抗HER2人源化单克隆抗体体内外抗肿瘤活性评价方法的建立

目的建立抗HER2人源化单克隆抗体体内外抗肿瘤活性的评价方法。方法利用HER2表达阳性的人乳腺癌细胞系BT474建立抗HER2单抗体内外活性评价方法,对上海市细胞工程重点实验室制备的抗HER2人源化单抗的体外生物学活性、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性、对BT474荷瘤裸鼠的治疗作用及荷瘤裸鼠瘤体组织H E染色及免疫组化检测rh HER2mAb的分布与Herceptin进行了比较研究。结果建立了完整的该人源化单抗的体内外活性评价方法,测评结果显示,上海市细胞工程重点实验室制备的抗HER2人源化单抗在体外有效抑制BT474细胞增殖,与Herceptin体外生物学活性相似,EC50分别为148.3和145.9ng/ml;可通过ADCC效应杀伤BT474细胞,与Herceptin的EC50值一致,分别为185.0和183.9ng/ml;抑制BT474裸鼠异种移植模型肿瘤的生长,与无关抗体治疗组或PBS治疗组相比具有统计学差别(P<0.05),与Herceptin抑制能力接近,4mg/kg剂量组相比没有统计学差别;免疫组织化学检测显示抗体集中分布于肿瘤组织。结论建立的评价方法可对抗HER2单抗的抗肿瘤活性进行客观准确的评价,国内研制的抗HER2人源化单克隆抗体与进口同种抗体相比具有相同的体内外活性。

肝癌细胞膜上转铁蛋白受体和去唾液酸糖蛋白受体数量的变化

目的:研究肝癌细胞膜摄取转铁蛋白受体的变化。方法：采用免疫组化及配体受体结合法分别测定正常肝脏、肝癌组织及癌旁肝组织转铁蛋白受体及去唾液酸糖蛋白受体的含量。结果：肝癌组织中转铁蛋白受体的含量高于癌旁及正常肝组织，而去唾液酸糖蛋白受体却明显低于癌旁及正常肝组织。结论：该变化有利于肝癌细胞对转铁蛋白的有效提取，也增加了肝癌细胞对高度唾液酸化的转铁蛋白的相对特异性摄取。

人肝癌细胞与自体激活B淋巴细胞融合制备肿瘤疫苗

目的：观察３例人肝癌组织细胞与其自体激活Ｂ淋巴细胞融合后融合细胞表面分子ＧＰ７５和免疫相关分子ＭＨＣⅠ、ＭＨＣⅡ和Ｂ７的表达情况，以便为肿瘤疫苗向临床试验过渡提供人体细胞的实验依据。方法：应用聚乙二醇（ＰＥＧ）法将人肝癌细胞与其自体激活Ｂ淋巴细胞融合，利用流式细胞仪观察融合细胞表面分子ＧＰ７５和免疫相关分子ＭＨＣⅠ、ＭＨＣⅡ和Ｂ７的表达情况。结果：融合细胞表面不仅表达肝癌细胞表面的ＧＰ７５分子，还可表达共刺激分子Ｂ７及ＭＨＣⅠ、ＭＨＣⅡ。结论：人肝癌细胞与其自体激活的Ｂ淋巴细胞融合后的杂交瘤细胞既能表达肝癌细胞表面分子ＧＰ７５，又可表达共刺激信号分子。

钾通道阻断剂和一氧化氮对肺动脉平滑肌细胞钾电流的作用

目的 :研究钾通道阻断剂、一氧化氮 (NO)对继代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)钾电流 (IK)的作用。 方法 :使用全细胞膜片钳技术观察继代培养大鼠 PASMC IK 及钾通道阻断剂格列本脲 (Gli) ,四乙胺 (TEA) ,4 -氨基吡啶 (4- AP)和 NO供体 S-亚硝基乙酰青霉胺 (SNAP)对其的作用。 结果 :继代培养大鼠 PASMC较急性分离者之 IK 明显降低。 4 - AP和高浓度TEA显著降低继代培养大鼠 PASMC之 IK,SNAP显著增加继代培养大鼠 PASMC之 IK。结论 :继代培养大鼠 PASMC钾通道特性发生改变 ,但通道阻断剂和 NO仍能显著改变其活性。

B细胞融合人肝癌细胞疫苗^(60)Co照射后生长及表型的观察

目的：探讨Ｂ细胞与人肝癌细胞的融合细胞经６０Ｃｏ照射后的生长和免疫原性相关表型的变化。方法：体外照射后观察融合细胞生长曲线和软琼脂集落形成；体内采用裸鼠成瘤试验，观察体外生长和动物体内成瘤性，应用流式细胞仪检测照射后融合细胞ＭＨＣ－Ⅰ，ＭＨＣ－Ⅱ，Ｂ７及肝癌抗原（ＧＰ７５）表达，观察其免疫原性相关表型变化。结果：经６０Ｃｏ照射的融合细胞失去增殖能力，４ｄ后可见部分细胞死亡，７ｄ后几乎全部死亡。６０Ｃｏ照射后３ｄ内ＭＨＣ－Ⅰ，ＭＨＣ－Ⅱ，Ｂ７及ＧＰ７５表达无明显变化。结论：经６０Ｃｏ照射后融合细胞失去增殖能力。

细胞融合肝癌疫苗体内抗肿瘤特异性及T细胞作用的初探

目的：观察大鼠ＢＥＲＨ－２肝癌细胞与自体激活Ｂ细胞的融合细胞作为疫苗抗肿瘤作用的特异性，并观察该肝癌疫苗体内抗肿瘤作用与Ｔ细胞亚群的关系。方法：（１）应用聚乙二醇（ＰＥＧ）融合大鼠ＢＥＲＨ－２肝癌细胞与激活Ｂ细胞制备细胞融合大鼠肝癌疫苗；（２）事先经该肝癌疫苗免疫的大鼠分别接种肝癌ＢＥＲＨ－２细胞和大鼠膀胱癌ＮＢＴ－Ⅱ细胞，观察该肝癌疫苗抗肿瘤作用的特异性；（３）该肝癌疫苗免疫大鼠之前或之后，以小鼠抗大鼠ＣＤ４单抗或抗ＣＤ８单抗多次注射，以清除大鼠ＣＤ４＋或ＣＤ８＋Ｔ细胞，随后观察大鼠的成瘤性。结果：ＢＥＲＨ－２细胞不能在经细胞融合大鼠肝癌疫苗免疫的大鼠体内致瘤，而ＮＢＴ－Ⅱ细胞可致瘤；事先清除ＣＤ４＋或ＣＤ８＋Ｔ细胞的大鼠经细胞融合大鼠肝癌疫苗免疫后仍能被肝癌ＢＥＲＨ－２细胞致瘤；而经该肝癌疫苗免疫的大鼠，清除了ＣＤ４＋细胞后不能被ＢＥＲＨ－２细胞致瘤，清除了ＣＤ８＋细胞后则可被ＢＥＲＨ－２细胞致瘤。结论：细胞融合大鼠肝癌疫苗有特异性抗肿瘤作用。

抗CD20单克隆抗体联合CHOP化疗方案治疗人B细胞淋巴瘤的实验观察

目的:以人B细胞淋巴瘤裸鼠皮下移植模型为基础,研究抗CD20单克隆抗体体内、体外活性,评价该抗体联合CHOP化疗方案治疗人B细胞淋巴瘤的有效性。方法:体内实验:建立人B细胞淋巴瘤裸鼠皮下移植模型。52只荷瘤鼠随机分为5组进行实验。用TUNEL法检测肿瘤凋亡,并绘制肿瘤体积曲线和裸鼠体质量曲线。体外实验:用CellTiter96 AQueous非同位素细胞增殖试验试剂盒检测抗CD20单克隆抗体、化疗和联合化疗对Raji细胞体外杀伤作用,并绘制剂量反应曲线。结果:体内实验:鼠抗人CD20单抗组及嵌合CD20抗体组均出现大量肿瘤细胞凋亡。联合治疗组疗效最佳,与其他组相比差异有统计学意义,P<0.05。化疗组及联合治疗组体质量下降明显,与其他组相比差异有统计学意义,P<0.05。体外实验:发现鼠抗人CD20单克隆抗体及嵌合型CD20抗体均可增加Raji细胞对化疗药物的细胞毒敏感性。结论:CD20单克隆抗体对B细胞淋巴瘤具有明显的抑制作用,可以诱发大面积肿瘤细胞凋亡,能提高肿瘤对化疗药物的细胞毒敏感性,且较常规化疗毒副反应小。

肝癌组织中神经节苷脂谱改变的机理研究

目的：检测肝癌组织中唾液酸酶的活性，探讨肝癌组织中神经节苷脂谱改变（ＧＤ３含量增加）的机理。方法：以蓖麻凝集素Ⅱ与乳糖基的特异结合为基础，用神经节苷脂ＧＭ３作为水解底物包被于９６孔板，在唾液酸酶的作用下，糖链末端的唾液酸被切除而暴露出乳糖残基，用生物素标记的蓖麻凝集素与后者结合，再用ＡＢＣ法测定结合量即可检测唾液酸酶活性。结果：肝癌组织中不管是可溶性的还是膜结合性的唾液酸酶，其活性都明显低于其癌旁组织。结论：肝癌组织中神经节苷脂ＧＤ３增加的原因不仅与ＧＤ３合成酶活性的增高有关，还与其水解酶唾液酸酶活性的降低相关。

Smac在TRAIL诱导人骨肉瘤Saos-2细胞凋亡中的作用

目的 :初步研究 Smac在 TNF相关的凋亡诱导配体 (TNF- related apoptosis inducing ligand,TRAIL)诱导的人骨肉瘤 Saos- 2细胞凋亡中的作用。 方法 :观察细胞形态变化和以琼脂糖凝胶电泳分析 TRAIL 作用的 Saos- 2细胞 DNA片段 ,利用流式细胞术及细胞计数法比较 Smac或 Bcl- 2表达不同的细胞的凋亡程度 ,同时以 Western印迹半定量检测细胞胞质内Sm ac表达水平。结果 :Saos- 2细胞在 TRAIL 的作用下出现典型的凋亡样改变。在 TRAIL 作用 Saos- 2细胞时 ,Smac在胞质中的含量明显增加。在 TRAIL 作用 2 4 h后 ,Smac在 Saos- 2细胞中过表达 ,细胞凋亡率由 1 2 .7%增加到 31 .4 %。TRAIL 作用 Saos- 2细胞 4 8h后 ,转染 Bcl- 2的细胞与转染空载体的 Saos- 2细胞相比 ,凋亡率显著降低 (由 2 4 %降至 1 5 % ) ,且胞质中Sm ac的表达水平也明显降低。 结论 :在 TRAIL 诱导的凋亡中 Sm ac起促进作用 ,Bcl- 2可以通过阻止 Sm

抗CD3人源化抗体恒定区突变体的制备及其生物学活性

为了降低抗CD3人源化抗体hu12F6对T细胞的激活作用以克服首剂效应 ,构建了恒定区特定位点突变的hu12F6重链表达载体 ,将其与hu12F6的轻链表达载体共转染CHO细胞 .ELISA和RT PCR证实 ,恒定区特定位点突变的人源化抗体hu12F6m在CHO细胞中获得了表达 .竞争抑制实验证实hu12F6m具有与原鼠源抗体及hu12F6相似的特异性和亲和力 .增殖实验表明hu12F6m对T细胞的刺激作用明显弱于hu12F6 .实验结果为深入探讨hu12F6m的生物学特性奠定了基础 .

人细胞融合肝癌疫苗的制备及其融合细胞百分率的检测

手术取病人新鲜肝癌组织及部分脾脏 ,分离纯化、激活B细胞 ,应用PEG融合肝癌细胞与激活B细胞 ,经培养灭活制得肿瘤疫苗。同时测定了融合肝癌疫苗的融合率、冻存后复苏活细胞百分率。结果显示 ,3例融合细胞的融合率分别为 6 6 84 %、74 4 3%、76 5 5 % ,融合细胞经DMSO和甘油冻存后复苏活细胞百分率分别为 95 %、97%。研究表明 ,人细胞融合肝癌疫苗具有很高的融合率和冻存后复苏活细胞百分率 ,便于制备及储存 ,适合临床应用。

重组人CTLA4Ig融合蛋白体外对人T淋巴细胞功能的影响

目的 研究重组人CTIA4Ig对人T淋巴细胞功能的影响。方法 采用初次混合淋巴细胞培养、再次混合淋巴细胞培养及细胞毒实验的方法。结果 CTLA4Ig在浓度高于3mg·L-1时能有效地抑制初次混合淋巴细胞反应 (P <0 0 5 ) ,其在作用 2 4h内不能发挥有效的抑制作用 ,72h能达最大抑制效率 ;在再次混合淋巴细胞反应实验中CT LA4Ig作用后的T淋巴细胞对同一供者的外周血单核细胞的刺激表现出特异性无反应 ,而对无关供者的外周血单核细胞的刺激能产生正常的应答反应。结论 CTLA4Ig在体外能抑制T细胞的增殖 。

人CTLA4单克隆抗体的制备和鉴定

目的 :制备人的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4 (CTLA4 )的单克隆抗体。 方法 :利用蛋白纯化技术获得人CTLA4Ig蛋白免疫Balb/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞NS1融合 ,用ELISA法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,并用Western印迹和流式细胞检测仪鉴定所制备的单克隆抗体。 结果 :获得一个稳定的分泌抗人CTLA4的杂交瘤细胞株。该细胞克隆培养上清中所含的单抗能和经过PHA刺激后的人T细胞结合 ,但不能和经过PHA刺激后的小鼠T细胞结合。 结论 :利用重组人CTLA4Ig制备获得高特异性的抗人CTLA4单克隆抗体。

LTβR-Ig融合蛋白的真核表达及其体外生物学功能的研究

目的为了研究LTβR-Ig的生物学功能,构建重组的LTβR-Ig/pcDNA3.1(+)真核表达载体,在CHO细胞中表达,无血清扩大培养,并初步研究了融合蛋白LTβR-Ig的体外生物学活性。方法将鼠LTβR胞外段cDNA与人IgG1 Fc段cDNA共同克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转染CHO-K细胞表达,阳性克隆进行无血清培养,采用PtoteinA亲和层析的方法进行纯化;3[H]TdR参入法检测对细胞增殖的影响。结果经PCR和限制性酶切鉴定以及DNA测序,结果表明克隆了正确序列的LTβR胞外段序列,成功构建了重组表达质粒LTβR-Ig/pcDNA3.1,并在CHO细胞中稳定表达了LTβR-Ig的融合蛋白,证明LTβR-Ig融合蛋白能抑制混合淋巴细胞反应。结论本研究建立了能稳定表达有生物活性的LTβR-Ig融合蛋白的真核表达系统,为今后研究LTβR在移植排斥中的作用机制,及开展基因重组药物进行疾病的生物治疗奠定了基础。

一氧化氮对肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡作用的研究

目的 :研究一氧化氮 (NO)对肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)增殖和凋亡的作用。方法 :通过非核素标记细胞增殖检测试剂盒、3 H- Td R掺入、形态学、流式细胞术等方法研究 NO与 PASMC增殖和凋亡的关系。 结果 :2 5～ 5 0 0μm ol/L的 NO供体 S-亚硝基乙酰青霉胺 (SNAP)呈剂量依赖性地减少 PASMC的细胞数和 DNA合成 ,5 0 0μm ol/L的 SNAP显著减少 S期和G2 /M期的细胞比例 ,增加 G0 /G1 期的细胞比例。 10 0～ 5 0 0μmol/L的 SNAP呈剂量依赖性地增加 PASMC的凋亡率。结论 :NO可抑制 PASMC增殖并促进其凋亡。早期给予

肝细胞癌变时神经节苷脂对转铁蛋白受体介导的内吞作用的影响

目的：研究肝细胞癌变时神经节苷脂ＧＭ３和ＧＤ３的变化对转铁蛋白受体介导的内吞作用的影响及其在促进肝癌生长中所起的作用。方法：采用放射性核素标记配体受体结合法，及洗脱法测定转铁蛋白与其受体的结合以及转铁蛋白受体介导的内吞作用；用ＭＴＴ比色法测定细胞生长情况。结果：（１）ＧＭ３抑制肝癌细胞的生长，ＧＤ３则促进肝癌细胞的生长；（２）这种影响与转铁蛋白对细胞的作用直接相关；（３）此相关作用不是通过影响转铁蛋白与其受体的结合，而是通过影响转铁蛋白受体介导的内吞作用而实现的。结论：肝细胞癌变时神经节苷脂组成的变化能明显加快转铁蛋白受体介导的内吞作用，增加肝癌细胞对转铁蛋白的摄取，从而促进肝癌细胞的生长与增殖。

可溶性CD44－免疫球蛋白融合蛋白抑制肿瘤的体内生长

目的：确定是否可通过阻断透明质酸的细胞表面受体ＣＤ４４Ｈ与它的配体的结合而抑制肿瘤生长。方法：观察ＣＤ４４Ｈ和免疫球蛋白的可溶性融合蛋白（ＣＤ４４Ｒｇ）对转染并稳定表达ＣＤ４４Ｈ的人Ｎａｍａｌｗａ淋巴瘤细胞生长的影响。结果：ＣＤ４４Ｒｇ可抑制Ｎａｍａｌｗａ肿瘤细胞在裸鼠体内形成肿瘤的能力，但对该细胞的体外生长则无影响。结论：破坏ＣＤ４４Ｈ与其生理学配体之间的作用，可能成为控制肿瘤在体内生长的一种新的手段。

细胞融合大鼠肝癌疫苗制备及免疫相关表型分析

制各大鼠ＢＥＲＨ－２肝癌细胞和激活Ｂ细胞融合肿瘤疫苗并观察其免疫相关表型，为融合肿瘤疫苗应用人体提供依据。方法：应用ＰＥＧ在不同条件下，将肝癌细胞与激活Ｂ细胞融合。流式细胞仪鉴定融合细胞比例和检测ＭＨＣ－／Ⅱ、Ｂ７、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１的水平。结果：５０％ＰＥＧ－１４００介导细胞融合６０秒获得融合细胞百分比最高。与融合前ＢＥＲＨ－２细胞相比，融合细胞获得了ＭＨＣ－Ⅱ、Ｂ７、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１的表达，ＭＨＣ－Ｉ表达增加。结论：制备大鼠ＢＥＲＨ－２肝癌细胞和激活Ｂ细胞融合肿瘤疫苗的最佳条件为５０％ＰＥＧ－１４００融合６０秒。融合细胞不但表达肿瘤抗原，同时表达免疫原性相关分子。

自然杀伤细胞的独立刺激信号——CD45分子交联

目的：探讨表面分子在自然杀伤（ＮＫ）细胞活化中的信号分子作用及其机制。方法：采用多种粘附分子单抗及配体刺激ＮＫ细胞，ＥＬＩＳＡ法定量检测刺激后ＮＫ细胞释放的γ干扰素（ＩＦＮ－γ）作为ＮＫ细胞活化指标，观察各种粘附分子在ＮＫ细胞释放ＩＦＮ－γ中的信号作用。结果：单一ＣＤ４５单抗刺激即可使ＮＫ细胞活化；两种分别为ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ亚类的ＣＤ４５单抗及ＩｇＧ２ａ亚类ＣＤ４５单抗的Ｆ（ａｂ）２均体现对ＮＫ细胞的独立刺激作用。结论：ＣＤ４５分子介导的ＮＫ细胞活化与ＣＤ１６－Ｆｃ段间相互作用无关。