肿瘤抗原肽的HLA限制性确认和诱导反应性T细胞杀瘤能力评估

目的了解肿瘤抗原肽的HLA限制性以及其诱导的T细胞能否杀伤肿瘤细胞,探索无关供者来源细胞用于过继性抗肿瘤T细胞治疗。方法使用16个肿瘤抗原肽诱导18名无关供者外周血单个核细胞(PBMC)分化为反应性T细胞,并分析HLA型别;利用NetMHC数据库预测肽和HLA分子亲和力;选择HLA-A2限制性的肿瘤抗原肽诱导第二组17名无关供者的PBMC进行杀瘤实验,反应性T细胞作为效应细胞,T2细胞及肿瘤抗原肽同源的肿瘤细胞作为靶细胞,测量LDH(乳酸脱氢酶)释放量或者RTCA(实时无标记细胞分析仪)检测效应细胞杀瘤效率,比较HLA-A2+和A2-T细胞杀瘤效率。结果筛出和HLA-A2具有高亲和力的肿瘤抗原肽LM7,可诱导5/11 HLA-A2+为反应性T细胞,其中HLA-A2+纯合子则为3/3,而HLA-A2-者则为2/7。LM7诱导反应性T细胞杀伤肿瘤百分比A2+组明显强于A2-组(60.72±11.28 vs 47.2±4.46,P=0.03)。结论本研究显示NetMHC预测对于纯合子样品更有帮助,肿瘤抗原肽LM7具有HLA-A2限制性,可诱导部分HLAA2+PBMC分化为反应性T细胞,可杀伤肿瘤,应对供者进行HLA筛选并分析其细胞功能,其诱导的反应性T细胞可作为过继性T细胞抗肿瘤治疗的细胞来源。

NLRP3炎性小体对THP-1细胞吞噬老化红细胞后亚类分化的调控

目的明确NLRP3炎性小体是否可调节巨噬细胞对红细胞的吞噬能力,调控巨噬细胞的亚类分化。方法以NLRP3低表达的THP-1细胞(ID3 THP-1),转空载体的THP-1细胞(shNC THP-1)及野生型THP-1细胞模拟巨噬细胞,与未处理红细胞、水浴老化红细胞、IgG致敏红细胞分别孵育。流式细胞术检测THP-1细胞对不同红细胞的吞噬率;流式细胞术检测巨噬细胞M1亚类指标CD16和CD86,M2亚类指标CD163和CD206在THP-1细胞上的表达。结果NLRP3低表达的ID3 THP-1对红细胞的吞噬能力明显下调。老化红细胞具有诱导THP-1向M1亚类分化,抑制THP-1向M2亚类分化的能力。当THP-1的NLRP3炎性小体表达下降时,吞噬红细胞后,其向M1亚类分化的能力下调,而向M2亚类分化的能力增强。结论NLRP3炎性小体可作为一个靶向调节位点,调控巨噬细胞对红细胞吞噬,及其自身的亚类分化。

中国汉族人群检出新的B(A)641T>C等位基因

目的明确稀有ABO表现型的遗传学基础。方法对ABO血清学常规定型正反不一致的样本,采用PCR-RFLP方法作初步基因分型,对8例血清学表现为AwB,而基因分型具有O基因的个体,进行ABO基因第6和7外显子PCR产物的TA克隆及核苷酸序列测定。结果8例样本除1对为母女关系外,其余无任何亲缘关系,血清学表现相似,红细胞上含有接近正常的B抗原和少量A抗原,H抗原含量较正常B细胞显著增高,血清中存在抗-A,初定为AwB,基因分型均为BO。克隆测序表明除具有正常O1或者O1V基因外,他们的B基因第7外显子在正常B等位基因的基础上,均发生单碱基突变,4例发生nt700C>G点突变,导致Pro234Ala,2例无关个体为nt640A>G点突变,导致Met214Val,1对母女均表现nt641T>C点突变,导致Met214Thr。证实所有8例样本真正血型应为B(A)表现型,其基因型均为B(A)/O型。结论在中国汉族人群中检出3种B(A)血型,除了已在我国台湾首先被发现的B(A)700C>G和笔者以前报道的B(A)640A>G之外,新发现1种B(A)641T>C等位基因。

Ax亚型的分子生物学研究

目的 研究中国汉族人群Ax亚型的分子生物学特点。方法 首先采用双重PCR RLFP方法 ,对 8份血清学试验疑为Ax及AxB的标本 ,做ABO初步基因分型 ,明确其中的A、B或O基因 ;然后用限制性内切酶mobI筛选ABO基因第 7外显子中的T6 4 6A的突变。对不具有该突变而血清学疑为Ax的标本以及血清学和基因分型不一致的标本 ,则进一步对其ABO基因第 6和 7外显子做深入的克隆测序分析。结果 8份标本中有半数含有T6 4 6A点突变 ,剩余 4份中 ,1份为包含C4 0 7T和C4 6 7T错义突变的A weak 0 1等位基因 ,1份为携带新的核苷酸变异的Ax (C4 6 7T和C74 5T)等位基因 ,另外 2份血清学疑为AxB ,初步基因分型为BO的个体 ,克隆测序的结果显示两者均有正常的O基因 ,但是其B等位基因均发生了新的nt6 4 0位A G突变。结论 在中国汉族人群中检测到新的Ax及B(A)

60名上海汉族人群ABO血型系统基因型研究

目的 建立 ABO血型系统基因分型方法 ,研究上海汉族人群 ABO血型的基因型分布 ,并对 A等位基因进行较为深入的研究。 方法 采用多重聚合酶链反应 (PCR)和限制性片段长度多态性 (RFL P)方法 ,单管扩增 ABO基因第 6和第 7外显子 ,然后用 Kpn I和 Msp I两种限制性内切酶同时消化多重 PCR产物。 结果 在中国汉族符合 Hardy-Weinberg平衡的随机群体 (60人 )中 ,检出 A1 0 2 、A1 0 1 、B、O1 四种等位基因 ,其基因频率分别为 2 0 .8%、2 .5 %、2 4.2 %、5 2 .5 %。基因型频率为 BB10 .0 %、O1 O1 2 1.7%、A1 0 2 A1 0 2 1.7%、A1 0 1 A1 0 2 1.7%、A1 0 2 O1 3 3 .3 %、A1 0 1 O1 3 .3 %、BO1 2 5 .0 %、A1 0 2 B 3 .3 % ,未检测到 O2 基因。3名血清学疑为 A2 亚型的个体中有 1名经 PCR-序列特异性引物 (SSP)法证实存在 A467( C→ T ) 及 10 60位单个碱基 C缺失的移码突变。 结论 上海汉族人群 A型以 A1 0 2

人O型外周血淋巴细胞制备人单克隆抗-A细胞株

目的以正常O型人外周血淋巴细胞为实验对象,制备能稳定分泌人单克隆抗-A或抗-B的杂交瘤细胞株,在本实验室建立人血型单克隆抗体制备流程。方法使用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMCs),从狨猴B95-8细胞培养上清收获EB病毒(Epstein-Barr virus),用于转化B淋巴细胞,血清学微量板法筛选能够分泌目标抗体的细胞孔。显微镜下挑选分离单个克隆的细胞团,分泌特异性抗体的转化细胞与SHM-D33瘤细胞进行融合,经HOTD选择性培养,血清学筛选,得到分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。结果从随机O型个体的外周血淋巴细胞,成功构建持续稳定分泌人源IgM单克隆抗-A的细胞株。结论本研究提供一种可行的技术路线,为从人外周血淋巴细胞制备有诊断和筛选价值的人源血型单克隆抗体细胞株奠定基础。

中国汉族人群Jk(a-b-)表型遗传基础研究

目的Kidd血型抗原由JK基因编码,JK基因第838位G】A的单碱基突变决定了JK*A/JK*B多态性,使Kidd血型系统在人群中表现Jk(a+b-),Jk(a-b+)和Jk(a+b+)3种表现型。Jk(a-b-)是1罕见的稀有血型,亦称之为Jknull血型,由JK基因突变所致,本研究的目的是了解中国汉族人群Jk(a-b-)表现型的频率和遗传基础。方法通过对20万中国汉族献血者的大规模尿素筛选试验和随后的血清学抗原抗体凝集试验,鉴定出Jk(a-b-)表型个体16例。采用限制性内切酶MnlⅠ,通过RCR-RFLP分析进行JK基因初步分型,并进一步对编码JK基因的启动子和11个外显子,

用p[Tj(a-)]外周血淋巴细胞建立抗-PP1P^(k)杂交瘤细胞株

目的建立分泌抗-PP1P^(k)(又称抗-Tj^(a))的淋巴母细胞样细胞系(lymphoblastoid cell line,LCL)和单克隆杂交瘤细胞株。方法无菌条件下常规方法制备p[Tj(a-)]血型献血者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),用EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)转化单个核细胞中的B淋巴细胞,使其增殖形成B淋巴母细胞样细胞克隆。用菠萝酶处理的正常AB型和O型红细胞以及p[Tj(a-)]红细胞筛选培养上清,通过显微吸引分离技术获得分泌特异性抗-PP1P^(k)的LCL,与SHM-D33骨髓瘤细胞进行融合。异源杂交瘤细胞经次黄嘌呤(H)-氨基蝶呤(A)-胸腺嘧啶(T)-脱氧胞嘧啶核苷(D)-毒毛旋花苷(O)即HOTD培养基选择性培养、抗体筛选以及有限稀释亚克隆,建立分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株。结果从O型p[Tj(a-)]献血者外周血B淋巴细胞EBV转化细胞培养上清中,初筛得到与正常红细胞全部凝集,与p[Tj(a-)]红细胞不凝集的单个淋巴母细胞样克隆5E1-E5,初步鉴定培养上清具有抗-PP1P^(k)特异性。随后利用杂交瘤技术,将5E1-E5细胞与SHM-D33骨髓瘤细胞进行融合,建立了持续稳定分泌IgM抗-PP1P^(k)的单克隆杂交瘤细胞株。结论本研究通过EBV转化和杂交瘤技术建立了分泌抗-PP1P^(k)的人单克隆细胞株,这项工作使大规模筛选稀有p[Tj(a-)]血型成为可能,对我国稀有血型库的建设具有重要意义。

利用D--外周血B细胞构建单克隆抗-C杂交瘤细胞株

目的以1例稀有的O型D--献血者外周血单个核细胞为实验对象,制备分泌Rh血型系统单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法无菌分离外周血白细胞,经淋巴细胞分离液分离得到单个核细胞(PBMCs),利用B95-8培养上清中的EB病毒(EBV),转化PBMCs中的B淋巴细胞使其母细胞化。血清学筛选分泌特异性抗体的单一B细胞克隆并扩大培养,与SHM-D33瘤细胞在电刺激下融合,经含有次黄嘌呤(Hypoxantine,H)、氨基蝶呤(Aminopterin,A)、胸腺嘧啶核苷(Thymidine,T)、脱氧胞嘧啶核苷(2-Deoxycytide,D)、毒毛旋花苷(Ouabain,O)的培养基,即HOTD(HATD+Ouabain)选择性培养、微量板抗体筛选以及有限稀释亚克隆,建立分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,血清学和流式细胞试验鉴定抗体特异性。结果从D--外周血转化B淋巴细胞培养上清中,初筛得到与R;R;(DCe/DCe)O型红细胞凝集,与R;R;(DcE/DcE)O型红细胞不凝集的单个细胞克隆3A6-C6,初步鉴定抗体特异性为抗-C,与SHM-D33骨髓瘤细胞杂交后建立了持续稳定分泌IgM抗-C的杂交瘤细胞株。结论本研究从外周血B细胞开始构建单克隆杂交瘤细胞株,为Rh血型系统血清学单克隆试剂的研发和改造奠定了基础。

用合成肽制备鼠源性抗-GPB单克隆抗体及特性鉴定

目的用合成肽作为免疫原,制备针对血型糖蛋白GPB的单克隆抗体细胞株。方法合成人血型糖蛋白GPBs上1段由GPB蛋白第17-36位氨基酸构成的肽段17TKSYISSQTNGETGQLVHRF36,用钥孔虫血蓝(KLH,keyhole limpet hemocyanin)载体蛋白联接的合成多肽免疫BALB/c小鼠。采用杂交瘤技术制备鼠源单克隆抗体,经选择培养和有限稀释亚克隆后,ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,健康小鼠腹腔接种阳性杂交瘤细胞,制备小鼠腹水,谱红细胞凝集试验、酶处理红细胞、特定稀有血型红细胞凝集试验,以及蛋白免疫印记(Western-Blotting)等技术鉴定抗体特异性;鼠源m Ab亚类试剂盒鉴定抗体Ig G亚型。结果 ELISA筛选获得阳性单抗细胞株1株,经鼠源m Ab亚类试剂盒鉴定,所制备的单克隆抗体属于Ig G3,Kappa型轻链。其小鼠腹水制备液与所有谱红细胞在盐水和抗鼠球蛋白介质中均产生凝集(包括Ss,SS,ss,MM,MN,NN表型),与稀有的MkMk细胞不发生凝集。腹水制备液与经木瓜酶、菠萝酶、无花果酶和胰蛋白酶处理的O型红细胞反应,凝集强度与非酶处理红细胞无明显改变。Western-Blotting杂交试验显示小鼠腹水稀释液与红细胞膜蛋白的杂交条带位于GPB的位置。结论制备1株可分泌抗-GPB m Ab的杂交瘤细胞株,为进一步的实验研究奠定了基础。

ABO血型系统分泌型研究进展

ABO血型抗原除表达在红细胞表面以外 ,还以可溶性血型物质的形式存在于大部分人的唾液或其它形式的分泌液中。产生可溶性血型物质的能力由 19号染色体长臂的 SE基因 (又称 FUT2基因 )位点决定。

RH血型系统遗传学研究进展

194 0年 L andsteiner和 Wiener用印度恒河猴红细胞免疫兔子 ,发现兔子的抗恒河猴红细胞抗血清 ,可以凝集大部分白人的红细胞 ,进而发现了 RH血型系统。半个世纪以来 ,关于 RH血型遗传机理的假说 ,众说纷纭。其中比较著名的有Fisher- Race学说及 Wiener学说等。 2 0世纪 90年代 ,随着分子生物学技术的发展 ,科学家提出了崭新的观点来解释 RH血型系统的遗传。 RH系统由 1号染色体短臂上两个高度同源的基因 RHD和 RHCE编码。本文就

作者更正说明

《中国输血杂志》编辑部:您好!本人刊登在中国输血杂志2020年第33卷第11期1156页1.2部分发现1处错误: 按100 mL 每孔铺96孔培养板,现请更正为:按100 uL 每孔铺96孔培养板。谢谢!

免疫性输血反应的调查及预防研究

目的 对各类输血反应进行调查研究 ,同时建立输血前免疫血液学检查新技术 ,以预防和治疗免疫性输血反应。方法 对上海地区 13家医院的 30 776名输血病人进行调查 ,并应用改良Polybrene、简易致敏红细胞血小板血清学试验 (SEPSA)等新技术 ,进行同种特异性抗体的筛选、鉴定及交叉配型试验。结果 发生各类输血反应5 0 8例 (1.6 5 % ) ,其中检出引起免疫性输血反应的同种抗体 6 4例 (12 .6 % ) ,抗体特异性分别为血小板抗体 (包括HLA) 5 1例 ,红细胞不规则抗体 13例 ;各项新技术的应用对预防免疫性输血反应的发生具有显著相关性 (χ2 >3.84 ,P <0 .0 5 )。结论 使用研究建立的输血前免疫血液学新技术能有效地诊断、预防和治疗免疫性输血反应的发生 。

上海地区中国人群中ABO亚型的研究

目的研究中国人群中各种ABO亚型分布的特点，以及在A、B亚型中不规则ABO抗体的发生率。方法用常规方法对本中心2003-2004年的献血者血样共440617份进行筛选，对于正反定型不符的血样进一步作血清学以及分子生物学分析，并分类。另外，使用抗-H和抗-A1，筛选A2、A2B亚型。结果最常见的亚型为A2和A2B，分别占人群总数的0．156％和0．443％。确认其它ABO亚型（不包括A2，A2B和类孟买）共66例，占人群总教的1．50／万（66／440617）。A、B亚型中分别检出不规则抗-A，抗-B（同时存在A抗原和抗-A或B抗原和抗-B）54例，分别占A亚型和B亚型总教的91％和56％。通过本研究发现“A亚型B”的检出率明显高于期望值（4．08～9．97倍），而这一现泉在“AB亚型”中表现不明显（0．865-1．65倍）。结论除A2，A2B之外，中国人群中B亚型明显多于A亚型，而A亚型产生抗-A的比例明显多于B亚型产生抗-B的比例；ABO亚型中普遍存在的不规则抗体现象提示正确鉴定ABO亚型的重要性；各种AB亚型的检出率明显高于期望值，显示了A，B亚型基因之间存在相互作用。

红细胞稀有血型筛选、建库与应用

目的通过在献血者中筛选稀有血型,获得针对高频血型抗原组表达阴性的稀有表型,解决临床稀有血型血液供应困难的难题。方法在国家"十一.五"和"十二.五"计划项目中,通过国內13个省级血液中心的联合,利用血型血清学方法和分子生物学方法,我们开展了针对Duffy,Kell,Kidd,MNS,Gerbich,Diego,Yt,Lutheran,Col-ton,Ok以及ABO,Rh血型系统中高频抗原的筛选。在血清学筛选试验中,釆用了适应于高通量的微量板法和改良的抗球蛋白法。这些方法在简化经典的间接抗蛋白试验的同时,又适用于血型自动化检测的需术。在这些血型系统稀有血型筛选中,有10多种稀有血型是通过筛选稀有等位基因的方法来完成的。通过组建多个多重PCR体系,我们成功地完成了针对k,s,Fy(a-),Co(a-),Yt(a-),Di(b-),Kp(c-),Kp(b-),Js(b-),Ok(a-)稀有等位基因的检测。由于单个实验室通常无法同时获各类稀有表型DNA作为分子诊断的实验对照,我们采用了定点诱变技术(SDM),通过环状诱变PCR方法,制备了各种稀有表型等位基因突变点片段,以用于分子生物学方法筛选稀有血型的对照。结果在2008～2010年期间,参于项目的各单位共筛选献血者稀有血型135多万人次。其中北京、上海、广州、天津、武汉、浙江、江苏、成都血液中心筛选汉族献血者130万人次,新彊、内蒙、广西、昆明血液中心筛选少数民族献血者5万多人次。共获得各类稀有血型1 000多例。其中包括极为罕见的Ko、Rhnull、Wr(b-)等稀有表型。众多新的血型等位基因和存于中国人群中的特殊遗传模式被发现。同时,也首次在中国人群中发现Yt(a-),Co(a-),Lu(a-b-)等稀有表型。2011年1月,中国稀有血型专业网站开通,通过信息发布、在线查询和BBS论坛讨论,进一步有益于稀有血型的信息交流与技术的推广。在最近2年的临床稀有血型输血应用中,共有>4 000 ml的稀有血液被用于临床抢救与治疗。结论开展稀有血型筛选并建立全国性的稀有血型信息网络对解决临床稀有血型输注困难是有效的途径。扩大筛选的范围与增加筛选与验证的体系有助于中国稀有血型库的壮大。

AB亚型细胞上H抗原强度的探讨

目的探讨H抗原在AB亚型中分布的规律,对AB亚型的正确鉴定提供帮助。方法用血清学试验与分子生物学相结合的方法确定各种AB亚型,对检出的39例A2B和45例其它AB亚型做H抗原检测,并与正常O型、B型细胞比较,判断其H抗原的强度。当AB亚型的H抗原凝集评分高于B型红细胞2分或2分以上时,认为该AB亚型上存在较多的H抗原。结果只在CisAB(100%),B(A)(100%),AxB(46.2%)以及A2B(43.6%)上发现了大量H抗原,而在其它众多的AB亚型中,H抗原与B型红细胞比较没有明显增强。结论大多数H抗原的增强现象可以用“3型H抗原”的残留来解释,但是对于53.8%AxB、56.4%A2B以及A3B、AmB中H抗原不增强的现象尚无合理的解释。

M-CSF、GM-CSF诱导人源外周血单个核细胞来源巨噬细胞的不同极化和吞噬

目的观察人源外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)在体外培养诱导单核巨噬细胞时是否因刺激剂M-CSF、GM-CSF的不同而造成极化状态差异,并衡量极化状态差异是否伴有吞噬能力的改变,并寻找可能相关的免疫表型标记。方法取健康献血员新鲜外周白膜血,分离获得PBMC后,每一份PBMC都分为MCSF、GMCSF组,分别对应M-CSF或GM-CSF作为诱导剂。培养d7时用诱导得到的单核巨噬细胞分别和致敏红细胞、未致敏红细胞、血小板(Plt)以及葡聚糖-40(dextran-40)共孵育,模拟MMA(单核细胞单层实验),利用流式细胞仪观察吞噬结果。同时用流式分析2组细胞的CD11C、CD14、CD15、CD16、DR、CD32、CD32b、CD49f、CD54、CD64、CD68、CD86、CD163等免疫表型。所有得到的结果进行配对t检验分析差异。结果 MCSF、GMCSF组CD14+CD16+细胞占比分别为(62.6±33.7)%vs(22.8±15.6)%,CD163+CD14+细胞(29.7±18.7 vs 0.64±0.42), CD14 MFI 3 829±2 091vs464±101,(P均<0.05)。同时MCSF组伴随CD64+(45.7±25)%vs(24.5±19)%、CD32b+(59.5±22.4)%vs(27.5±11.8)%细胞占比增高,CD32+、HLA-DR+细胞数虽然无明显变化,但其MFI分别较GMCSF组增高和降低(MFI CD32 1 093±380vs530±179;MFI DR 1 034±290vs1 661±367)。同时发现MCSF组具有较强的吞噬力,对被吞物的吞噬力多数为Plt> Dextran-40>致敏RBC>非致敏RBC。结论证实了人源PBMC诱导的单核巨噬细胞在体外培养时同一起源样品也可因M-CSF、GM-CSF而促成不同极化方向, M-CSF促进M2型极化, GM-CSF促进M1型极化,并由此影响对致敏红细胞、血小板(Plt)以及葡聚糖-40的吞噬能力,因此在临床使用M-CSF、GM-CSF时需注意单核巨噬细胞的极化方向,采取更有利于患者治疗和临床实验的制品。

人不是熊猫 人血不是熊猫血

ABO和Rh是人类众多血型系统中最具临床意义的两种。RhD(-)在中国汉族人群中相对较少(0.4%),社会上有人将RhD(-)血型称为"熊猫血",暗示有RhD(-)血型的血液特别珍贵,RhD(-)血型的伤患者只能输RhD(-)的血液,而RhD(-)血型的献血者最好平时不要献血,要留到需要的"关键时刻"才献血的错误观点.本文通过血型与稀有血型的定义,从遗传学与临床病理学的角度,分析了RhD(-)产生的原因、频率与临床需求量。并通过介绍血液的招募、采集、化验、制备、发放的整个过程以及献血伦理规范,论述了对RhD(-)常见的误解和不合理宣传。本文提倡,健康适龄的RhD(-)人士像其他血型的献血者一样,定期规律地参加无偿献血,这是保证RhD(-)血源合理库存、进而使RhD(-)患者的输血需求能及时得到满足的基本途径。

中国人中发现2种新的弱D型

目的鉴定并确认在中国人中发现的2种新的弱D型。方法对2份从上海市血液中心无偿献血者血样中筛查出的RhD抗原减弱的标本,采用常规Rh分型试剂对其作血清学分型,使用D-screen试剂盒分析其RhD抗原表位;对RHD基因全部外显子测序并分析杂合性,使用PCR-SSP方法对新的弱D型作基因分型。结果在2名弱D型献血者中分别发现2种新RHD等位基因:RHD(R10P)和RHD(A414V);D抗原表位分析结果与弱D表型相一致。建立了测定新等位基因的PCR-SSP检测方法。结论在中国人群中发现了2种新的弱D型,初步阐明了这2种弱D表型的分子机制。