旋毛虫肌幼虫RNA的提取及目的基因的PCR扩增

用改进的ＡＧＰＣ法成功地提取出旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ。每０．１ｍｌ压积虫体可获得１００μｇ的ＲＮＡ，其Ａ２６０与Ａ２８０及Ａ２６０与Ａ２３０的比值均接近于２，变性琼脂糖凝胶电泳显示，旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ缺少大部分真核生物所具有的２８ＳｒＲＮＡ。通过比较研究，筛选出理想的虫体处理方法。用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）直接从总ＲＮＡ中进行目的基因的扩增，得到一分子量为０．７ｋｂ的ＤＮＡ。通过限制性内切酶对其消化鉴定，证明扩增片段中的酶切位点与已知序列中的完全一致。

旋毛虫肌幼虫ES抗原特异性蛋白2个结构基因的分子克隆及其高效表达

旋毛虫肌幼虫排泄－分泌（ＥＳ）抗原来源于体外培养的旋毛虫肌幼虫的排泄－分泌物。为研制具有ＥＳ抗原功能的旋毛虫基因重组抗原，首先用ＡＧＰＣ法提取旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ并进行变性琼脂糖凝胶电泳分析，发现它缺少真核生物所具有的２８ＳｒＲＮＡ。根据编码４５０００和４９０００蛋白的基因结构，设计并合成２对ＰＣＲ引物，用ＲＴ－ＰＣＲ方法分别扩增出了２个目的基因（ＴＳＰＧ和ＴＳＰＧⅡ）。序列分析发现，ＴＳＰＧ在第４５８到５０５位之间的核苷酸编码框架与结构基因Ｐ４５的不同，此外，还有多处出现与Ｐ４５不同的碱基。在ＴＳＰＧⅡ核苷酸序列中只有１个碱基与Ｐ４９不同。根据可识别的糖基化位点判定，ＴＳＰＧ和ＴＳＰＧⅡ各含有１个Ｎ－型连接的糖基化位点。将构建的３个重组质粒转化大肠杆菌，通过温度诱导培养，分别在大肠杆菌中表达出３７０００、４６０００和３４０００的重组蛋白，三者的表达水平分别为２２％、１０％和８％；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析和ＥＬＩＳＡ检测表明，它们均可被猪旋毛虫病阳性血清和单克隆抗体识别，但特异性有所不同。将ＴＳＰＧⅡ克隆至Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｙｅａｓｔ穿梭载体ｐＨＩＬ－Ｓ１上，经内切酶消化和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交鉴定后，?

旋毛虫肌幼虫ES抗原的基因克隆及高效表达

作者对编码旋毛虫肌幼虫ES抗原的部分结构基因进行了克隆、鉴定和表达。用RNA PCR技术直接从旋毛虫肌幼虫总RNA中反转录并扩增出0.7kb的靶DNA,酶切分析后将其克隆到融合表达载体pEX31C中。SDS—PAGE电泳表明,含重组子的大肠杆菌能够表达出一分子量为37kDa的融合蛋白(P37),后者占菌体总蛋白的22％以上,并以包含体形式存在于菌体中。经对纯化后表达蛋白的ELISA检测,证明它能被猪旋毛虫病阳性血清和抗旋毛虫单克隆抗体识别。研究结果揭示,重组蛋白P37对于研制旋毛虫病诊断抗原和免疫抗原具有潜在的应用价值。

旋毛虫ES抗原特异性蛋白两个结构基因的序列分析及重组质粒的构建

目的：获取旋毛虫ＥＳ抗原的结构基因，对其鉴定和克隆，并研制旋毛虫基因重组抗原。方法：先用反转录ＰＣＲ技术获取目的基因，经序列测定和酶切分析后，再用重组ＤＮＡ技术分别将目的基因与融合表达载体ｐＥＸ３１Ｃ、ｐＥＸ３１Ｂ及表达载体ｐＢＶ２２０连接，评价在大肠杆菌中的表达效果和鉴定表达产物的特异性。结果：获得了编码ＥＳ抗原特异性蛋白成分的两个结构基因（０．７ｋｂ和０．９５ｋｂ），其序列与文献报道的稍有差异。共构建３个重组质粒并在大肠杆菌中表达出相应分子量大小的重组蛋白，均能被猪旋毛虫病阳性血清所识别，但非融合蛋白的特异性强于融合蛋白。在相同条件下，融合蛋白的表达量高于非融合蛋白，而表达蛋白的分子量大小与表达水平呈负相关性。结论：在大肠杆菌中表达的３种重组蛋白是研制旋毛虫基因重组抗原的良好候选抗原蛋白。

用反转录─聚合酶链反应快速鉴别新城疫病毒

根据新城疫病毒基因结构特点及强、弱毒株Ｆ０ 裂解位点的序列差异设计２ 对引物，建立了快速诊断新城疫并能鉴别诊断新城疫强、弱毒株的反转录聚合酶链反应（ ＲＴＰＣＲ） 技术。试验表明，该方法具有快速特异和操作简便等特点，不仅适用于对鸡胚毒的检测，也适用于对病鸡组织匀浆液的检测，是新城疫鉴别诊断和流行病学调查的颇具潜力的分子诊断方法。

牛CD14结构基因的PCR扩增及序列分析

在用牛肺巨噬细胞构建了ｃＤＮＡ基因文库的基础上，参照人和小白鼠ＣＤ１４的基因序列设计一对引物，用ＰＣＲ方法成功地扩增出编码牛ＣＤ１４的特异性ＤＮＡ片段，并进行了序列分析。结果表明，牛ＣＤ１４基因的核苷酸在相同区域内与人ＣＤ１４的同源性为７９％，推导氨基酸序列的同源性为７３％；而与小白鼠的核苷酸和氨基酸的同源性分别为７５％和７１％。无论在核苷酸还是氨基酸水平上，牛ＣＤ１４基因与人ＣＤ１４的同源性都要高于与小白鼠的同源性。

旋毛虫ES抗原特异性成分的分离和鉴定

在旋毛虫病的免疫学诊断中,目前常用的抗原是虫体粗制抗原(CWE)、排泄—分泌抗原(ES)及其纯化物。研究表明,CWE易出现假阳性反应,其诊断准确率不高;而ES易出现假阳性反应较少,特异性较强,因此愈来愈受到国内外学者的重视。但在ES中究竟存在几种特异性蛋白成分?

旋毛虫病的免疫及其进展

自1835年James Paget首次发现旋毛虫以来,学者们针对旋毛虫和旋毛虫病进行了广泛的研究。尤其是现代诊断技术和新的抗寄生虫药物的研究与应用,对于控制旋毛虫病的传播起了巨大作用。但是,要完全控制和消灭这一人畜共患的寄生虫病。

马传染性贫血病毒强、弱毒株dUTPase结构与酶活性比较

为研究尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)在马传染性贫血病毒(equineinfectousanemiavirus,EIAV)致弱过程中的作用,探索dUTPase结构与功能的关系,分别对EIAV强、弱毒株dUTPase的编码基因进行了结构分析,并在大肠杆菌中进行了表达。经镍-次氮基三乙酸(Ni NTA)金属亲合层析方法对表达产物纯化后,用3H标记底物的方法测定了重组强、弱毒株dUTPase的活性。证明所表达的两种重组dUTPase均具有水解dUTP的功能,但重组弱毒株dUTPase的活性显著高于重组强毒株dUTPase的活性。结果提示,由于EIAV疫苗株在驴白细胞上连续传代培养,使病毒dUTPase的活性增强和复制能力提高,而决定酶活性改变的分子基础是dUTPase编码基因中的两个氨基酸发生了突变。此结果对其它慢病毒病的免疫预防具有重要参考价值。

牛1gG高亲和力受体的分子克隆及序列分析

报道编码牛 Ig G高亲和力受体 ( bovine Ig G Fc receptor I,bo FcγR )的全长序列 .从牛肺巨噬细胞 c DNA文库中克隆的该片段全长 1 .4kb,其中的 ORF为 1 0 50 bp,共编码包括信号肽、胞外域、穿膜区和胞内区在内的 349个氨基酸 ,含有 5个潜在的 N-连接糖基化位点 .与人和鼠的 Ig G高亲和力受体 ( hu FcγR 和 mo FcγR )相比 ,其核苷酸同源性分别为 80 %和 69% ,氨基酸同源性分别为 66%和 55% .研究表明 ,人、牛和鼠的 3种 Ig G高亲和力受体的单体 Ig

病鸡血清中鸡传染性贫血病病毒DNA的PCR扩增及抗体的ELISA检测

根据鸡传染性贫血病病毒（ＣＡＶ）的基因结构，设计并合成一对限制扩增长度为０．６８ｋｂ的ＰＣＲ引物．直接对临床可疑病鸡的血清进行靶ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增．在不同地区的３批样品中，有２批扩增出一二分子量接近０．７ｋｂ的单一特异性ＤＮＡ片段．用限制酶ＢｇｌⅡ消化ＰＣＲ产物．可获得分子量分别为０．３３ｋｂ和０．３５ｋｂ两个ＤＮＡ片段，其酶切位点与靶ＤＮＡ的相吻合．将ＰＣＲ扩增为阳性的病料接种６日龄ＳＰＦ鸡胚，并取其１８日龄胚肝和由接种鸡肛孵出的雏鸡的血清重新进行ＰＣＲ扩增，结果均为阳性，而同期对照胚肝及雏鸡血清为阴性．此外还用胚胎时接种过病料的雏鸡肝、脾和胸腺等组织抽提液作抗原，建立了检测ＣＡＶ血清抗体的ＥＬＩＳＡ方法．研究结果提示，用ＰＣＲ直接对病鸡血清中ＣＡＶＤＮＡ的扩增以及ＣＡＶ抗体的ＥＬＩＳＡ检测是快速和特异的．它为鸡传染性贫血病（ＣＩＡ）的流行病学调查、实验室诊断、ＣＡＶ毒株的分离和鉴定提供了必要的检测手段．

DM_(423)对人工感染雏鸡副伤寒的防治效果观察

家禽副伤寒是由鼠伤寒沙门氏菌引起的一种传染病,常发生于2周龄之内的各种家禽。罹患本病的幼禽的死亡效较高,严重时可达80%以上。本病的防治主要使用呋喃类、磺胺类和抗菌素等药物,但由于长期滥用而产生的耐药性,大部分药物疗效下降,造成“药量小不治病、药量大引起中毒”

痢菌净治疗猫胃肠炎的效果

据报道,用痢菌净治疗畜禽胃肠炎(包括大肠秆菌、沙门氏菌和其它细菌所引起的畜禽腹泻病)效果颇佳。但痢菌净对于猫胃肠炎的治疗效果如何?笔者自1987年以来,用该药对猫细菌性胃肠炎进行治疗,收到较为满意的效果。一、药物来源及用量痢菌净购自兰州中兽医研究所,呈黄色粉状。按0.5%加入蒸馏水中,溶解后分装小瓶,高压灭菌,然后置0～4℃冰箱备用。

不同免疫制剂对猪旋毛虫病的免疫效果比较

七种旋毛虫免疫制剂对猪进行的免疫试验证明,全虫制剂的每克肌肉含虫数减少率可达46.0％:如加入氢氧化铝佐剂,则减少率可达75.5％。

慢病毒dUTPase结构与功能的研究进展

d UTPase是生物体遗传和基因复制的重要水解酶 ,它可以防止 d UTP在 DNA合成中的插入和错配 ,维持 DNA复制的保真性和降低生物体发生突变的频率 ;同时还为 DNA的合成提供必需的原料。对于慢性病毒来说 ,它还是构成病毒毒力及病毒高效复制的因素。因此 ,d UTPase可用于抗肿瘤细胞和抗病毒药物的筛选。本文对 d UTPase的分布和进化关系、结构与功能的研究进展进行了概述。

PCR技术及其在农牧业上的应用

PCR(聚合酶链反应)是根据DNA碱基互补的特点,在聚合酶作用下使特异性DNA片段迅速扩增的一种方法。系由高温变性、低温退火和中温延伸等三步反应构成一个周期,循环往复,使极少量的DNA在短时间内以指数方式迅速扩增数百万倍。所以,PCR技术实质上是一种体外扩增DNA的新技术。一、PCR技术的特点

旋毛虫基因重组抗原对小鼠的免疫保护试验

分别用5μg和15μg的旋毛虫基因重组抗原对小鼠进行腹腔注射免疫,结果于免疫后第4周小鼠体内的抗体效价明显上升,至第7周达到高峰。当每只鼠用90条旋毛虫肌幼虫口服攻击后,抗体效价稍有下降,但到攻虫后的第5周基本回升至攻击前水平。通过人工消化法集虫和计算每克肌肉含虫数(LPG),发现注射5μg抗原蛋白的小鼠,其 LPG比对照鼠的平均减少 7.7％;而注射15μg抗原蛋白的小鼠的 LPG比对照鼠的减少33.5％。试验表明,旋毛虫基因重组抗原对小鼠有一定的免疫保护作用。

鸡传染性喉气管炎的分子诊断技术研究

为探索鸡传染性喉气管炎的分子诊断技术,本研究根据病原体的基因结构设计一对引物,而后用PCR方法从鸡传染性喉气管炎病毒的培养物中和临床可疑病鸡体内成功地扩增到1.4kb的DNA条带,分子量大小与预期结果一致。研究表明,用PCR方法诊断鸡传染性喉气管炎快速特异,可用于该病的确诊。

非鼠源性单克隆抗体技术及其在兽医学上的应用

自从1975年Khler和Milstein创立淋巴细胞杂交瘤技术以来,单克隆抗体(mAb)已在生物学和医学领域显示了广阔的应用前景。

旋毛虫病McAb快速ELISA诊断盒的研制与应用

本研究建立了McAb快速诊断猪旋毛虫病的ELISA试剂盒,应用旋毛虫单克隆抗体系和层析纯化抗原(PAA)与旋毛虫肌幼虫排泄一分泌抗原(ES)作常规ELISA平行检测61头人工感染旋毛虫病猪血样,阳性率均为100％,检测健康猪血样1082头,阴性率也为100％,检测疫区自然感染猪血样1253头,阳性率分别为1.44％和1.12％,随机抽采175头猪血样和肉样作旋毛虫病消化法,常规法和快速法对比试验,诊断符合率分别为100％、97.6％和95.34％。通过对25万多头活猪检测证明,该诊断盒具有良好的灵敏性、特异性和重复性,深受广大检疫人员的欢迎。