NtJAZ9基因参与调控烟草腺毛发生的功能研究

【目的】探究茉莉酮酸调控烟草腺毛发生的分子机制。【方法】对茉莉酮酸信号关键抑制子NtJAZ9进行同源克隆、生物信息学分析和基因功能研究。【结果】(1)NtJAZ9有两条同源序列NtJAZ9-1和NtJAZ9-2,编码区长度分别为1008 bp和996 bp。(2)亚细胞定位结果表明NtJAZ9蛋白定位在细胞核中。在各组织中NtJAZ9-1相对表达量均高于NtJAZ9-2,NtJAZ9-1在茎表皮中表达量最高,NtJAZ9-2在叶中表达量最高。(3)NtJAZ9过表达植株叶面腺毛密度降低,NtJAZ9基因敲除植株腺毛密度显著增加,保护毛密度差异不显著。茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)可显著促进长柄腺毛的发生,喷施后过表达株系长柄腺毛密度增加1.76倍,敲除株系长柄腺毛增加0.36倍。【结论】NtJAZ9基因参与调控烟草腺毛的发生,并在一定程度上影响了MeJA信号对烟草腺毛发生的调控作用。

烟草NtJAZ15基因对腺毛发生的影响

为验证NtJAZ15对烟草腺毛发生的影响,探究NtJAZ15调控腺毛发生的分子机制,本研究从K326中克隆了NtJAZ15基因,并对其进行了生物信息学和组织表达模式分析,通过创制NtJAZ15敲除和过表达突变体,分析其对腺毛发生的调控作用。结果表明,NtJAZ15-1和NtJAZ15-2在不同烟草品种中高度保守,具有典型的TIFY和Jas结构域,属于JAZ家族。NtJAZ15在各组织中均表达,且各组织中NtJAZ15-2表达量均高于NtJAZ15-1。NtJAZ15基因敲除突变体烟叶长柄和短柄腺毛密度增加,过表达突变体则相反。qRT-PCR结果表明NtJAZ15可显著影响NtWo、NtCycB2、NtHD9、NtHD12的表达,但对NtMIXTA的表达影响不显著。因此,NtJAZ15负调控烟草长柄和短柄腺毛发生,NtWo、NtCycB2、NtHD9、NtHD12可能参与NtJAZ15调控烟草腺毛发生。

新农科背景下“烟草生物技术”课程建设与改革的探索

围绕新农科背景下我国农业生物技术发展过程中创新创业卓越农学人才培养的关键问题,本文基于河南农业大学烟草学院“烟草生物技术”课程的教学改革和一流课程建设情况,系统总结本课程在教材编撰、教学目标构建、思想政治融合、线上教学资源建设、教学手段和考核评价机制改革等方面的教学探索,提出新时代高等农林教育发展下烟草行业生物技术创新人才的培养方案,为新农科其它课程的建设提供实践经验。

烟草腺毛中NtHD-ZIP IV和NtJAZ家族基因表达分析

【目的】为探究NtHD-ZIP IV和NtJAZ家族基因在腺毛发生发育中的作用。【方法】通过实时定量PCR技术分析NtHD-ZIP IV和NtJAZ家族基因在高分泌型烤烟种质T.I.1068和非分泌型烤烟种质C110上的转录水平以及茉莉酮酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)处理C110后NtHD-ZIP IV和NtJAZ家族基因的转录水平。【结果】(1)C110的腺毛类型以短柄分泌型腺毛和非分泌型腺毛为主,T.I.1068的腺毛类型以长柄分泌型腺毛和短柄分泌型腺毛为主,MeJA处理后,C110的长柄分泌型腺毛密度增加。(2)Nt HD-ZIP IV-6、-7、-9和-14在C110和T.I.1068表皮毛中的表达水平均较高,NtHD-ZIP IV-1、-2、-3和-13在C110表皮毛中表达水平较高,NtHD-ZIP IV-12则在T.I.1068表皮毛中表达水平稍高。MeJA处理后,NtHD-ZIP IV-1、-2和-7的转录水平受到抑制,而NtHD-ZIP IV-5的转录水平上调。(3)与C110相比,Nt JAZ-1、-7、-9、-12、-13、-14和-15在T.I.1068表皮毛中的表达水平显著上调;与T.I.1068相比,Nt JAZ-11则在C110表皮毛中表达水平显著上调。MeJA处理后,NtJAZ-1、-3、-5、-7、-8、-9、-10、-12和-15的转录水平上调。【结论】MeJA对长柄分泌型腺毛有诱导作用,NtHD-ZIP IV-12和NtJAZ-1、-7、-9、-12、-13、-14、-15在T.I.1068表皮毛中的表达水平较高,而在C110表皮毛中表达水平较低。

NtJAZ1基因敲除对烟草MeJA应答反应的影响研究

【目的】探究NtJAZ1敲除对烟草响应外源茉莉酮酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)对生长发育、腺毛发生、烟碱生物合成的应答反应的影响。【方法】以野生型K326为对照,比较不同浓度MeJA处理下,NtJAZ1敲除的K326突变品系NK-9在种子萌发、根系发育、腺毛形态、烟碱生物合成等方面的差异。【结果】(1)MeJA处理显著抑制了种子的萌发,在100μmol/L MeJA处理条件下,K326的种子萌发率比未经MeJA处理的种子萌发率降低了85.72%,NK-9的种子萌发率比未经MeJA处理的降低了48.12%。(2)MeJA处理抑制根系发育,在300μmol/L MeJA处理条件下,K326幼苗主根比未经处理的缩短了83.33%,NK-9幼苗主根缩短了68.18%。(3)MeJA处理诱导腺毛发生,在5 mmol/L MeJA处理条件下,K326叶面长柄腺毛密度比未经处理的提高了42.55%,NK-9提高了21.05%。(4)MeJA处理促进烟碱生物合成,在5 mmol/L MeJA处理条件下,K326烟苗的烟碱含量比未经处理的提高了76.05%,NK-9提高了37.51%。【结论】NtJAZ1敲除影响了烟草对MeJA的应答反应,减缓了MeJA对种子萌发与根系发育的抑制作用,也减缓了MeJA对烟草叶面长柄腺毛发生和烟碱生物合成的促进作用。

过表达NtGCN2基因提高烟草耐盐能力的研究

【目的】为研究NtGCN2过表达对烟草耐盐性的影响,探究其参与盐胁迫应答机理。【方法】采用不同浓度Na Cl溶液处理NtGCN2转基因烟草植株,测定其生理生化指标和耐盐相关基因的表达,探究NtGCN2参与调控盐胁迫的生理与分子机制。【结果】(1)NtGCN2基因表达受到盐胁迫(100 mmol·L^(-1)Na Cl)的调控,在烟草中过表达NtGCN2可以提高转基因烟草的耐盐性。(2)盐胁迫下NtGCN2的过表达能够维持转基因烟草植株较高的光合作用速率和叶绿素含量,提高抗氧化相关基因表达和酶活性,增加了游离脯氨酸含量,降低了MDA的含量。(3)NtGCN2通过提高耐盐相关基因的表达和调节Na^(+)/K^(+)离子平衡增强转基因植株的耐盐性。【结论】NtGCN2通过提高烟草抗氧化能力、维持较高的光合作用速率和叶绿素含量、增强耐盐相关基因表达、调节Na^(+)/K^(+)平衡,改变植物生理状态,提高了转基因烟草的耐盐能力。

烟草NtCycB2启动子的克隆和组织驱动特性分析

【背景和目的】烟草B型细胞周期蛋白CycB2可以负调控腺毛的发生,为分析烟草Nt CycB2启动子的组织驱动特性。【方法】通过实时定量PCR分析普通烟草NtCycB2-1和Nt CycB2-2两种序列的组织表达差异,克隆NtCycB2-1和NtCycB2-2启动子序列,对其进行进化分析、顺式元件预测和组织驱动特性分析。【结果】(1)烟草NtCycB2-1和NtCycB2-2均为腺毛优势表达基因,NtCycB2-1的表达量显著高于NtCycB2-2;(2)普通烟草中存在两种NtCycB2启动子序列类型(ProNtCycB2-1和ProNtCycB2-2),其中ProNtCycB2-1来自于林烟草,ProNtCycB2-2来自于绒毛烟草,这些CycB2启动子中普遍存在ABRE等激素应答元件,以及MYB-motif、MYC-motif和TC-rich repeats等逆境响应元件;(3)以GUS为报告基因,研究NtCycB2-1和NtCycB2-2两个启动子的组织驱动特性发现,NtCycB2-1和NtCycB2-2启动子均能驱动GUS基因在叶片和茎部腺毛中特异表达,其中NtCycB2-1启动子的驱动能力高于NtCycB2-2。【结论】Nt CycB2启动子可驱动下游基因在腺毛中特异表达。本研究为寻找腺毛特异表达顺式元件、构建腺毛人工启动子、研究腺毛发生机制奠定基础。

课程思政融入《分子生物学》的教学探索

课程思政建设是全面提高人才培养质量的重要任务,在教学活动中具有重要的作用。思政教育通过积极引导和调控教学活动,有助于大学生提升综合素质和实现教学目标。本文将思政教育与烟草专业课《分子生物学》充分融合,从课程思政融入专业课教学的重要意义、发展现状和实现途径等方面进行了教学探索。

景观生态学理论视角下村庄景观规划策略研究——以黑河坝村为例

随着国家实施乡村振兴战略,各地纷纷紧抓乡村建设,村庄景观规划是保证生态宜居乡村建设成效的关键因素之一。该文首先明确了村庄景观规划的概念和内涵,并研究景观生态学的基本理论;其次,选取陕西省略阳县黑河坝村为研究对象,在清晰认知村庄景观格局和要素的基础上,构建了从生态质量、发展活力、视觉特点三个层面评价景观特征的指标体系,景观特征评价采用了定量对比与定性描述相结合的方法,梳理总结村庄现存的景观问题。继而,结合景观生态学的理论方法,针对性地提出从刚性保护走向弹性保育的自然生态景观美化策略、从无序生长走向系统和谐的人居空间景观优化策略、从小农经济走向多元产业的乡村生产景观提升策略、从特色迷失走向留住乡愁的乡风文化景观重塑策略,从而打造具有乡土特色的村庄景观风貌。

“三生”空间协同视角下传统村落保护发展规划研究——以铁佛寺村为例

传统村落是具有多重价值的活态历史遗产,在实施乡村振兴战略进程中,传统村落的保护与振兴发展研究变得更加迫切。本文以传统村落铁佛寺村为研究对象,从"三生"空间协同的视角切入,基于村落现状发展特征和存在的问题,从"三生"空间整合、建设空间布局、产业发展策划、建筑风貌提升方面,探讨在地性的传统村落保护发展策略,从而促进"三生"空间协同建设和传统村落的活化、可持续发展。

NtCycB2基因表达对烟草腺毛发生的影响

烟草腺毛是烟草表皮细胞的特化结构,对烟株抗性及烟叶品质具有重要影响。为探索烟草腺毛密度的分子调控途径,本文对烟草B型细胞周期蛋白基因NtCycB2进行了同源克隆和生物信息学分析,并对其表达特性和生物学功能进行研究。结果表明该基因包含333bp的编码区,编码110个氨基酸,该序列在栽培烟草不同类型、不同品种间高度保守,但与SlCycB2和AtCycB2同源性分别为71.05%和52.38%。RT-PCR分析表明NtCycB2在叶面腺毛和花中的表达水平较高,并受到盐、温度、MeJA等逆境信号的诱导;分别利用基因过表达和基因编辑技术获得了NtCycB2过量表达和敲除株系;植株腺毛形态学观察发现NtCycB2过表达植株腺毛密度显著减少,基因敲除植株分泌型腺毛密度显著增加,而非分泌型腺毛变化不大,该研究表明NtCycB2对烟草分泌型腺毛发生具有明显的负调控作用,在烟草腺毛密度分子调控和叶面化学定向改良中具有较大潜力。

烟草“8306”NtCPS2基因敲除及叶面化学成分改良

8306是重要的高香气烤烟育种材料,因其腺毛分泌物中含有赖百当化合物而使其杂交后代具有晾晒烟香气特征。为此,本研究利用CRISPR/Cas9技术,对8306中赖百当生物合成途径的关键酶基因NtCPS2进行敲除,获得了gRNA区发生单碱基插入突变导致翻译提前终止的纯合突变体8306-1。与8306相比,该突变株系生长发育正常,腺毛类型和腺毛密度无显著变化;利用GC-MS技术对叶面化学成分进行检测,在8306-1中并未发现8306中所含有的顺冷杉醇和赖百当二醇等赖百当类化合物,而腺毛分泌物的其他主要成分,如西柏三烯一醇、西柏三烯二醇及蔗糖酯的含量与对照相比并无明显变化;RT-PCR检测分析显示,8306-1与8306中MEP途径及二萜生物合成途径的关键基因,如NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtGPPS、NtGGPPS、NtCYC、NtCYP71D16等在转录水平上的表达均无明显差异。该研究结果表明,NtCPS2基因敲除能有效降低烟草赖百当类二萜化合物的含量,而对叶面其他化学成分及类萜途径基因表达无明显影响。因此,NtCPS2基因是进行烟草叶面化学成分定向改良的理想靶点,对烤烟高香气育种具有重要意义。

高分泌型K326近等基因系的创制和鉴定

烟草腺毛分泌物含量与烟叶品质和烟株抗性密切相关。本研究以K326为轮回亲本,以高分泌型烟草种质T.I.1068为供体亲本,通过对腺毛形态及腺毛分泌物含量的定向筛选,获得了高分泌型的K326近等基因系(High Secretory K326,HSK326)。形态观察发现,HSK326植物学性状与K326基本一致,但叶面腺毛密度提高、分泌囊膨大、罗丹明组织化学染色程度明显加深。GC/MS检测表明,HSK326叶面分泌物成分与K326一致,含有西柏烷二萜和I-II型蔗糖酯,缺少T.I.1068中所特有的赖百当二萜和III-V型蔗糖酯;但HSK326腺毛分泌物含量显著提高,西柏烷二萜是K326的1.91倍,蔗糖酯是K326的2.27倍。进一步分析表明,HSK326中赖百当二萜合成关键基因NtCPS2、西柏烷二萜合成关键基因NtCBT的表达水平均高于K326;但与T.I.1068相比,HSK326与K326中NtCPS2基因在1542 bp处均发生了相同的终止突变(G变成T),导致了赖百当二萜化合物的缺失。另外,分子检测发现与BMVSE紧密连锁的分子标记在HSK326和K326中类型相同,但与T.I.1068不同。HSK326在不改变K326腺毛分泌物组成的前提下,显著提高了K326腺毛分泌物的含量,不仅为K326品质的进一步改良奠定了基础,也为烟草二萜及蔗糖酯合成调控基因的鉴定提供了理想材料。

课程思政在烟草专业课程中的功能研究——以《烟草生物技术》为例

课程思政作为一种适应新时代发展的全新的教学模式,对确保高等学校专业课教学中贯穿立德树人的根本任务具有重要意义。课程思政与专业课教学相融合是我国新时代思政教育建设的创新举措,也是高校促进教学改革的必经之路。在课程思政的建设过程中,相关专业课程内容需要重新设计和完善,教师队伍作为关键执行者应提高思政资源传播的方式和力度,高校及时掌握学生对课程的反馈情况、了解学生对课程思政的认可程度是促进课程思政深入发展的重要环节。

NtMYB68基因对烟草苗期紫黄质和脱落酸生物合成及烟株耐旱性的影响研究

【目的】为探究烟草NtMYB68基因在类胡萝卜素和脱落酸合成生物合成中的作用及其对烟株抗旱性的影响。【方法】从烤烟品种K326中同源克隆NtMYB68基因,采用生物信息学分析NtMYB68基因序列特征,利用RT-PCR分析其在烟草不同组织的表达模式。利用基因编辑手段创制NtMYB68敲除材料,并分析NtMYB68基因敲除后对烟株类胡萝卜素合成及抗旱性的影响。【结果】NtMYB68基因有2个拷贝,NtMYB68-1和Nt MYB68-2。NtMYB68在烟草根、茎、叶、花中均有表达,NtMYB68-2的表达水平显著高于NtMYB68-1。NtMYB68敲除材料与对照相比,紫黄质合成基因NtZEP显著上调,紫黄质含量显著增加,脱落酸(ABA)合成基因Nt NCED5表达量达到对照植株的4倍。干旱胁迫下,敲除材料幼苗与对照相比,叶片萎蔫程度更轻,长势更优,复水处理后生长状态恢复的更好。干旱处理前后,敲除植株中ABA的含量均显著提高。【结论】Nt MYB68转录因子能抑制NtZEP和Nt NCED5基因表达,敲除该基因可以提高烟叶中紫黄质的积累,促进脱落酸的合成,从而提高烟株抗旱性。

基于思维导图的互动式教学在新农科课程建设中的应用探索——以烟草生物化学为例

良好的教学方法与高效的教学策略是培养学生自主学习能力、实现教学过程轻负高效的有力保障。思维导图作为辅助学习工具和思维工具,可以调动学生学习的积极性和主动性,开发学生的创新和发散思维能力。学生在课前、课中和课后充分利用思维导图进行课前预习、课堂记录和课后总结。在新农科课程烟草生物化学教学过程中应用思维导图,有利于对知识点进行梳理,加强对知识点的理解、记忆和延伸,更有效地训练学生的高级思维技能。进而提高互动式教学效果。

中国野生毛葡萄VqTLP15基因的克隆与抗病性功能研究

该研究以抗病品种中国野生毛葡萄‘商-24’和感病品种欧洲葡萄‘红地球’为材料,利用RT-PCR方法克隆TLP15基因,分别命名为VqTLP15和VvTLP15(GSVIVT01018769001),对其进行生物信息学分析、亚细胞定位、转化拟南芥,并接种不同病原菌观察分析转基因株系的抗性,采用qRT-PCR检测SA和JA/Eth信号途径以及调控气孔运动的相关基因表达。结果显示:(1)成功克隆获得VqTLP15基因的开放阅读框(ORF);氨基酸序列比对显示,VqTLP15基因与葡萄基因组网站欧洲葡萄‘黑比诺’VvTLP15和‘红地球’克隆的VvTLP15基因的同源性分别为98.99%和99.66%。(2)亚细胞定位表明,VqTLP15定位于细胞质。(3)成功获得VqTLP15转基因拟南芥株系(L1、L2、L3)。(4)接种观察发现:白粉菌处理7 d后转基因株系对白粉菌的抗性较野生型(Col-0)提高,且其叶片的白粉菌孢子浓度显著低于Col-0;灰霉菌诱导的叶片坏死性损伤在转基因株系(L1、L2和L3病斑面积>40%的比例分别为71%、62%和67%)中显著大于Col-0(43%);接种PstDC3000后转基因株系叶片的病害表型没有Col-0明显,叶片孔径减小程度大于Col-0,且细菌浓度低于Col-0。(5)组织化学染色分析表明:白粉菌处理后转基因株系叶片胼胝质沉积、细胞死亡率和O2^-·水平都显著大于Col-0;灰霉菌处理后转基因株系的细胞死亡率、H2O2和O2^-·水平均高于Col-0;PstDC3000处理后细胞死亡率和O2^-·积累水平都高于Col-0。(6)qRT-PCR检测显示:接种白粉菌后,转基因株系中PR1和ICS1的表达水平均升高,PR1表达在接种72 h时达到峰值,而ICS1在接种120 h时达到峰值,LOX3的表达水平逐渐降低,并于接种120 h时降至最低水平,但仍高于Col-0;接种灰霉菌后,转基因株系中PR1、NPR1和PDF1.2基因的表达均上调,并在接种48 h时达到峰值,LOX3基因的表达水平下降,但仍高于Col-0;接种PstDC3000后,转基因株系中PR1、PDF1.2和NHL10的表达均高于Col-0,但WRKY53的表达低于Col-0,L1中COI1、FRK1、ATPPC2、FLS2、OST1的表达水平高于Col-0;接种flg22或LPS后,L1中COI1基因的表达低于Col-0,但ATPPC2、FLS2、OST1基因的表达水平高于Col-0。研究表明,过量表达VqTLP15基因降低了对白粉菌和PstDC3000的敏感性,增加了对灰霉菌的敏感性。VqTLP15基因可能通过介导水杨酸(SA)和茉莉酸/乙烯(JA/Eth)信号转导途径以及气孔免疫反应来参与植物的抗病防御反应,为葡萄抗病分子育种提供了一个可能的候选基因。

NtSPX4基因敲除对烟草苗期磷吸收和生长发育的影响研究

【目的】为探究NtSPX4基因在烟草磷吸收转运中的作用。【方法】同源克隆了烟草(Nicotiana tabacum L.)K326中NtSPX4基因,通过CRISPR/Cas9技术获得了NtSPX4-1和NtSPX4-2均发生纯合突变的K326株系S_(42),在不同磷浓度的Hoagland溶液培养条件下,对S_(42)株系的生长发育、物质积累、磷吸收相关基因表达及有效磷含量变化进行研究。【结果】烟草基因组中存在两个NtSPX4同源基因,分别命名为NtSPX4-1和NtSPX4-2。其中NtSPX4-1 CDS全长为924 bp,编码氨基酸序列与祖先种林烟草NsylSPX4相同;NtSPX4-2 CDS全长为933 bp,编码氨基酸序列与祖先种绒毛烟草NtomSPX4相同。S_(42)株系中NtSPX4-1和NtSPX4-2均在第52 bp处插入一个碱基T,导致NtSPX4蛋白翻译提前终止。在标准Hoagland溶液培养条件下,S_(42)株系的生长发育与对照无明显差异;在高磷条件下,S_(42)株系生长发育受到抑制,生物量较对照降低了约45%;在低磷条件下,S_(42)株系生长势优于对照,生物量较对照提高了约39%。RT-PCR分析表明,在正常磷条件下,S_(42)株系中磷转运蛋白基因NtPT1和NtPT2的表达水平与对照基本一致,在高磷和低磷条件下,S_(42)株系中NtPT1和NtPT2基因表达水平均显著高于对照K326。有效磷检测分析表明,不同磷浓度条件下,S_(42)株系中有效磷含量均极显著高于对照K326。【结论】NtSPX4基因敲除在低磷条件下可以促进烟株的生长发育,在高磷条件下对烟株生长发育有一定的抑制作用,NtSPX4在烟草磷吸收转运中具有负向调控作用。

新农科背景下“烟草生物化学”教学模式改革与探索——以河南农业大学为例

围绕新农科背景下我国烟草农业发展过程中创新研究型人才供不应求的特点,强化培养烟草学科学生的理论水平和创新能力。基于“烟草生物化学”教学理念和教学方法的变革和发展,课程教师队伍对本课程的思政建设和教学模式进行改革与探索,提出适宜新时代发展和烟草行业人才需求的新方案。

NtCycB2和NtJAZ1共敲除对烟草腺毛密度和烟碱含量的影响

为了提高烟草的腺毛密度、腺毛分泌物和烟碱含量,从而改善烟株抗性和烟叶品质,以NtCycB2突变的多腺毛K326突变株系(hairy K326)为材料,采用CRISPR/Cas9技术对NtJAZ1进行基因编辑,筛选出NtCycB2与NtJAZ1基因共敲除的纯合株系J-21,并以K326和hairy K326为对照,对J-21的农艺性状、腺毛发育、烟碱生物合成和烟叶化学成分进行了研究。结果表明,J-21植株生长发育正常,主要农艺性状与K326和hairy K326无显著差异,其叶片腺毛密度比hairy K326有所降低,但比K326显著提高,腺毛分泌物含量(质量分数)提高156.35%。J-21叶片烟碱含量在现蕾期比K326和hairy K326显著提高,在烟株打顶后提高幅度明显降低,成熟期叶片烟碱含量比K326和hairy K326分别提高37.14%和32.28%。J-21烤后烟叶化学成分协调,烟碱含量比K326和hairy K326分别提高39.81%和45.32%,西柏烷类降解产物茄酮含量比K326和hairy K326分别提高217.49%和48.45%。表明NtCycB2和NtJAZ1共敲除在不影响烟株生长发育的前提下,可有效提高烟草叶片腺毛密度、促进腺毛分泌物和烟碱的积累,是进行烟草抗性和品质聚合改良的有效途径之一。