌发起促进作用,其中,50 s处理组显著优于对照组(P<0.05);高功率(50%～80%)则起抑制作用,且抑制作用随微波功率及处理时间的增加而增强,80%功率处理50 s,种子完全失去萌发能力。30%功率预处理提高了小麦幼苗叶片POD,SOD同工酶的活性,其中,50 s处理组的酶活性最高;50%和80%功率抑制了SOD和POD的活性,抑制作用随功率和时间的增加而增强,在80%功率下预处理50 s时,POD同工酶基因的表达受到显著抑制(有2条酶带消失)。同时,30%功率预处理30,50 s时,显著提高了幼苗株高及生物量(P<0.05);80%功率及50%功率预处理50 s,使株高及生物量显著降低(P<0.05)。这为阐明微波对生物体的作用机制及微波辐射在农业上的应用提供了一定的理论依据。

Dicamba对高粱成熟胚愈伤组织诱导及继代的影响

【目的】高粱是遗传转化最困难的作物之一,主要原因是由于高粱组织培养愈伤诱导及再生频率较低,高效再生体系建立比较困难,研究并使用新的植物诱导激素是改变这一困境的重要手段。【方法】以4个基因型的高粱种子(成熟胚)为外植体,高粱组织培养常用的诱导激素2,4-D为对照,研究Dicamba对高粱愈伤组织诱导、继代及愈伤组织再生质量的影响,经过统计分析,建立并优化高粱组培再生体系。【结果】高粱各基因型在不同浓度Dicamba的诱导培养基上出愈率在24.7%~90.7%,不同浓度的2,4-D诱导培养基上,出愈率为72.5%~90.5%,最高出愈率为88BP28,在Dicamb 7.5 mg·L^(-1)达到90.7%,2,4-D在2.5 mg·L^(-1)时达到90.5%;继代培养与初代诱导培养比较,各基因型材料的褐变率均随着继代次数的增加而增加。Is-623在继代培养中,Ⅰ型愈伤组织向Ⅱ型和Ⅲ型愈伤组织转变的E值最高,达到20.1%;4种基因型以5 mg·L^(-1)Dicamba诱导的Is-623胚性愈伤率最高,达20.7%;不同处理中,所有基因型材料U值均在60%~100%。【结论】利用Dicamba对高粱成熟胚进行初代愈伤组织诱导,出愈率与2,4-D诱导差异不显著,在继代培养及胚性愈伤组织分化试验中,Dicamba作为激素更有利于Ⅱ型愈伤组织及胚性愈伤组织的形成,其效果优于2,4-D;高粱成熟胚诱导愈伤组织及胚性愈伤组织的发生受基因型影响较大,材料Is-623在Dicamba 5 mg·L^(-1)时比其它材料的胚性愈伤发生率高,且褐化率及死亡率均较低;证实了高粱成熟胚胚性愈伤组织的形成绝大多数来自Ⅱ型愈伤组织。

农杆菌介导高粱成熟胚遗传转化获得耐草甘膦植株

利用萌动的成熟胚作外植体进行基因转化,可有效提高高粱转基因材料选育的效率。为了建立并完善以高粱萌动种胚作为外植体的遗传转化体系,本研究以高粱材料Is-623为转化受体,质粒pM3301UbiSpCP4为外源基因供体,采用农杆菌介导法进行遗传转化,并对转化的关键因素进行分析。结果表明,麦草畏(dicamba)诱导高粱萌动的成熟胚产生愈伤组织适宜浓度约为5 mg·L-1;农杆菌侵染时间为2 h时遗传转化效率较高;经筛选共获得301块抗性愈伤组织,75个转化事件,经PCR、Southern blotting杂交分析、CP4-EPSPS蛋白检测试纸条检测及田间草甘膦耐性鉴定,最终获得草甘膦耐性等级1级株系6株,耐性等级2级株系3株的转基因高粱株系。本研究初步建立了以高粱萌动种胚作为外植体的遗传转化体系,为高粱遗传转化体系的研究和应用奠定了基础。

转水稻OsSIK1基因玉米植株的获得及抗旱性分析

类受体激酶基因Os SIK1具有通过激活抗氧化系统,增强水稻对于干旱和盐胁迫抗性的作用。为了丰富可利用的作物抗旱基因,获得具有较高抗旱水平的玉米新种质,通过超声波辅助花粉介导法,将水稻类受体激酶基因Os SIK1导入玉米自交系郑58中,并对转化株进行卡那霉素筛选及T1、T2、T3的PCR及Southern Blotting杂交等分子检测,获得转化植株并在T3获得转基因纯合株系。对T3转基因玉米和非转基因玉米对照以16.1%的PEG模拟水分胁迫进行抗旱性分析。结果表明,与对照相比,在水分胁迫处理下,转基因玉米株系叶片相对含水量提高了7.4%-19.8%,叶绿素含量提高了11.3%-106.9%,SOD活性上升45.8%-93.4%,而转基因玉米叶片的相对电导率下降了35.4%-58.1%,MDA含量下降了25.7%-50.4%,说明转Os SIK1基因玉米植株抗旱性得到提高,其中,5个转化株系与对照在抗旱性方面有显著差异,且生长状况明显优于对照。综上所述,研究最终获得5个转Os SIK1基因玉米株系,并证明导入水稻Os SIK1基因可以提高玉米植株的抗旱性。

转BADH基因玉米植株的获得及其耐盐性分析

采用超声波辅助花粉介导植物转基因方法,将甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因导入玉米自交系郑58,获得了耐盐性强的转基因玉米植株。经卡那霉素抗性初筛、PCR扩增、Southern blot分析,证明BADH基因已导入转化植株并整合到其基因组中。用不同浓度的NaCl溶液对T2代转基因玉米植株与对照进行盐胁迫处理,结果表明,转BADH基因玉米植株表现出一定的抗逆性,生长状况明显优于对照；根据非转化苗对 NaCl 的反应以及生长状况,确定250 mmol L^–1 NaCl溶液为玉米幼苗耐盐性筛选的适宜浓度；依据此临界浓度下形态指标和生理生化指标的测定结果,与对照相比,转基因植株的株高提高10.94%-25.70%,鲜重增加8.62%-18.20%,干重增加9.00%-18.18%,相对电导率降低37.21%-58.14%,叶绿素含量增加15.89%-90.65%,超氧化物歧化酶（SOD）活性提高64.92%-148.29%,丙二醛（MDA）含量减少26.97%-48.05%。综上所述,转入甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因提高了玉米的耐盐性。这是首例将BADH基因导入优良玉米自交系郑58的报道。超声波辅助花粉介导法是一种经济、高效、实用和无基因型依赖性的植物基因转化方法。

转水稻NibT基因玉米植株的获得及抗病性研究

以玉米（Zea maysL.）自交系金黄96B为受体材料,供体为质粒pWM101并携带有水稻矮缩病病毒复制酶基因Nib的提前终止突变体基因NibT,采用超声波处理花粉介导植物基因转化方法将NibT-基因导入受体,经PCR检测和Southern杂交分析证实获得转基因植株,进而对T1－T3代转基因植株（株系）进行分子分析、田间抗病鉴定和农艺性状调查.逐代分子检测分析结果证明,目的基因可稳定遗传.抗病鉴定结果证明转基因植株（株系）各代抗病水平基本一致,抗病性比对照提高3级.农艺性状调查分析表明,与对照比较,转基因植株株高增加7－18cm、穗位高增高0－13 cm、穗长增加0.7－2.1 cm、穗粒数多8－35粒、百粒重增加1.1－2.6 g,转基因株系与阴性对照间、各代转基因株系相互间都差异显著（P〈0.05）;调查还发现转基因植株的株高和穗位高随着世代的增加,与对照间的差异逐代减少.研究也说明,超声波处理花粉介导植物基因转化方法是一种简捷、快速和有效的植物转化工具.

导入TaNHX2基因提高了转基因普那菊苣的耐盐性

我国部分地区土地盐碱化的日益严重,对作物的生长和生态环境产生了显著影响,因此通过植物基因工程手段培育耐盐碱的转基因作物品种对改善作物的生存能力和生态环境,提高作物产量具有重要的意义。采用农杆菌介导法将来自小麦(Triticum aestivum Linn)的Na+/H+逆向转运蛋白的基因(vacuolar Na+/H+exchanger or antiporter,简称NHX、NHE或NHA),对普那菊苣(Cichorium intybus L.cv.Puna)植株进行了遗传转化。经抗生素筛选以及针对TaNHX2基因的PCR检测和Southern杂交分析,证明获得了28株转TaNHX2基因的普那菊苣植株。用不同浓度NaCl溶液对普那菊苣野生型和T0代种子、愈伤组织和幼苗生长情况胁迫的研究,结果表明:转TaNHX2基因普那菊苣植株表现出一定的抗性,比野生型明显提高。在300 mmol/LNaCl胁迫下转基因植株种子的出芽率、外植体出愈率和分化率是野生型植株的2—4倍,而500 mmol/L NaCl浓度为野生型和转基因外植体能否生长的临界点。在此临界值下野生型外植体或不能形成愈伤组织、或幼苗不能正常生根、或已生根幼苗不能正常成长,而转基因外植体可以继续形成愈伤组织并正常生根生长。同时对500 mmol/L NaCl胁迫下野生型和转基因普那菊苣幼苗其体内丙二醛含量(MDA)、过氧化氢酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性进行测定,结果表明转基因植株比野生型植株的MDA含量降低了1—3倍,POD活性提高了1—3倍,SOD活性提高了2—3倍,分析发现普那菊苣的耐盐性与其体内的丙二醛含量(MDA)、过氧化氢酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性密切相关。

非组培转化法获得转基因植株及其Basta耐受性研究

以玉米‘昌7-2’、大豆‘晋遗19’和高粱‘晋粱5号’的种子为受体,质粒pCAMBAR.CHI.11为供体,采用非组培转化法导入bar基因。PCR扩增和Southern杂交分析结果证明,‘昌7-2’、‘晋遗19’和‘晋粱5号’的划胚种子都获得了转化植株,转化率均在5%以上,未划胚种子的转化率为0。共培养液中加入浓度为200μmol/L的乙酰丁香酮(AS)能使玉米种子转化率比对照提高8倍,赋予300W强度的超声波处理,转化率可再提高60%。划胚处理对种子的出苗率影响较大,为17%左右。划胚种子于实验室条件下的Basta耐受试验结果表明,不同作物对Basta的耐受性存在差异,玉米、大豆和高粱转bar基因植株的Basta耐受临界值分别为0.15%、0.1%和0.05%,Basta处理后的幼苗成活率在各作物间差异不大。田间喷雾Basta溶液结果证明,按Basta耐受性大小排列顺序为高粱<大豆<玉米,但按对Basta敏感性的排序为大豆<高粱<玉米。不同生育期喷雾除草剂的实验结果(T2)证明,在生育期后期作物植株对除草剂的敏感性比前期有所降低,生长前期喷雾后玉米、大豆和高粱的苗存活率分别为57%、49%和52%,生长后期喷雾后苗存活率分别为77%、70%和73%,但各个群体的PCR扩增阳性结果率均在80%以上,证明存活率差异是由植株对除草剂耐受性和敏感性的差异引起的。多代转基因植株的检测结果证明目的基因可稳定遗传。

我国转基因主粮作物产业化进展、存在问题及对策

目前,我国转基因产业化种植面积较大的作物只有棉花、木瓜等。主粮作物水稻、玉米的一些转基因品种虽已获安全证书将近7年,但至今尚未进行产业化生产。另一方面,我国每年进口大量的玉米、大豆等农产品,且进口的玉米和大豆中转基因产品占比较高。这是由于一方面国内有关转基因的舆论氛围以及我国目前就转基因作物的研发现状均要求推进转基因主粮作物产业化进程时要稳重、谨慎;另一方面,转基因作物产业化的全球发展趋势、增产潜力、经济和环境效益以及我国在该技术领域的基本策略和国内供需需求,又迫使我们要加快开展转基因主粮作物产业化的进程。如何化解这对矛盾使转基因主粮作物的研发和产业化在适合国情的前提下顺利开展,是目前的主要任务之一,因此有必要就有关转基因作物产业化在我国的发展现状、前景、存在问题和对策予以讨论,以期为我国转基因作物产业化提供参考。

4个玉米自交系的耐密性研究

以玉米Lancaster衍生系H 1265、H 1475和Reid衍生系H 12166、H 14141等4个自选玉米自交系为试验材料,通过不同密度下茎杆硬皮穿刺强度、产量及其构成因素、水分、容重、株高、穗位高、叶向值的变化及相关性分析,对自交系的耐密性进行了初探。结果表明:种植密度为7.5万~10.5万株/hm2时,H 12166和H 1265茎杆硬皮穿刺强度、产量、穗长、行粒数、单株产量、容重均降低,秃尖严重,籽粒含水量、株高、穗位高增加,说明H 12166和H 1265耐密性较差。H 1475随密度升高茎杆强度降幅小,产量、单株产量、容重、叶向值先升高后降低,在密度9万株/hm2时达到最高值;穗长、行粒数在密度为7.5万~9万株/hm2时变化幅度小,秃尖无变化,当密度增加至10.5万株/hm2时,穗长及行粒数显著减少,秃尖长增加显著,说明H 1475耐密性较好,其适宜种植密度为9万株/hm2。H 14141茎杆强度大,产量高,秃尖小,穗位适中,随着种植密度的增加,产量一直呈增加趋势,茎杆强度、株高及穗位高变化小,叶向值增大,耐密性强。

基因编辑系统CRISPR/Cas9在作物基因工程育种中的应用

作为传统基因工程育种技术,转基因技术在作物分子育种工作中由于其自身的技术原因存在一定的局限性。而基因编辑技术的出现为作物的遗传改良和基因功能的研究提供了新的思路与途径,目前,应用最为广泛的基因编辑技术是CRISPR/Cas9系统,其主要由sgRNA和Cas9蛋白组成,Cas9蛋白在sgRNA的引导下对目标基因进行编辑。简要介绍了基因编辑技术的发展历程以及CRISPR/Cas9系统的结构组成、工作机制、技术优势及其在作物基因工程育种中的应用进展,这可为开展这一领域工作的研究提供有益参考。

超声波辅助花粉介导转基因方法的研究进展

超声波辅助花粉介导植物转基因方法是拥有国内自主知识产权的植物转化手段,该方法在玉米、油菜、花生等作物上的转化研究均取得积极进展。为较详尽了解国内外应用该方法进行植物转化研究的现状,针对该方法与其他植物转化方法比较所体现出的优势以及存在的问题进行了总结,以期为相关研究者提供一些参考资料,并为该方法的进一步改进完善提供依据。

可视安全标记花青素合成途径相关基因在植物转化研究中的应用进展

近年来有关转基因产品可能带来的环境和食品安全问题的争论多集中在作为标记基因的抗生素抗性基因以及抗除草剂基因的广泛使用。因此寻找安全、有效的标记基因替代上述有争议标记基因就显得十分必要和紧迫。花青素合成酶类及其合成调控因子可以控制植物体内的色素合成,一些转化研究已证明其转化体表型发生了颜色改变。加之花青素类物质是一些天然色素,对人类有利而无害,可以利用花青素的这些特点,将花青素合成酶类及其调控因子基因作为一类可视化、安全和有效的标记基因来转化植物。本文就可视安全标记花青素合成酶类基因及其调控基因在植物转化研究中的应用进展进行了简要介绍,以期为提高标记基因的安全性提供参考。

玉米茎腐(青枯)病研究进展

玉米茎腐(青枯)病不仅在我国广泛发生,也是世界性的玉米病害,严重影响全球玉米的总产量以及种子品质。简要概述了该病的发生与危害,致病菌及发病成因和相应栽培措施;通过对已有的玉米抗病鉴定方法及病原菌鉴定方法总结分析,认为抗病育种与抗性鉴定之间存在一定的关联不够问题;着重介绍了玉米种质资源的筛选,玉米对茎腐(青枯)病抗性遗传规律和分子生物学领域的研究进展;并且对玉米茎腐(青枯)病的研究方向提出了一些参考建议。

大蒜半胱氨酸合成酶的mRNA表达及生物信息学分析

半胱氨酸合成酶的产物半胱氨酸是植物中含硫氨基酸的重要来源,大蒜中含硫氨基酸丰富,研究大蒜半胱氨酸合成酶的性质及生物学功能以明确其在大蒜硫代谢中的作用。利用生物信息学技术分析从NCBI数据库中获得的3个大蒜的半胱氨酸合成酶基因(AsGCS2、AsGCS3和AsGCS4)的开放阅读框,预测其蛋白序列、分子量大小、蛋白质特性、亚细胞定位、系统进化等特征;通过荧光定量PCR分析了3个半胱氨酸合成酶的组织表达特性。结果显示,AsGCS2、AsGCS3和AsGCS4的开放态读码框长度分别为1 152 bp、1 296 bp和1 236 bp;其编码蛋白的理论相对分子量分别为40.6 k D、34.1 k D和36.1 k D。AsGCS2被亚细胞定位于叶绿体中,而AsGCS3和As GCS4均被定位于细胞质中。氨基酸比对结果表明,AsGCS2与AsGCS3相似度为70%,与AsGCS4相似度为59%;而AsGCS3与As GCS4相似度为68%。进化分析图表明,AsGCS2属于Bsas2亚家族,AsGCS3属于Bsas1亚家族,AsGCS4属于Bsas6亚家族。荧光定量PCR结果表明,大蒜不同CSase的组织特异性是不同的,AsGCS2在叶中表达量最高,ASGCS3在根中表达量最高,而ASGCS4在叶和根中都有较高的表达量。3个半胱氨酸合成酶基因分别属于不同的Bsas亚家族,它们的组织表达特性也不相同,它们在大蒜不同组织中的半胱氨酸合成途径中起作用。

蒜素对黏虫的驱虫效果评价

[目的]研究蒜素对黏虫的驱虫效果。[方法]对大蒜提取物中最主要的成分蒜素对黏虫幼虫的驱虫效果进行较全面的评价及分析。[结果]蒜素对黏虫具有明显的驱避作用;同时由于蒜素为性质不稳定的易挥发物,不具备长期的驱虫效果,其有效驱虫时间为20 h,且高浓度的蒜素驱虫效果更好。[结论]蒜素对黏虫具有驱避作用,有效驱虫时间为20 h。

花粉介导的花青素调节基因NtAn2转化玉米研究

利用超声波辅助花粉介导法将花青素基因Nt An2导入玉米自交系郑58,并优化超声波辅助花粉介导基因转化方法的遗传转化体系。以新鲜的郑58玉米花粉为试验材料,检测其在不同浓度的蔗糖溶液中的体外萌发率;通过正交试验设计,对超声波处理功率、处理时间、处理次数3个因素进行优化,以确定最优转化组合;对收获的籽粒进行PCR检测。结果表明,玉米自交系郑58的花粉最适宜的蔗糖溶液浓度为20%;超声波处理最佳参数为:处理功率150 W,处理时间5 s/次,处理次数6次;PCR分子检测表明,其中有3粒含有阳性条带,且这3粒中有2粒呈紫色,初步证实,Nt An2已被整合到玉米基因组中,并且可以被用于对转化子的直观筛选。研究确立了超声波辅助花粉介导法遗传转化的最佳体系,为提高该植物基因转化方法的效率奠定了基础。