青虾高血糖激素基因全长cDNA序列的克隆及表达分析

本研究首次克隆了青虾(Macrobrachium nipponense)高血糖激素(crustacean hyperglycemic homone,CHH)基因全长cDNA序列,并使用荧光定量PCR技术首次检测了CHH基因在青虾不同组织中的表达。青虾CHH基因cDNA全长1 017 bp,包括241 bp的5′UTR,408 bp的开放阅读框(ORF),355 bp的3′UTR,开放阅读框编码135个氨基酸。成熟肽包含6个CHH家族中位置保守的Cys残基。青虾CHH成熟肽C端为GK,确定为ES型CHH基因。蛋白相似度比对显示,所分离的青虾CHH被归为CHH家族I型肽。系统进化树分析表明,青虾CHH多肽与罗氏沼虾聚在一起,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,CHH基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量由高到依次为眼柄、精巢、腹神经节、脑、肠、肝、心脏、卵巢。以卵巢为参照其表达量设为1时,眼柄与精巢CHH基因表达量分别为卵巢的500倍和250倍,由此推测CHH基因可能与雄性生殖过程相关。

一个镜鲤家系的遗传多样性及经济性状的遗传连锁分析

本试验在一个镜鲤家系中,随机选取68尾作为实验鱼,在测量体重、体长、全长等数量性状的同时,利用15个微卫星分子标记对其进行遗传检测,共检测到40个等位基因,每个基因座的等位基因数为1～4个不等,平均等位基因2.66个,片段长度在132-551之间,有效等位基因数(Ne)为1.3721～3.8278,平均观察杂合度(Ho)为0.3235～1.0000,平均期望杂合度(He)为0.3464～0.7442,平均多态信息含量(PIC)为0.4754。结果表明:该镜鲤家系的遗传多样性处于中等水平,但在较大的选择压力下已严重偏离Hardy-Wenberg平衡。利用SPSS程序下的GLM过程对15个微卫星位点与主要经济性状的相关性进行分析,结果发现:HLJ021、HLJ354、HLJ551共3个微卫星位点对镜鲤体重显著影响(p<0.05),其中,位点HLJ021、HLJ044、HLJ551、HLJ1330还对体高存在显著影响(p<0.05),HLJ354对体长、体厚、全长存在显著影响(p<0.05)。本研究所鉴定的与生长性状相关的标记可为德国镜鲤分子标记辅助育种提供重要信息。

宜兴地区8个青虾种群生长性状和遗传多样性分析

对宜兴地区8个(东氿、西氿、团氿、临津荡、马公荡都山荡、油车水库、横山水库、阳山荡)青虾种群生长性状进行比较分析,采用D-loop测序技术对8个青虾种群的遗传多样性进行评估。结果表明,西氿和阳山荡种群的体质量、全长、头胸甲宽等性状,显著优于其他种群(P<0.05);单倍型多样性为0.7438(横山水库)到0.9881(西氿),核苷酸多态性为0.009963(团氿)到0.021553(马公荡都山荡),宜兴地区青虾种群多样性总体较好。进化树分析结果表明,马公荡都山荡种群与其他7个种群的进化关系较远;横山水库种群和团氿种群间固定指数(F_(st))为0.25764,2个种群间的遗传分化极高;临津荡种群和团氿种群、马公荡都山荡种群和团氿种群F_(st)分别为0.16443、0.16129,显示这些种群的遗传距离存在较大分化。

青虾幼虾发育时期性腺发育组织学研究

采用组织切片及类固醇激素含量测定等方法,研究青虾Macrobrachium nipponense幼虾发育第1~31d的精巢、卵巢及促雄腺发育的起始时间、发育过程及成熟时间。结果表明：青虾幼虾发育到第10d（PL10）时促雄腺呈索状结构开始发育,随后经历增殖期（PL10）、合成期（PL13）和分泌期（PL19）3个发育阶段发育成熟,形成完整的促雄腺。青虾精巢和卵巢均在幼虾发育第13d（PL13）开始发育,精巢形成不规则排列的精原细胞,而卵巢生殖上皮开始分化为椭圆或多边形的卵原细胞。精巢经精原细胞期（PL13）、精母细胞期（PL16）、精细胞期（PL19）和精子期（PL22）4个发育阶段成熟,此时成熟的精巢生精小管内充满成熟的精子。卵巢经卵原细胞期（PL13）、初级卵母细胞期（PL16）、次级卵母细胞期（PL16）和卵子期（PL19）4个时期发育成熟,此时卵巢充满成熟卵子。从PL1到PL22,睾酮分泌量逐渐增加,维持在稳定水平至PL25后逐渐下降;从PL1到PL19,17β-雌二醇的分泌量逐渐增加,维持在稳定水平至PL25后逐渐下降。本研究显示：促雄腺与精巢发育过程均持续10d,但促雄腺早于精巢3d开始发育和成熟,这可为性别和生殖相关基因的筛选及性别调控机制的研究提供参考。

养殖密度对饵料驯化期细鳞鱼稚鱼生长的影响

研究了养殖密度对饵料驯化期细鳞鱼稚鱼生长和存活的影响。试验分别设置了4个养殖密度（1000、5000、10000、15000尾／m^2），试验期间依次投喂水蚯蚓→水蚯蚓、软颗粒饲料→软颗粒饲料→软颗粒饲料、硬颗粒饲料→硬颗粒饲料的驯养方法，逐步从动物性饵料转化为人工配合颗粒饲料喂养。经过40d的试验发现，养殖密度对细鳞鱼稚鱼的存活率具有显著性影响，但养殖密度对肥满度（CF）、特定生长率（SGR）和变异系数（CV）的影响并不显著。各密度组的死亡率分别为32．8％，28．7％，16．0％和19．3％，肥满度为0．85—0．97，SGR平均值为4．40％，体重变异系数为11．59％～16．89％，体长的变异系数为37．05％～48．48％。研究结果表明饵料转化期的细鳞鱼稚鱼（2．80±0．01cm）完全可以在较高的养殖密度下进行培育。

青虾冷休克蛋白Y-box编码基因的cDNA全长克隆与表达分析

为研究冷休克蛋白Y-box基因在青虾应答环境胁迫过程中所起的调控作用,实验应用RACE PCR技术首次克隆了青虾的冷休克蛋白Y-box基因全长c DNA序列,并利用在线软件对其序列特征进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR技术对其在青虾不同组织及环境胁迫过程中的表达变化特征进行分析。青虾冷休克蛋白Y-box基因c DNA全长1501 bp,包括84 bp的5′末端非翻译区(UTR),876 bp的开放阅读框(ORF),541 bp的3′UTR,开放阅读框编码291个氨基酸。氨基酸相似度比对显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因富含高度保守的冷休克结构域。系统进化树分析显示,青虾冷休克蛋白Y-box基因与水蚤等节肢动物冷休克Y-box聚类一支,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,冷休克蛋白Y-box基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在肝胰腺组织中最高,使用荧光定量PCR检测青虾冷休克蛋白Y-box基因在低温胁迫和恢复条件下在肝胰腺中的m RNA时空表达情况,结果显示,与对照组相比冷休克蛋白Y-box在肝胰腺中的表达量分别在低温和低氧胁迫3,6和12 h出现了显著上调,而在恢复刺激后其表达量与对照组差异不显著。此外,本实验对Y-box进行了原核表达,为进一步研究Y-box基因的功能奠定了基础。

青虾Ran基因的克隆、表达及其在卵巢发育中的功能

本研究应用RACE技术克隆了青虾(Macrobrachium nipponensis)Ran(Ras related nuclear protein,Ras相关核蛋白)基因全长cDNA序列,该基因cDNA全长1191 bp,包括218 bp的5'UTR,648 bp的开放阅读框(ORF),405 bp的3'UTR,编码215个氨基酸。青虾Ran基因属于P-loop-NTPase超级家族,拥有PTZ00132跨结构域,多肽分子量约为24.57 kDa,理论等电点7.13。系统进化树分析表明,在动物界进化中非常保守的青虾Ran多肽与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)聚为一支,具有最近的亲缘关系。使用荧光定量PCR技术检测Ran基因在成体青虾不同组织和卵巢不同发育期的表达差异,结果显示,Ran基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在卵巢中最高,是精巢表达量的7~8倍;随着卵巢的发育,Ran基因的表达水平呈现上升趋势,在卵巢消退期又恢复到较低水平。RNA干扰后,实验组Ran基因表达量显著低于对照组(P<0.05),同时卵巢发育关键基因Vg(vitellogenin)在卵巢中的表达量也显著低于对照组(P<0.05),推测Ran基因参与雌性卵巢发育过程并对Vg基因的表达起到调控作用。

青虾精(卵)母细胞特有因子Gtsf1基因的克隆及其时空表达分析

为了研究青虾性早熟现象,在实验室构建的青虾精卵巢表达谱中发现一个Gtsf1同源EST序列,采用RACE技术克隆获得青虾Gtsf1基因cDNA序列长349 bp(GenBank登录号:KR349325),开放阅读框(Open reading frame,ORF)为240 bp,编码79个氨基酸。生物信息学分析预测青虾Gtsf1蛋白包含1个zf-U11-48K结构域,并发现该蛋白无信号肽,属于非分泌蛋白。系统进化树分析表明青虾Gtsf1蛋白与昆虫纲的蝽类(Lygus hesperus)亲缘关系最近。组织表达分析结果显示,Gtsf1基因在性腺中表达很高,特别是在卵巢中表达最高(为精巢的6倍),其他组织中表达极低。卵巢不同发育时期表达结果发现,发育初期Gtsf1基因表达水平较低,随着卵巢的发育,该基因的表达水平呈现显著上升趋势(P<0.05),在成熟期达到最高峰,在消退期显著下降并恢复到较低水平(P<0.05)。胚胎和胚后不同发育时期结果显示,Gtsf1基因在胚胎发育早期表达水平较高,囊胚期时显著升高并达到峰值(P<0.05),从原肠期显著下降直至变态后第10天该基因表达水平维持较低水平(P<0.05)。以上研究结果表明Gtsf1基因与生殖密切相关,特别是在卵巢发育过程中有关,且呈正相关趋势。同时,Gstf1基因可能主要参与青虾胚胎早期发育的调控。研究首次在甲壳动物中克隆获得Gtsf1基因,并分析Gtsf1基因在青虾中的时空表达模式,研究结果将为进一步研究青虾Gtsf1基因功能和青虾性腺发育调控规律奠定基础,也为其他甲壳动物的生殖相关研究提供参考。

不同碳氮比对生物絮团形成及对日本沼虾生长、抗氧化酶和消化酶的影响

为了研究不同碳氮比对生物絮团形成及对日本沼虾(Macrobrachium nipponense)生长、抗氧化酶和消化酶的影响,设置5个不同实验组[对照组(不做任何添加),碳氮比10组(C/N10)、碳氮比15组(C/N15)、碳氮比20组(C/N20)和碳氮比25组(C/N25)],每组设三重复;将初始体重(0.25±0.03)g的日本沼虾置于不同碳氮比的玻璃缸(30 cm×40 cm×100 cm)中,进行50d的饲养实验。研究结果表明,随着碳氮比升高,生物絮团含量有上升趋势,生物絮团含量C/N20>C/N25>C/N15>C/N10,C/N20生物絮团最多,生物絮团体积和总固体悬浮物分别为(328.67±7.09)mL/L和(40.33±1.53)mg/L而C/N10几乎没有生物絮团产生,C/N15和C/N25有少量生物絮团,但含量显著低于C/N20。对照组的氨氮和亚硝酸氮浓度持续升高,C/N10和C/N25的氨氮和亚硝酸氮浓度有较大波动,先升高后降低,随后又有升高的趋势,氨氮和亚硝酸氮浓度分别高于2和1.5 mg/L,C/N15和C/N20的氨氮和亚硝酸氮浓度在整个养殖期间都维持在较低水平,氨氮和亚硝酸氮浓度分别低于0.35和0.6 mg/L,且无剧烈波动。增重率依次是C/N20>C/N25>C/N15>C/N10>Control,C/N10、C/N15、C/N20和C/N25分别比对照组高出29.69%、50.22%、89.52%和75.98%(P<0.05);特定生长率依次是C/N20>C/N25>C/N15>C/N10>Control,C/N10和C/N15、C/N20和C/N25分别比对照组高出18.41%、24.69%、42.26%和33.89%(P<0.05);在抗氧化酶方面,谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性C/N20>C/N25>C/N15>C/N10>Control,与对照组相比,C/N10、C/N15、C/N20和C/N25分别高出1.70%、21.42%、43.19%和31.49%(P<0.05);超氧化物歧化酶(SOD)活性C/N20>C/N25>C/N15>C/N10>Control,与对照组相比,C/N10、C/N15、C/N20和C/N25分别高了19.34%、35.26%、73.35%和47.12%。在消化酶方面,淀粉酶活性依次是C/N20>C/N15>C/N25>Control>C/N10,与对照组相比,C/N15、C/N20和C/N25分别高出68.09%、231.91%和42.55%(P<0.05);脂肪酶活性依次是C/N20>C/N25>C/N15>Control>C/N10,与对照组相比,C/N15、C/N20和C/N25分别高出2.86%、25.45%和23.12%(P<0.05);胰蛋白酶活性依次是C/N20>C/N25>C/N15>C/N10>Control,与对照组相比,C/N10、C/N15、C/N20和C/N25组分别高出12.98%、14.52%、36.45%和24.63%(P<0.05)。研究结果提示,日本沼虾在生物絮团养殖模式下,当碳氮比达到20时能有效产生生物絮团,降低水体氨氮和亚硝酸氮浓度并显著提高日本沼虾的生长性能、肠道消化酶活性和肝胰腺抗氧化酶活性。

青虾transformer-2基因RNA干扰规律的研究

通过对青虾性别调控相关基因transformer-2(tra-2)的RNA干扰规律进行研究,探讨了tra-2基因RNA干扰的最适注射部位、注射剂量、干扰效果以及干扰规律等。通过对青虾肌肉、心脏、围心腔和眼柄基部注射比较发现,围心腔注射死亡率最低,适宜RNA干扰研究。采用4μg/g的dsRNA剂量进行时间依赖性干扰试验,RT-PCR检验注射后第1,7,14天的卵巢tra-2表达量,结果显示第7天基因表达量出现显著降低(P<0.05)。不同剂量水平(0.4μg/g、4μg/g以及12μg/g)干扰研究发现,0.4μg/g dsRNA没有干扰结果,4μg/g和12μg/g剂量的干扰效果均显著。与4μg/g的剂量相比,12μg/g的dsRNA能在较短时间内起到明显的干扰效果,且能持续较长的时间,表明干扰规律会随着剂量的改变而变化。但两组tra-2的最低表达量分别为正常水平的23%和21%,无显著差异(P>0.05)。

酶解制备日本沼虾游离精子方法的研究

为了获得数量多且存活的游离青虾精子,首次采用胰蛋白酶消化日本沼虾精荚的方法,获得了游离日本沼虾的精子。通过观察游离精子形态,并经台盼蓝染色,以每克精荚所获得形态正常、结构完整且不被染色的存活精子数为依据,探究胰蛋白酶处理的最佳条件。在p H 7.1的条件下,设计三因素四水平正交试验,设置不同酶浓度(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)、处理时间(5 min、10 min、15 min、20 min)和处理温度(30℃、35℃、40℃、45℃),根据正交试验结果确定酶处理最佳反应条件。结果表明,酶浓度对获得游离精子影响最大,其次是处理温度和处理时间。酶处理的最适条件为:酶浓度0.8%,处理时间10 min,处理温度40℃。经优化验证试验,表明上述理论组合确为最佳组合。本研究通过酶解法获得较多数量的存活游离精子,为进一步研究日本沼虾精子提供了获得游离精子的方法。

X射线灭活活体日本沼虾精子的初步研究

为检测X射线对日本沼虾精子的灭活效果,利用X射线对雄性日本沼虾进行不同时间的照射处理,将处理后的雄虾与刚完成生殖脱壳的雌虾交配。待雌虾产卵后,计数雌虾抱卵天数,并在显微镜下观察卵的畸形情况。X射线管照射强度为100 k V,5 m A,源距10 cm,照射时间为0、30、60、90、120 min。结果发现：照射30 min组的抱卵天数及卵的畸形率较0 min组无变化,卵的畸形率为0,卵能正常发育至孵化出膜。随着照射时间的增加,在30-90 min之间,雌虾抱卵天数逐渐减少,且所抱卵的畸形率呈上升趋势。照射120 min组的抱卵天数较90 min组变化不大,卵的畸形率达100%。在本试验照射时间范围（0-120 min）内,灭活日本沼虾精子遗传物质的最佳照射时间为90-120 min。

日本沼虾几丁质酶1C（MnCht1C）基因的克隆及表达分析

本研究从日本沼虾精巢均一化cDNA文库中筛选到一条MnCht1C表达序列片段（expressed sequence tags,EST）,该序列具有完整的基因编码区,编码区长度为1 473 bp,编码490个氨基酸。MnCht1C编码的蛋白质具有完整的几丁质酶结构,N端的前23个氨基酸为信号肽,第24-406位氨基酸序列为几丁质酶催化结构域（catalytic domain）,第407-433位氨基酸序列为Ser/Thr富含区（S/T-rich linker）,其作用在于连接催化结构域与几丁质结合结构域。qPCR分析MnCht1C在日本沼虾各组织和各发育阶段表达情况,研究发现其主要在肝胰腺、肠、眼柄、表皮、精巢5种组织中表达;幼体发育时期不表达,而直至变态时期才开始表达。MnCht1C在日本沼虾整个蜕壳周期的表达呈波动性,蜕壳中期表达水平最高,随着蜕壳这一生理过程的完成,其表达水平也相应地下降直至蜕壳间期无表达水平检出,随着新一轮蜕壳的进行,其表达水平又开始逐渐升高。本研究结果为研究几丁质酶基因在日本沼虾和其他甲壳动物蜕壳及生殖发育中的作用提供参考。

高温胁迫对日本沼虾热休克蛋白基因的表达、抗氧化酶活力及组织结构的影响

为探究日本沼虾(Macrobrachium nipponense)应对高温胁迫的响应机制,设置了水温对照组(20±0.5)℃和高温组(30±0.5)℃,溶氧浓度(6.5±0.5)mg/L,分别在高温胁迫0 h、12 h、24 h、36 h、48 h测定了日本沼虾肝胰腺和鳃组织中热休克蛋白21(heat shock protein 21,HSP21)、热休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)、热休克同源蛋白70-3(heat shock protein cognate 70-3,HSC70-3)和热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)基因的表达,相关抗氧化酶——超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性以及组织结构的变化。结果表明,高温胁迫下肝胰腺和鳃组织中的4个热休克蛋白基因均被诱导表达上升,其中HSC70-3基因表达上升最为显著;同时,肝胰腺中的基因表达上升趋势比鳃中的基因表达趋势更为明显。高温胁迫下相关抗氧化酶活力均发生不同程度的变化,肝胰腺中SOD、GST和CAT酶活力均有显著上升趋势,而GPX酶活力仅有轻微变化;鳃组织中的SOD酶活性显著低于对照组(P<0.05),GST、GPX和CAT酶活性显著高于对照组(P<0.05)。肝胰腺和鳃组织结构均发生变化,肝胰腺组织中分泌细胞及内部转运泡体积增大,鳃组织结构层状上皮轻微弯曲,血细胞排列紊乱等。综上所述,高温胁迫激活了日本沼虾抗氧化系统,并诱导了热休克蛋白基因的表达上升,其中HSC70-3基因可能在日本沼虾的耐热性中起重要作用。高温胁迫下抗氧化酶活力的变化可能对于避免氧化损伤至关重要。本研究旨在通过了解日本沼虾应对高温胁迫的响应机制从而为日本沼虾的健康养殖提供参考。