SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD的构建、筛选及免疫原性研究

目的 构建重组痘苗病毒载体疫苗rVTT△TK-RBD,并评价其安全性和免疫原性。方法 参考严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)基因序列合成受体结合域(RBD)基因,并将其插入自主构建的重组质粒pSTKE的多克隆位点上,构建重组痘苗病毒穿梭载体pSTKE-RBD,并转染到预先感染天坛株痘苗病毒(VTT)的BHK-21细胞内,经多轮的荧光噬斑筛选成功获得重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD;通过滴鼻方式免疫小鼠后,检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠体质量的影响;通过肌肉免疫小鼠后,分析rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠产生的特异性抗体和中和抗体的水平;通过流式细胞术检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠T细胞亚群的影响。结果 利用同源重组、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)筛选标记和多次荧光噬斑筛选,成功筛选获得了表达RBD的胸腺激酶(TK)基因缺失型重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD,且PCR验证成功。BALB/c小鼠体内实验表明rVTT△TK-RBD具有较好的抗SARS-CoV-2的免疫原性且相比于亲本株VTT明显降低了对机体的毒性作用。结论 成功构建并获得SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD并通过各项试验证明其安全性和免疫原性。

猪2型圆环病毒核酸疫苗的接种Balb/c小鼠实验免疫研究

为了筛选得到较理想的核酸疫苗,用pVAX1真核表达载体,以猪白介素18基因、猪2型圆环病毒内蒙株的衣壳蛋白和与复制相关蛋白基因为目的基因,构建了4个重组质粒,分别是pVAX1-ORF2、pVAX1-UL18ORF2、pVAX1-ORF2ORF1和pVAX1-IL18ORF2ORF1。用它们免疫6-8周龄Balb/c小鼠,进小鼠后一周首免,每隔19d免1次,共免3次;每10d采血1次,三免后10d杀鼠取脾。用ELISA方法检测小鼠血清抗体效价,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类CD4+、CD8+数量。统计学分析发现:4个核酸疫苗实验免疫组均是从最后一次采集的小鼠血清中,获得最高的抗体效价,与对照组PBS和空载体pVAX1相比都能产生一定的体液免疫反应,且以pVAx1-IL18ORF2ORF1核酸疫苗免疫小鼠产生的血清抗体效价最高;脾T淋巴细胞亚类数量测定发现,免疫实验组的CD4+与CD8+的T细胞亚类总数显著高于对照组(P<0.05),并以pVAX-1-IL18ORF2ORF1数值较高。结论是核酸疫苗pVAX1-IL18ORF2ORF1既能较好地刺激细胞免疫又能产生一定的体液免疫反应,相对较好,将作为候选核酸疫苗进行下一步本体动物免疫实验研究。

中国流行株HIV-1gag-gp120与IL-2/IL-6共表达核酸疫苗质粒的构建和实验免疫研究

以pcDNA3.1(+ )为载体 ,构建了含中国流行株HIV_1gag_gp12 0嵌合基因的核酸疫苗质粒 ;并以pIRES 1neo为载体 ,构建了gag_gp12 0与IL_2 /IL_6共表达的 2种核酸疫苗质粒。将核酸疫苗质粒在体外转染BHK_2 1细胞 ,ELISA方法检测到 3种核酸疫苗质粒均表达了目的HIV_1结构蛋白。将核酸疫苗质粒免疫小鼠 ,免疫学指标检测结果表明 ,在本实验条件下 ,未能检测到含有gag_gp12 0的核酸疫苗质粒免疫鼠的细胞免疫和体液免疫功能的明显改变 ;而与IL_2 /IL_6共表达的 2种核酸疫苗质粒使免疫鼠CD4 +、CD8+T细胞数量明显升高 ,ConA和LPS诱导的细胞增殖能力显著增强 ,CTL活性明显提高 。

重组传染性法氏囊病病毒VP2/VP243基因表达及保护性和免疫原性

目的在重组鸡痘病毒中表达传染性法氏囊病毒 VP2/VP243基因,并研究表达产物的保护性和免 疫原性。方法以 FPV 282E_4株 TK基因为侧翼,分别将鸡法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV) VP2 和VP243目的基因克隆到牛痘病毒A型包涵体(ATI)和痘苗病毒P7.5复合型启动子下游,构建成2个重组表达质 粒,命名为pUTALacVP和pUTA LacVPO。用这2个质粒转染CEF细胞,用X-gal染色法筛选出2株重组病毒vUTA lacVP2和 vUTALacVP0。用这 2株病毒免疫 1周龄 SPF鸡,以常规疫苗为对照。结果 ELISA、SDS-PAGE和 Western blot表明表达产物可与IBDV特异性多克隆抗体反应,并诱导鸡保护性抗体。在使用vvIBDV攻击前,对照组抗体水 平显著高于实验组。但攻击5 d后,实验组抗体水平明显升高。结论vUTALacVP2和 VPO在 CEF细胞中实现了高 效表达,但重组疫苗的保护率低于常规疫苗。

HIV-1 env基因在重组鸡痘病毒中的表达

在以鸡痘病毒复制非必需区TK基因为侧翼构建的载体 (插入有 16个串联的突变型痘苗病毒P7 5启动子和牛痘病毒A型包涵体晚期启动子及LacZ报告基因 )中的复合启动子下游 ,分别插入编码人免疫缺陷病毒(HIV)Ⅰ型外膜蛋白的env基因和中国株HIV 1gp12 0基因 ,通过与野生型鸡痘病毒的同源重组 ,X gal显色挑斑 ,获得 2株重组病毒vUTA - 2f- 16LE和vUTA - 2f- 16LG。经Dot-ELISA、免疫荧光试验、SDS -PAGE和Westernblot检测表明 ,2株重组病毒均能表达gp16 0和gp12 0 ,相对分子质量分别为 16 0 0 0 0和 12 0 0 0 0。经小鼠免疫试验其血清中抗gp12 0抗体A值和脾脏CD4+ /CD8+ T淋巴细胞比值均高于对照组 (P <0 .0 1) ,说明由重组病毒表达的Env蛋白和Gp12 0蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。

狂犬病毒CTN株糖蛋白重组鸡痘病毒与核酸疫苗的联合免疫

目的 构建狂犬病毒糖蛋白重组鸡痘病毒 ,研究联合运用重组病毒与同一抗原核酸疫苗对小鼠的免疫效果 ,为狂犬病疫苗的研究提供基础。方法 以中国鸡痘病毒疫苗株 2 82E4为基础构建的表达载体pUTA 2的ATI·P7.5复合启动子下游 ,插入狂犬病毒CTN 181株糖蛋白基因 ,构建了重组转移载体pUTA RgC。以脂质体转染法将pUTA RgC转染至已感染鸡痘病毒 2 82E4株 (FPV) 2～ 3h的鸡胚成纤维 (CEF)细胞中。待细胞出现明显病变后收获病毒 ,用BrdU进行连续 3次加压筛选 ,挑取蚀斑毒株、纯化、扩增 ,间接免疫荧光鉴定。用重组鸡痘病毒vUTA RgC单独及与核酸疫苗联合免疫小鼠 ,在细胞及体液免疫 ,攻毒保护水平评价所构建的重组病毒及联合免疫效果。结果 间接免疫荧光结果表明已成功构建重组鸡痘病毒 ,免疫后能诱导机体产生细胞与体液免疫 ,并能抵抗标准攻毒株的攻击 ,联合免疫效果较为理想。结论 获得一株能够表达狂犬病毒糖蛋白的vUTA RgC ,并证明有一定的免疫原性 。

新城疫病毒HN基因与鸡贫血病病毒VP3基因对小鼠黑色素瘤的联合抑制效应

在 C57BL/6小鼠的左后肢肌肉注射脂质体包裹的含新城疫病毒 HN基因和鸡贫血病病毒 VP3基因的重组质粒。 2周后 ,在左后肢相同部位皮下接种 B16黑色素瘤细胞 2× 10 5个 ,致瘤 2、10 d后 ,分别肌注相同的重组质粒 .通过细胞毒 T淋巴细胞和自然杀伤细胞 (NK)以及小鼠血清中唾液酸含量的测定 ,探讨新城疫病毒抑瘤的机制以及新城疫病毒 HN基因与鸡贫血病病毒 VP3基因的协同抑瘤效应。结果表明 ,与对照组相比 ,注射含 HN基因和 VP3基因的重组质粒可使荷瘤鼠的肿瘤体积缩小。用新城疫病毒或含新城疫病毒 HN基因重组质粒治疗的荷瘤鼠 ,NK活性、CTL 活性明显高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,血清中唾液酸含量低于对照组 ,但差异均不显著 (P >0 .0 5 )。从而证明新城疫病毒 HN基因能够增强小鼠对移植瘤的免疫杀伤力 ,是新城疫病毒发挥抗肿瘤作用的主要功能性基因。

vUTAL3CP1重组载体疫苗与pVIRIL18P1 DNA疫苗在猪体内的免疫原性研究

目的评价本课题组构建的共表达FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因以及免疫辅助基因的重组鸡痘病毒vUTAL3CP1和重组DNA疫苗pVIRIL18P1在猪体内诱导特异性体液免疫和细胞免疫的能力。方法将上述2种疫苗采用4种不同的组合方式单独或联合给猪进行肌肉注射,用ELISA方法和中和实验检测猪产生的抗体水平,T淋巴细胞增殖反应、CTL反应以及T淋巴细胞亚类。结果这2种基因工程疫苗均能诱导猪产生特异性的体液及细胞免疫应答。其中单独免疫组vUTAL3CP1/vUTAL3CP1的效果最好,其诱导的抗体水平已接近于常规灭活疫苗,而细胞免疫水平则比后者高得多。联合免疫组中vUTAL3CP1/pVIRIL18P1可以诱导比vUTAL3CP1/vUTAL3CP1更高的CTL杀伤活性,但体液免疫水平略低。结论证实了这2种基因工程疫苗在猪体内均有良好的免疫原性。同时初步筛选出vUTAL3CP1/vUTAL3CP1和pVIRIL18P1/vUTAL3CP1组等较佳的免疫策略,为下一步的攻毒保护试验奠定了基础。

痘苗病毒高效表达载体的构建研究

构建了能使重组痘苗病毒在感染早期和晚期高效表达外源基因的痘苗病毒载体，表达效率高于迄今报道的任何一个痘苗病毒载体。应用这种新型痘苗病毒载体表达氯化乙酰转移酶（ＣＡＴ），１０６感染细胞中的最高表达量达６０μｇ左右，占细胞总蛋白的１８％。在病毒感染早期，突变型Ｐ７．５启动子表达ＣＡＴ的量比天然的Ｐ７．５启动子高７倍。

共表达VP3与hIL-18基因真核重组质粒的构建及对人结肠癌细胞的影响

先将鸡贫血病毒VP3基因插入真核表达载体pVAX1的多克隆位点,再将pIRES1载体上的IRES启动子及新霉素基因一同切下插入pVAX1的VP3基因下游,然后切下新霉素基因,将hIL-18基因插入其中,构建成pVVP3IL-18,将pVVP3IL-18转染Hela细胞。间接免疫荧光表明,在细胞膜和细胞浆观察到了特异的黄绿色荧光,证明表达了hIL-18。pVVP3IL-18转染人结肠癌细胞HCT-116后,经AO/EB染色及电镜观察,可见大量细胞凋亡。说明真核重组质粒pVVP3IL-18可在HeLa细胞中表达,并可在体外诱导人结肠癌细胞HCT-116凋亡。

利用中国流行株HIV-1 Gag重组痘苗病毒与核酸疫苗免疫的新程序

目的 将中国流行株ＨＩＶ－１ Ｇａｇ基因在痘苗病毒中表达，以重组痘苗病毒与核酸疫苗混合免疫，进 而研制艾滋病疫苗。方法 将中国流行株ＨＩＶ－１ Ｇａｇ基因片段插入到ｐＪ３８载体启动子下游，经同源重组和血凝素 阴性空斑筛选重组痘苗病毒，经 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和 Ｗｅｓｔｅｒｎ检测目的蛋白。以重组痘苗病毒与核酸疫苗进行小鼠免 疫试验，淋巴细胞转化实验，ＣＩＬ，ＣＤ＋４；ＣＤ＋８细胞计数及细胞免疫和体液免疫水平检测。结果 重组痘苗病毒ｖＪ３８ Ｇａｇ具有良好的免疫原性，与２ｒＶＶ－ＤＮＡ混合免疫效果更好。结论 重组痘苗病毒 ｖＪ３８ Ｇａｇ能够表达Ｇａｇ蛋白并诱 导机体产生细胞免疫和体液免疫。

高致病性禽流感的流行及其预防控制

禽流行性感冒（简称禽流感，Avian influenza，AI）也称禽流感综合征，是由A型流感病毒（Avian influenza vires，AIV）引起的急性、高度致死性、烈性传染病。该病已被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。AIV依据其外膜血凝素（Hemagglutinin，H）和神经氨酸酶（Neuraminidase，N）抗原性的不同，目前至少可分为15个H亚型（H1～H15）和9个N亚型（N1-N9）。由H5和H7亚型毒株（以H5N1和H7N7为代表）所引起的禽类疾病称为高致病性禽流感（Highly pathogenic avian influenza，HeM），其发病率和病死率都很高，危害极大。

人免疫缺陷病毒I型 p24gag 基因的重组与表达

将编码人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）衣壳蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４，并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达，产物为３０ｋＤａ的ｓ１９－ｐ２４融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组ｐ２４蛋白均与抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ－１阳性血清发生特异性反应，具有较好的抗原性。

HIV-1gag/IFNα-2b表达产物的生物活性研究

目的 :将艾滋病病毒核心蛋白 (gag)与干扰素 (IFNα - 2b)融合基因表达的融合蛋白作为免疫原免疫小鼠 ,动态观察小鼠的体液免疫、细胞免疫与CTL应答。方法 :将IFNα - 2b基因片段插入到gag基因的nt5 31位点 ,经脂质体转染与血凝素阴性蚀斑筛选 ,挑出重组痘苗病毒。经SDS -PAGE和Westernblot鉴定表达产物。以小鼠为实验对象 ,用重组痘苗病毒vJ38gag/IFNα - 2b免疫小鼠 ,用ELISA方法检测血清IgG抗体含量。用流式细胞仪测定小鼠外周血CD+ 4 、CD+ 8T淋巴细胞计数。 3H -TdR掺入法检测细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性。结果 :血清IgG抗体含量逐渐增高 ,实验组与对照组比较差异有显著性意义 (p <0 .0 5 )。CD+ 4 、CD+ 8T淋巴细胞计数、CTL检测实验组与对照组比较差异均有显著性意义 (p <0 .0 5 )。结论 :重组痘苗病毒vJ38gag/IFNα - 2b能增强小鼠的体液免疫、细胞免疫和CTL应答。IFNα - 2b可以作为免疫佐剂增强机体的免疫状态。

高效痘苗病毒表达载体的构建

构建出能使重组痘苗病毒在感染早期和晚期高效表达外源基因的痘苗病毒载体。应用这种新型的痘苗病毒载体表达氯化乙酰转移酶(CAT),10~6感染细胞中的最高表达量达60μg左右,占细胞总蛋白的18％。在病毒感染早期,突变型P7.5启动子表达CAT的量比自然型P3.5启动子高7倍。

分离型痘苗病毒表达载体的构建及HIV-1 gag p17-24的表达

目的:探索荧光蛋白作为报告基因以及His·Tag作为纯化标签在重组痘苗病毒表达系统中的应用.方法:将N-端融合His·Tag基因序列,插入痘苗病毒表达载体pSFJ2-16,并在其多克隆位点下游装入带有巨细胞病毒(CMV)启动子的突变型荧光蛋白基因(GFP),构建成N-端融合His·Tag并带有荧光蛋白报告基因的分离型痘苗病毒表达载体.再从pET-28中切出C-端融合His·Tag及多克隆位点序列,并与CMV-FP基因一同装入pSFJ2-16,构建成C-端融合His·Tag的分离型痘苗病毒表达载体.将人免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)核心蛋白(gag)p17-24基因分别插入上述载体,并筛选出重组病毒.结果:实验表明,重组病毒表达了gag蛋白.结论:将His-Tag的纯化标签加入到通用型痘苗病毒表达载体中用于纯化表达的目的蛋白,该方法是可行的.荧光蛋白基因作为一个筛选标记基因应用于痘苗病毒载体系统还有待进行进一步研究.

HIV－1外膜（env）基因在重组痘苗病毒中的高效表达

应用重组痘苗病毒作载体，在ＡＴＩ、Ｐ７．５突变型早期启动子控制下，高效表达了（经定点突变去除一处早期终止信号的）ＨＩＶ－１ｅｎｖ基因。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证明，晚期启动子活性强的ｐＳＦＪ２－３８能更高效地表达ｅｎｖ基因。经Ｌｅｎｔｉｌ－Ｌｅｃｔｉｎ提取以及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后的激光扫描测定结果，在１０７个感染细胞中可产生５０－７０μｇ的Ｅｎｖ蛋白。

HIV-1Gag蛋白在大肠杆菌和重组杆状病毒系统中的高效表达及通用型温控原核表达载体的构建

将中国株HIV－1B亚型的gag全基因序列，克隆到杆状病毒表达载体pfastbacI中，构建了重组质粒pfastGag，利用细菌／杆状病毒表达系统筛选重组杆状病毒，在昆虫细胞中高效表达了HIV－1Gag蛋白。通过改造原核表达载体pBV220和pET28，构建了一种新的通用型温控原核表达载体质粒pVV5，该载体携带PrPl串联温控启功子及His—Tag纯化标签，利于目的蛋白表达与纯化。将HIV－1gag基因的1148一1857编码序列，分别插入到pVV5b、pET28b的相应位点，构建了重组表达质粒pEG1b、pEG7b，二者在不同受体菌中，表达重组蛋白的量分别占全菌体蛋白总量的42％和28％。利用IMAC金属螯合层析柱，对包涵体中的重组p24蛋白进行纯化，纯度超过80％；纯化后的重组蛋白可与HIV－1型标准阳性血清发生较强的免疫学反应。

痘苗病毒载体研究进展

制备高活性的真核蛋白，必须使用哺乳动物细胞，痘苗病毒为这一工作提供了简便、实用的工具．痘菌病毒宿主范围广，无致癌性，插入长达２０多ｋｂ的外源基因后仍有感染性，能够高效表达外源蛋白，有效地加工表达产物．而且，痘菌病毒的表达产物可刺激机体免疫系统产生良好的体液免疫和细胞免疫．