色谱在糖组学分析中的应用

糖组学是继基因组学和蛋白组学后发展起来的组学技术,是研究细胞、组织或生物体内糖组的组成、结构及功能的一门学科。糖组学研究对深入了解生命活动规律、疾病的预防和治疗以及药物的质控和研发具有重要意义。糖组在生物样品中的丰度较低,且受单糖组成、糖苷键连接位置、连接方式、分支结构等因素的影响,使得糖链的组成与结构复杂多样,给糖组学研究带来了巨大挑战。液相色谱分离技术以及液相色谱-质谱联用技术被广泛应用于糖组的结构解析,在糖组学研究中发挥了不可或缺的作用。本文首先从色谱分离原理的角度讨论了糖链的富集方法及其在糖组学研究中的应用案例,并比较分析了各种方法的优势与不足;在糖链的分离与分析方面,从色谱分离模式的角度,分别列举了反相色谱、高效阴离子色谱、亲水相互作用色谱和多孔石墨化碳色谱分离糖链、糖缀合物或糖衍生物的分离原理,以及各类色谱模式联合质谱解析在糖组学分析中的研究进展。本文对各类色谱方法的分离特色进行了总结与讨论,为研究人员针对特定样品或特定目标物的分离与分析选择合适的方法提供了参考。近年来,在色谱技术的推动下,糖组学研究取得了相当大的进展。随着色谱新材料和新方法的不断开发,色谱技术将在糖组学研究中发挥更加重要的作用。

中国母乳寡糖构成特征分析

为了分析中国代表性地区健康乳母的母乳寡糖因地区、泌乳时间和血型基因型受到的影响,探究中国母乳寡糖的构成特征,采用纵向队列研究方法采集我国东西南北6个城市、109名健康母亲、3个泌乳阶段的母乳样本,利用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱分析23种母乳寡糖的质量浓度,并对母乳血型基因型归属状态进行分析。结果表明,昆明、济南和深圳的总母乳寡糖质量浓度和总岩藻糖基中性寡糖质量浓度显著高于北京、包头和西宁,其中包头地区母乳的3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose,3-FL)、二岩藻糖基乳糖(lactodifucotetraose,LDFT)和乳糖-N-二岩藻糖基新六糖II(lacto-N-neodifucohexaose II,LNn DFH-II)质量浓度分别显著低于深圳、济南和北京;8种中性寡糖和4种酸性寡糖随泌乳时间延长呈现显著降低趋势;3-FL含量随泌乳时间延长呈现显著上升,LDFT和LNn DFH-II也随泌乳时间延长呈上升趋势,但差异不显著;2种单岩藻糖基六糖在1月龄成熟乳时质量浓度达到最高,之后持平或者略降低;以寡糖类型推测的血型基因型分型发现,各城市乳母均以Se+Le+为主,但该类型母乳中除了乳糖-N-二岩藻糖基六糖II(lacto-N-difucohexaose II,LNDFH-II)、LNDFH-I&LNn DFH-I、6’-唾液酸化乳糖和唾液酸化-乳糖-四糖c质量浓度比其他血型基因型高以外,其他18种寡糖质量浓度均低于其他血型基因型。本研究揭示了地区、泌乳阶段和乳母血型基因型造成了母乳寡糖组成和含量的差异,可为生命早期婴幼儿营养摄入中母乳寡糖的精准化提供科学理论指导。

黄精多糖中果糖含量的精确测定方法

为准确测定黄精多糖中果糖的含量,采用亲水色谱-电雾式检测分析(hydrophilic interaction liquid chromatography-charged aerosol detector,HILIC-CAD)法,系统地考察多糖浓度、酸浓度、水解温度及水解时间4个多糖水解单因素,并结合正交试验获得黄精多糖的最佳水解条件。结果表明,黄精多糖的最佳水解条件为1.0 mg/mL黄精多糖在0.100 mol/L三氟乙酸溶液中,于80℃水解30 min,果糖可被完全释放,且未转变为其他物质。采用HILIC-CAD结合柱前衍生-反相色谱法,测定山东、安徽、甘肃、四川和陕西5个产地黄精多糖中果糖及其它6种单糖的含量,其中安徽产地的黄精多糖果糖含量较低(51.74%),其它4个产地黄精多糖中果糖含量较高且含量相似(78.71%~83.08%)。

万古霉素及其杂质的亲水作用色谱分析

目前,万古霉素色谱分析方法主要为反相色谱法,该法分离万古霉素及其杂质时,存在极性选择性不足以及所使用的流动相体系与质谱兼容性差等问题。基于亲水作用色谱(HILIC)对糖肽类物质的色谱保留和极性选择性,本文选取万古霉素及其常见杂质为对象,考察了HILIC固定相、流动相组成比例、缓冲盐添加剂浓度和pH值等色谱条件,对万古霉素及其主要杂质进行了HILIC分离方法研究。确立了以Click XIon色谱柱为固定相,以甲酸铵为流动相添加剂的亲水作用色谱条件,实现了万古霉素及主要杂质的分离,为万古霉素类化合物的分离提供了新的途径。

人乳寡糖的分离分析

糖是一类重要的生命活性物质,它不仅是细胞能量代谢的源泉,还常作为信号分子参与细胞的各种活动。人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)在人乳干物质中的含量仅次于乳糖和脂肪,高于蛋白质,对婴儿的发育和健康具有重要作用。为了更好的理解人乳寡糖的生物功能和结构的关系,对其组成和结构开展分析研究是必不可少的。对人乳寡糖进行了简要的介绍,并就其预处理方法、分离分析和结构表征方法进行了综述,以期为人乳寡糖的深入研究提供参考。

反相／亲水色谱法分析糖苷类化合物

根据皂苷、黄酮苷等糖苷类化合物的结构特点,采用亲水色谱模式分析该类化合物,以弥补反相色谱模式分离结构类似糖苷类化合物选择性的不足。首先选择14个糖苷类化合物,比较了反相色谱柱(XAqua C18)和亲水色谱柱(Click XIon)的分离效果,评价了反相/亲水色谱的正交性,并构建了反相/亲水二维体系用于西洋参样品的分离。结果表明,糖苷类化合物在反相及亲水色谱柱上均有很好的保留,但两者具有不同的分离选择性,14种物质在反相和亲水柱的出峰顺序有较大差异,在反相色谱中不易分离的人参皂苷Rg1和Re在亲水色谱柱可获得很好的分离,反相/亲水模式分离糖苷化合物具有很好的正交性。以构建的RPLC/HILIC二维色谱体系分离西洋参样品,有效地提高了分离能力及峰容量,有利于后续更多极性及微量化合物的制备、结构表征与活性研究,且该方法操作简便、流动相兼容性好,可作为糖苷分离分析、制备的有效手段,也可以为其他中药复杂体系的分析提供参考。

基于巯基-烯烃点击化学的聚丙烯酰胺型亲水作用色谱固定相的制备

采用巯基-烯烃点击反应制备了一种新型聚丙烯酰胺键合烯基修饰硅胶的亲水色谱固定相。丙烯酰胺与二硫代苯甲酸苄酯通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）反应合成聚合物。在甲苯中,3-异氰酸酯丙基三甲氧基硅烷、丙烯胺和吡啶反应后,再与硅胶反应制备烯基修饰硅胶（EUS）。在甲醇中,以2,2-偶氮二异丁基脒盐酸盐为引发剂,被硼氢化钠还原的聚丙烯酰胺与EUS于55℃反应48 h,键合上巯基活化的聚合物。利用元素分析和红外光谱的方法对固定相TE-UPAM（Thiol-ene urea polyacy（amide））进行表征,含碳量与EUS相比有所增加,在1636和1570 cm!1处存在多重酰胺键红外特征峰。考察了流动相中水含量、盐浓度和p H值的变化对极性化合物保留时间的影响。结果表明,保留时间随水含量的增加而减小;中性和碱性化合物保留时间随盐浓度的增大而延长,在p H 3.3~4.8范围内,碱性化合物的保留时间随p H的降低而缩短,均与酸性化合物相反。固定相TE-UPAM在亲水模式下与传统硅胶固定相比较,更好地分离了7种核苷和碱基,再通过对寡糖的分离,表明此固定相分离极性化合物的巨大潜力。

超高效液相色谱-质谱法同时测定舒血宁注射剂中20种黄酮醇苷与萜类内酯成分

建立了舒血宁注射剂中16种黄酮及4种萜类内酯同时定量的超高效液相色谱-质谱分析方法,并采用所建立的方法同时测定了不同厂家舒血宁注射剂产品中上述20种化合物的含量。注射剂样品经甲醇-水(体积比1∶1)稀释后,在Acquity UPLC BEH Shield RP18(2.1 mm×100 mm,1.7μm)色谱柱上分析,以0.1%(体积分数)甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱,以电喷雾离子源负离子多反应监测(MRM)模式进行质谱监测。结果表明:20种化合物可在10 min内完成色谱分离分析,检出限和定量下限分别为0.02~1.59 ng/mL和0.07~5.30 ng/mL,16种黄酮及4种萜类内酯在各自的线性范围内线性关系良好,在低、中、高3个加标水平下的回收率为85.9%~109%。该方法前处理简单、快速高效、准确性高,为舒血宁注射剂的质量控制提供了参考。

固相萃取-超高效液相色谱法测定人参中5种原人参二醇型人参皂苷的含量

建立了固相萃取-超高效液相色谱测定人参中5种原人参二醇型人参皂苷的方法。人参药材经粉碎后通过水饱和正丁醇溶液进行超声提取,经过亲水作用固相萃取柱净化后,在ACQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)上分离,利用乙腈/水作为流动相进行梯度洗脱,采用光电二极管阵列检测器检测。结果表明,5种原人参二醇型人参皂苷在5~500μg/mL范围内具有很好的线性关系,相关系数均大于0.999。方法精密度的RSD值在0.95%~2.62%(n=6)之间,22 h内样品稳定性的RSD值在0.90%~2.15%(n=8)之间,日内和日间重复性的RSD值分别为5.35%~6.47%(n=6)和5.56%~6.34%(n=8)。方法的加标回收率在87.16%~101.92%之间,相对标准偏差在1.54%~4.01%(n=6)之间。所建立的方法采用亲水作用色谱模式的固相萃取材料,药材的提取液可直接作为固相萃取的上样溶液进行人参皂苷的富集和净化,并且超高效液相色谱大大缩短了分析时间。该方法简单快速、通量高、重现性好,适用于人参中5种原人参二醇型人参皂苷的定量分析。

基于电喷雾-四极杆-飞行时间质谱的高聚合度人乳寡糖异构体结构解析

人乳寡糖是一类存在于人乳中的天然益生元,在促进婴儿肠道菌群生长、完善免疫系统功能和抵抗病原体侵染过程中发挥着不可替代的作用。人乳寡糖的功能与其结构密切相关,但其结构组成复杂、连接方式多样,存在大量的同分异构体,且随着寡糖聚合度的升高,同分异构体的数目和复杂性都急剧增加。因此,高聚合度的寡糖异构体的结构解析是人乳寡糖研究的难点之一,对寡糖的生物功能研究具有重要意义。本研究采用电喷雾-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q/TOF-MS),在负离子模式下对分离获得的18个高聚合度人乳寡糖(其中3个为首次报道)进行了结构解析,探讨了同组异构体之间碎片离子的差异,并详细总结了寡糖异构体的裂解规律,为复杂的高聚合度人乳寡糖异构体的结构解析及新型糖结构的发现提供了科学依据。

基于电喷雾-四极杆-飞行时间质谱的神经节苷脂的结构解析

神经节苷脂(Ganglioside)是一种含有唾液酸的鞘糖脂化合物,是脊椎动物细胞膜的天然成份,具有广泛的生理功能。对神经节苷脂进行结构鉴定,有助于深入了解药物的组成,提高药物的品质,但由于神经节苷脂结构复杂,异构体众多,质谱规律变得多样且复杂。本研究建立了一种利用电喷雾-四极杆-飞行时间质谱的(ESI-Q-TOF-MS)解析神经节苷脂结构的方法。通过两个神经节苷脂对照品,优化质谱参数并总结质谱规律,建立质谱方法为:正离子模式; 3500 V毛细管电压; 200 V Fragmentor电压;用40 eV的碰撞能获得糖链的碎片结构,用80 eV的碰撞能获得神经酰胺的碎片结构。将本方法应用于制备的9个神经节苷脂的结构解析中,通过与对照品分子量对比,对样品进行简单的归属和分类,再根据样品的二级质谱中的特征碎片进行详细的结构解析。本研究结果表明,本方法可用于各类神经节苷脂的质谱鉴定中,为更复杂的神经节苷脂质谱解析奠定了基础。

基于表面静电排斥/反相混合模式色谱的黄连生物碱分析方法

建立了基于表面静电排斥/反相混合模式色谱的黄连生物碱分析方法。选用实验室自制的C18HCE柱,以乙腈和水为流动相,考察了甲酸、乙酸两种流动相添加剂及其在流动相中的体积分数对黄连生物碱的保留、峰形及选择性的影响。最终确定0. 1%(v/v)乙酸作为添加剂能实现黄连生物碱的良好分离,结合质谱和文献对其主要色谱峰进行了识别,分别为黄连碱、表小檗碱、非洲防己碱、药根碱、小檗碱、巴马汀。参考2015版《中国药典》对黄连生物碱的含量测定方法,以盐酸小檗碱进行方法学考察,结果表明,在0. 5~100 mg/L范围内线性关系良好,相关系数为0. 999 6,平均加标回收率为93. 74%。利用所建立的方法测定了湖北和重庆两个产地不同批次的黄连样品中各生物碱的含量。该方法简便,重复性好,精密度高,可为其他碱性化合物的分离分析提供参考。

基于混菌耦合发酵策略合成3′-唾液酸乳糖

唾液酸乳糖在婴幼儿配方奶粉产业展现出潜在、广阔的市场前景,但是目前缺少有效、廉价的合成方法。针对该问题,首先构建了2株工程菌JM109(DE3)/pET28a-neuA和JM109(DE3)/pET28a-nst,分别用于合成胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸(cytidine 5′-monophosphate N-acetylneuraminic acid,CMP-Neu5Ac)和3′-唾液酸乳糖;然后优化了JM109(DE3)/pET28a-neuA合成CMP-Neu5Ac体系;最后通过将啤酒酵母、JM109(DE3)/pET28a-neuA和JM109(DE3)/pET28a-nst耦合发酵,实现了3′-唾液酸乳糖的3菌株全细胞耦合催化合成。由于采用混菌耦合发酵策略来进行3′-唾液酸乳糖的生产,其生产模式不再像酶法一样繁琐和价格高昂,并且实现了CMP-Neu5Ac的高效再生和供给,为经济且规模化生产3′-唾液酸乳糖奠定了技术基础。

母乳科学研究的逻辑:进化、系统和责任——“第三届中国母乳科学大会”会议纪要

传统观点认为乳汁仅是一种含有必需营养素的液体。这种观点忽略了乳汁的个体性、动态性、主动性和结构化。每种哺乳动物的乳汁都是独一无二的,其成分的存在和浓度反映了它们的进化历史、当前的生态学以及后代的发育轨迹[1]。母乳是人类经过自然选择压力塑造的结果。

色谱研究最新进展

色谱作为一种强大的分离分析手段,为推动生物医学和人类健康、环境监测与保护、食品安全与质检等领域的发展提供着解决问题的关键技术。最近几年来,我国色谱学科经历了全面快速发展,取得了令人瞩目的成绩,研究水平和国际地位得到巨大提升,色谱相关SCI论文发表数量居世界第一位。色谱应用领域也在不断扩大,尤其在蛋白质组学、代谢组学等新兴领域,以及药物、环境、食品分析等传统领域发挥越来越重要的作用。本文对近年来色谱学科(重点是我国色谱学科)在色谱技术、色谱填料和色谱柱、样品前处理方法、应用领域等方面的进展情况进行介绍。共引用109篇参考文献。

双唾液酸乳糖-N-四糖改善肠道代谢微环境稳态抑制新生大鼠坏死性小肠结肠炎病理进程

目的探讨双唾液酸乳糖-N-四糖(DSLNT)对坏死性小肠结肠炎(NEC)新生大鼠肠道内容物低分子量代谢谱的影响,探索其对新生儿肠道的保护作用方式。方法新生SD大鼠按随机数表法随机分为对照组、NEC组和NEC+DSLNT组,大鼠均采用特殊配方奶人工喂养,NEC组和NEC+DSLNT组以3次/d的频率进行缺氧(950 mL/L氮气,10 min)/冷刺激(4℃,10 min)、连续3 d诱导新生大鼠NEC模型,NEC+DSLNT组在特殊配方奶中添加300μmol/L DSLNT。造模72 h时处死所有存活大鼠,采集回结肠部位肠内容物进行基于超高效液相色谱-组合型四级杆Orbitrap质谱仪(UHPLC-QE-MS)的非靶向代谢组检测,末端回肠行苏木精-伊红染色。代谢组数据用SIMCA 14.1软件进行多元变量统计分析。以正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)模型的变量投影重要度(VIP)值>1和t检验中P<0.05筛选两两比较的组间差异代谢物。结果DSLNT降低NEC发生率和NEC大鼠回肠组织病理学评分[3.0(2.0,3.0)分比1.0(1.0,2.0)分,P<0.01],并可有效抑制炎症浸润。基于UHPLC-QE-MS代谢组检测结果建立的OPLS-DA模型能较好地对NEC组和对照组、NEC+DSLNT组和NEC组实现分离。NEC组和对照组之间有64个差异代谢物(OPLS-DA模型的VIP值>1且P<0.05),包括二十二碳六烯酸(+288.0%,P=0.028)、黄嘌呤(+372.1%,P=0.007)、L-精氨酸(+233.1%,P=0.027)、L-亮氨酸(+232.7%,P=0.015)、N-乙酰神经氨酸(-41.6%,P=0.014)等,这些代谢物可映射到34条不同的代谢通路,其中精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢等6条代谢通路为NEC主要扰动的代谢通路。NEC+DSLNT组与NEC组之间存在15种差异代谢物,包括D-甘露糖(-73.5%,P=0.032)、黄嘌呤(-63.4%,P=0.008)、亚油酸(+137.9%,P=0.047)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(+278.2%,P=0.005)等,这些差异代谢物可映射到7条代谢通路,其中亚油酸代谢为DSLNT主要影响的差异代谢通路。两种比对策略中重合的差异代谢物数量为8个,其在NEC中的变化趋势在DSLNT给药组中均出现显著逆转。结论DSLNT能显著缓解缺氧/冷刺激造成的新生大鼠NEC病理损伤,该保护作用与其改善NEC造成的肠内容物代谢谱偏移、调节亚油酸代谢通路有关。DSLNT的早期预防性补充对维护新生儿肠道稳态、预防NEC病理进程具有重要意义。

双唾液酸乳糖-N-四糖保护新生肠道屏障预防坏死性小肠结肠炎的研究

目的探讨人乳提取物双唾液酸乳糖-N-四糖(disialyllacto-N-tetraose, DSLNT)对坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis, NEC)肠道屏障的保护作用机制。方法 (1)取2013年2月至2020年12月南通大学附属常州儿童医院病理科保存的新生儿回肠病理组织石蜡块(NEC 12例, 肠闭锁9例)切片后行免疫组化染色, 比较其肠道紧密连接蛋白——闭锁小带蛋白1(zonula occludens-1, ZO-1)表达情况。(2)取1日龄SD大鼠28只随机分为对照组(8只)、NEC组(10只)和DSLNT+NEC组(10只), NEC组和DSLNT+NEC组以3次/d的频率、连续3 d进行缺氧(95%N2, 10 min)/冷刺激(4 ℃, 10 min)诱导新生大鼠NEC模型, DSLNT+NEC组在造模同时于配方奶中添加DSLNT(300 μmol/L)。72 h后处死所有大鼠, 取末端回肠组织处理, 比较不同组肠组织损伤及ZO-1表达情况。(3)用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)构建人肠上皮细胞株Caco-2炎性细胞模型并给予DSLNT, 分为对照组、LPS组、DSLNT+LPS组, 以噻唑蓝法检测细胞活力并以免疫荧光法检测ZO-1表达, 验证DSLNT对Caco-2细胞生长和紧密连接的影响。结果 (1)患儿结果:NEC组病变肠段黏膜层绒毛完整度缺失, 肠上皮细胞连接处ZO-1表达明显少于肠闭锁组和NEC组非病变肠段。(2)动物实验结果:NEC组大鼠肠组织病变部位肠上皮层松脱甚至坏死和脱失, ZO-1表达低于对照组和DSLNT+NEC组(P<0.05)。DSLNT+NEC组大鼠存活率高于NEC组(8/10比6/10), 回肠炎症损伤病理评分低于NEC组[2.0(1.0, 2.8)比3.5(3.0, 4.0)](P<0.05)。(3)细胞实验结果:LPS组肠上皮Caco-2细胞出现细胞生长限制和ZO-1免疫荧光暗淡;DSLNT+LPS组Caco-2细胞生长优于LPS组, 与对照组相当, 同时ZO-1表达强度显著增加。结论肠上皮紧密连接损伤是NEC的重要特征之一, ZO-1是NEC药学防治的潜在靶标分子;人乳寡糖单体DSLNT通过调节肠上皮ZO-1表达和紧密连接完整性发挥对新生肠道的保护作用, 是天然的肠道屏障调节物质。

东北地区分泌型和非分泌型母亲哺乳期HMO差异及其对子代肠道菌群的影响

目的分析中国东北地区母亲分泌型和非分泌型基因的分布及其在哺乳期母乳中低聚糖(HMO)种类和含量的差异,探讨这些差异对于子代肠道微生态的影响。方法收集56例母亲在哺乳期第6天母乳样本及其母乳喂养的新生儿在同一天的粪便样本;以质谱分析20种主要HMO的含量;以变性梯度凝胶电泳检测两组新生儿肠道菌群差异。结果所选取的56例母亲其分泌型与非分泌型的比例为43∶13,其中分泌型母亲的岩藻糖基化HMO含量显著高于非分泌型母亲,并且两组新生儿肠道菌群结构也有明显差异。结论不同基因型母亲在哺乳期HMO存在明显差异,而这一差异显著影响了其子代肠道菌群结构。