微粒子感染家蚕对肠液蛋白酶及中肠碱性磷酸酶活性的影响

微粒子感染家蚕对肠液蛋白酶及中肠碱性磷酸酶活性的影响郭锡杰，朱峰，黄可威，徐莉（中国农业科学院蚕业研究所）研究病原感染与蚕体内有关物质代谢的关系，有利于从病理生化学的角度揭示病原对蚕体的致病机理［１，２］，从而达到更加有效的防治目的。我们研究了家蚕微...

家蚕几种病原微孢子虫的比较研究

从不同地区养蚕生产及桑园害虫中分别收集到四种微孢子虫，ＭＡ—１、ＭＤ—１、Ｐｈａ—Ｍ和Ｈａ—Ｍ。从它们孢子的形态、对蚕的致病性、相互间的血清学关系、在蚕体内的寄生部位和引起的组织与细胞病变以及在蚕体内增殖的生活史等方面与典型的家蚕微粒子病病原Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ进行了比较研究。结果表明，ＭＡ—１与Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ相同；Ｈａ—Ｍ可能亦来源于Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ；ＭＤ—１为Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ的形态变异株，定名为Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓｍｏｒ．ｖａｒ．；而Ｐｈａ—Ｍ为与Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ不同的种，暂称为Ｎｏｓｅｍａｓｐ。

不同来源微粒子孢子间血清学关系的比较研究

应用玻片凝集法和酶标抗体法比较了几种不同来源微粒子孢子间的血清学关系，包括本所保存的家蚕微粒子孢子（ＢｍＮ．ｂ），从安徽绩溪和江苏东台的饲养蚕中收集到的微粒子孢子和从四川收集到的蓝叶虫（ｐｈｙｌｌｏｂｒｏｔｉａｃａｒｍａｔａＢａｌｙ）微粒子孢子。结果表明，绩溪、东台微粒子孢子与ＢｍＮ．ｂ之间具有相同的血清学关系，而蓝叶虫微粒子孢子与ＢｍＮ．ｂ之间无血清学关系。

浓核病毒(镇江株)感受性家蚕品种中肠组织不同部位蛋白质比较分析

为了探明浓核病毒镇江株(BmDNV-ZJ)感受性家蚕品种中肠组织不同部位对浓核病毒感受性差异的蛋白质组学机制,阐明家蚕浓核病毒的致病机理,应用等电聚焦(IFE),SDS-PAGE分离,2D P latinum软件以及质谱技术,对感受性家蚕品种中肠前、中、后3个区段的组织蛋白进行了比较分析.结果表明:中肠前、中、后3个区段组织蛋白的点数、位置、点形等差异较小.在中肠前部和后部组织中找出的4个差异蛋白点,分别为脂蛋白前体、囊膜氢离子泵ATP合酶B亚基、α胰蛋白酶A链和肌动蛋白;在中肠中部找出的一个差异蛋白点为Kun itz型胰蛋白酶抑制剂A链.这些蛋白点可能在BmDNV-ZJ侵染感受性家蚕中肠组织细胞中起一定的作用.

家蚕病原性微孢子虫孢子表面蛋白的选择性分离与总蛋白比较分析

选择性分离了Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ孢子表面蛋白和总蛋白，采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测发现，孢子表面蛋白由分子量不同的３种亚基（３２０００、２６０００、２４５００Ｄａ）组成，其总蛋白至少包括２５个条带。同时将从养蚕生产中收集到的两种微粒子ＭＡ－１和ＭＤ－１以及从野外昆虫收集到的微孢子虫Ｐｈａ－Ｍ和Ｈａ－Ｍ与Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ进行了比较，发现不同微孢子虫间蛋白组成有差异。

胶乳凝集试验在家蚕浓核病毒检测中的应用

应用抗体致敏的胶乳进行凝集试验检测提纯的家蚕浓核病毒,可检测出的最小量为1×10^(-3)OD,比对流免疫电泳法和双向免疫扩散法的灵敏度高100倍,但比斑点免疫结合测定法低10倍;检测蚕体样品时,比对流免疫电泳法检出病毒时间早,检出阳性率高。致敏胶乳的最适IgG量为0.5～1mg/ml,致敏胶乳的最适密度为1％。为排除非特异性反应,致敏胶乳应含有0.1％的BSA;以含0.05％Tween-20的Tris-HCl缓冲液制备检样组织匀浆,静置10～15分钟取上清待检。样品与致敏胶乳混合后10分钟内即可判断结果。

杆状病毒的酪氨酸蛋白磷酸酯酶研究

酪氨酸蛋白磷酸酯酶是生命细胞内一类重要的酶 ,与细胞信号转导有关 ,对多种生理过程如生长、分化、代谢、细胞周期调节和细胞骨架等具有重要的调节功能。某些杆状病毒和痘苗病毒的基因组中具有编码酪氨酸蛋白磷酸酯酶的开读框 ,与感染性和致病性有关。病毒编码的酪氨酸蛋白磷酸酯酶具有双重底物特异性 ,即可以同时催化蛋白质酪氨酸和丝氨酸

昆虫杆状病毒在生物技术研究中的应用

随着昆虫杆状病毒分子生物学研究的不断深入 ,昆虫杆状病毒在生物技术研究中也得到了应用。利用杆状病毒作为载体 ,在昆虫细胞和虫体内表达外源基因 ,形成了昆虫杆状病毒载体表达系统 ,利用杆状病毒携带外源基因 ,通过同源重组将外源基因导入到家蚕的基因组构建了转基因家蚕 ;通过向杆状病毒基因组中插入毒素、激素、酶抑制剂等的基因或从杆状病毒基因组中删除某个基因 ,或通过不同杆状病毒间的杂交 ,使子代病毒的宿主域扩大 ,从而提高了杆状病毒作为生物杀虫剂的杀虫效果。

家蚕微粒子病研究进展

一、微孢子虫的形态与分类家蚕微粒子病通常是指由家蚕微粒子(Nosema bombycis)寄生引起的蚕病。家蚕微粒子孢子呈卵形或长卵形,大小为3.8～3.9×2.0～2.2μm。孢子被蚕食下后,在消化液的作用下发芽弹出极丝。

家蚕核型多角体病毒酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因核苷酸序列分析

从家蚕核型多角体病毒中国镇江株 (BmNPV ZJ)基因组DNA中克隆出酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因 (ptp) ,该基因的编码部分由 5 0 7个核苷酸组成 ,其中A为 16 3、C为 99、G为 113、T为 132 ,G +C含量约为 4 2 %。根据其核苷酸序列推演的蛋白质由 16 8个氨基酸残基组成 ,其中含有酪氨酸蛋白磷酸酯酶催化活性区的 11个氨基酸“HC”基序。该基因与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV)ptp和BmNPV T3株 (日本 )的ptp核苷酸序列的同源性分别为 96 8%和 98 2 %。BmNPV ZJ酪氨酸蛋白磷酸酯酶 (BmNPV ZJPTPase)的氨基酸全序列与AcMNPV、BmNPV T3、芹菜夜蛾核型多角体病毒 (AfMNPV)PTPase和黄杉毒蛾核型多角体病毒 (OpMNPV)PTPase 1的氨基酸全序列的同源性分别为 97%、97 6 %、96 %和 6 0 % ,而与OpMNPVPTPase 2的同源性仅为 2 0 %。在NCBI数据库中查找BmNPV ZJPTPase的同源性序列 ,查找到的 5 99381个序列中发现至少有 14种mRNA加帽酶其N端部分存在PTPase催化活性区的“HC”基序 ,但其氨基酸全序列的同源性只有 31%～ 32 %。该基因序列已被GenBank数据库收录 ,登录号为AF316

利用SSR标记对家蚕黄血基因的定位及连锁分析

位于家蚕第2染色体的黄血基因(yellow blood,Y)控制类胡萝卜素由中肠进入血淋巴,是形成黄色茧系的基础。利用家蚕雌不发生交换的特点,采用黄茧品系KY和白茧品系C108组配正反交BC_1群体(C108×KY)×C108和C108×(C108×KY),分别记作BC_1F和BC_1M,根据已经构建的家蚕SSR分子连锁图谱,对Y基因进行了定位及连锁分析。筛选出6个与Y基因连锁的SSR标记,这些标记在BC_1F群中的所有黄血个体均表现出与(C108×KY)F_1相同的杂合型带型；而所有白血个体带型与亲本C108一致,为纯合型。利用另一个群体BC_1M构建了关于Y基因的遗传连锁图,遗传距离为18．9cM,Y基因位于15．6cM。

桑树硬枝扦插不同生根类型插穗的生理特性研究

桑树扦插生根是一个由外界因素和内源物质共同调控的复杂过程。采用桑品种育711号1年生硬枝为插穗,分别以传统愈伤组织生根技术和新的可诱导皮部生根的技术进行处理,以清水处理为对照,测定愈伤组织生根(Ⅰ型)与皮部生根(Ⅱ型)2种类型插穗生根过程中可溶性总糖、可溶性蛋白和酚类物质的含量,以及吲哚乙酸氧化酶(IAAO)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性。结果表明,不同生根类型插穗的上述生理指标呈现出差异性及不同的变化规律。可溶性总糖与可溶性蛋白含量在对照组插穗和Ⅰ型插穗生根过程中一直呈下降趋势,在Ⅱ型插穗生根过程中则表现为先下降再升高的变化趋势。IAAO活性在Ⅱ型插穗生根过程中经过一个短暂的下降后迅速升高,在Ⅰ型插穗生根过程中则保持一段时间的稳定后再下降;POD与PPO活性在Ⅰ型和Ⅱ型插穗生根过程中都是先上升后下降,但Ⅱ型插穗中的酶活性较高。酚类物质含量在Ⅱ型插穗生根过程中一直下降,而在Ⅰ型插穗生根过程中则是先下降后上升。试验结果提示,外源因素导致的桑树插穗扦插生根类型不同,可能是由于改变了插穗在生根过程中的营养物质含量及相关酶类活性的变化规律,即改变了插穗的生理特性所致。

结合SSR标记和STS标记对家蚕无鳞毛翅基因的定位

家蚕突变表型无鳞毛翅(non-lepis wing,nlw)由隐性基因nlw控制。由于家蚕雌性不发生交换,文章采用有鳞毛翅品系P50和无鳞毛翅品系U06两个品系组配F1代及BC1回交群体,(U06×P50)×U06和U06×(U06×P50)分别记作BC1F和BC1M,根据已经构建的家蚕SSR分子标记连锁图谱及已经发表的有关序列对nlw基因进行了连锁及定位分析。得到8个与nlw基因连锁的SSR(Simple sequence repeat)标记和1个STS(Sequence-tagged sites)标记。BC1F群中的所有正常翅个体均表现出与(U06×P50)F1相同的杂合带型;而所有无鳞毛个体带型与亲本U06一致,为纯合型。利用BC1M群体构建了关于nlw基因的遗传连锁图,连锁图的遗传距离为125.7cM,与nlw基因最近的引物为STS标记cash2p,图距为11.4cM。

利用SSR标记对家蚕耐氟基因进行连锁定位分析

采用家蚕耐氟品系T6和敏感品系733新组配正反交群体(733新×T6)×733新和733新×(733新×T6),分别记作BC1F和BC1M。基于雌性家蚕染色体不发生交换,用已构建的家蚕SSR连锁图上的标记对耐氟基因(dominant endurangce to fluoride,Def)进行了定位及连锁分析。在28个连锁群上都找到了多态标记,其中只有3个位于12连锁群上的SSR标记与耐氟基因连锁。根据第12连锁群上已有的微卫星序列,寻找其所在的Scaffold上的其它SSR位点,并设计引物,找到一个新的多态性SSR标记。BC1F群中的所有耐氟个体均表现出与(733新×T6)F1相同的杂合型带型,而所有敏感个体带型与亲本733新一致,均为纯合型,说明家蚕耐氟性状是由位于第12连锁群上单个显性主效基因控制的。利用另一个群体BCM构建了耐氟基因的遗传连锁图。

家蚕丝素基因表达水平的定量分析

采用实时定量RT-PCR方法,对丝素轻链基因(fib-L)、丝素重链基因(fib-H)、P25基因在家蚕幼虫不同组织和不同发育时期的表达进行了定量分析。结果发现3种丝素基因除主要在5龄幼虫的后部丝腺中表达外,在其它组织如脂肪体和中部丝腺中也有一定程度的表达;在4龄眠期的后部丝腺中3种丝素基因也有一定的表达水平,其中fib-L在这一时期的表达量较高。同时发现在5龄第3天和第5天的后部丝腺中,fib-H、fib-L与P25在mR-NA水平上的摩尔比分别为9∶18∶1和19∶32∶1,推测丝素基因的表达可能具有转录后调控,此结果说明家蚕丝素基因的表达可能具有更加精细的调控机制。

基于包络线法的滨海滩涂PLSR盐分模型研究

以辽河三角洲滨海湿地滩涂为研究区域,首先利用8种常用光谱变换方法和包络线法进行光谱特征分析,发现光谱数据经包络线法去包络后与盐分含量的相关性显著提高,并确定其对盐分敏感的最佳波段,利用PLSR建立敏感波段的土壤盐分反演模型。研究表明,模型由于保留了对土壤含盐量贡献大的波段,反演精度较高,同时减少了计算量。

家蚕精子介导转基因技术体系的优化

为了构建高效的家蚕转基因技术,对采用piggyBac转座载体的家蚕精子介导转基因的主要技术参数进行优化,结果表明外源DNA的稀释剂和注射方式对导入效率影响较大,G0代未整合的外源DNA在5龄期前基本被降解破坏。推荐的家蚕精子介导基因转移技术方案为:处女蛾交尾囊注射6～8μL以0.1×TE稀释的2 g/Lpig-gyBac转座子载体DNA后正常交配产卵,根据G0代5龄期及蛾期PCR检测标记基因为阳性的蛾区自交,G1代阳性个体自交以获得纯合后代。

家蚕黄血抑制基因的SSR定位

家蚕黄茧性状主要由3个基因控制,分别是黄血基因(Yellow blood,Y),黄血抑制基因(Yellow inhibitor,I)和黄茧基因(Out-layer yellow cocoon,C)。I基因阻止类胡萝卜素从中肠上皮细胞到血淋巴的转运,是天然黄茧形成过程中的重要控制基因。利用家蚕雌性不发生交换的特点,采用黄血黄茧品系KY和白血白茧品系巴格达特(Ba)组配正反交群体(Ba×KY)×KY和KY×(Ba×KY),分别记作BC1F和BC1M,根据已经构建的家蚕SSR分子标记连锁图谱对I基因进行了定位及连锁分析。筛选出3个与I基因连锁的SSR标记。BC1F群中的所有白血个体均表现出与(Ba×KY)F1相同的杂合型带型;而所有黄血个体带型与亲本KY一致,为纯合型。利用另一个群体BC1M构建了关于I基因的遗传连锁图,连锁图的遗传距离为38.4cM,与I基因最近的引物为S0904,图距为7.4cM。

桑树硬枝扦插生根过程基部皮层的差异蛋白质组分析

应用同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术结合液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS),分析桑树硬枝扦插生根不同阶段插穗基部皮层的蛋白质组差异,为从分子水平研究桑树扦插生根调控机制提供基础信息。在扦插初期、膨大期、发根期3个阶段的插穗基部皮层共鉴定到4 427种蛋白质,通过对同位素报告基团相对含量的定量检测,共检出2 875种蛋白质。其中,扦插初期和膨大期的差异蛋白质有595种,扦插初期和发根期的差异蛋白质有660种,膨大期和发根期的差异蛋白质有231种。从表达差异显著的蛋白质中筛选出GDP-D-甘露糖基-3’,5’-异构酶、凝集素KM+、生长素IAA水解酶、热激蛋白hsp70、丙二烯氧化物环氧酶、细胞色素b6、过氧化物酶等可能与生根过程密切相关的蛋白质,通过GO功能注释和KEGG数据库比对分析,这些差异蛋白质在扦插生根中主要执行的功能包括代谢过程、多细胞组织进程、定位系统建立、生物学调控、刺激应答、细胞要素、细胞器要素、催化活性和蛋白质结合等,并主要参与次生代谢产物的生物合成、淀粉和蔗糖代谢、内质网蛋白质加工、苯丙素生物合成、糖酵解和糖异生等代谢通路。

家蚕地方品种线粒体基因组A+T丰富区的序列及分子进化分析

为了研究家蚕线粒体基因组A＋T丰富区的结构和家蚕品种的进化，用PCR方法扩增了12个家蚕（Bombyx mori）地方品种线粒体基因组A＋T丰富区及其侧翼序列，分离纯化后克隆到pMD18-T载体进行测序。序列分析表明，克隆片段长度约1．1kb，基因排列顺序与C108线粒体相同，依次为12SrRNA基因3’端、A＋T丰富区、tRNA^Met、tRNA^lle。tRNA^Gln和ND2基因5’端，在tRNA^Gln和ND2基因之间有47bp的非编码区。以日本野桑蚕（Bombyx mandarina）为外群，用Phylip软件包构建了基于12个家蚕品种线粒体基因组A＋T丰富区序列的NJ进化树。结果显示，甘肃种单独聚为一群，其进化早于其它11个品种聚成的类群，说明甘肃种是供试家蚕品种中进化最早的品种。这一结果在分子水平上为黄河流域是家蚕品种的发祥地之一提供了证据，也进一步支持了家蚕品种的中国起源说。对A＋T丰富区及其侧翼基因的结构分析表明，家蚕线粒体12SrRNA和ND2基因都十分保守，14个品种统计只分别发生1个和2个碱基转换；A＋T丰富区中（A＋T）比例高达94．9％以上，第27nt开始有1个T-串结构，长度为16～19bp不等；同时还根据3个tRNA基因的核苷酸序列推定了其二级结构。