三羟基异黄酮抑制乳腺癌细胞生长的质谱研究

目的初步研究低浓度的三羟异黄酮对人乳腺癌细胞系MCF-7的生长抑制作用,并通过蛋白质组学方法探讨其分子机制。方法MCF-7细胞在含25μmol/L三羟异黄酮的培养液中分别培养1～7d后,进行MTT实验,测得生长曲线;采用顺序抽提的方法将细胞总蛋白分级为水溶性和疏水性两个组分,并应用双向电泳方法对其进行分离,以获取蛋白质的表达谱;通过软件分析,找出表达量存在显著差异的蛋白质点;再应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)与生物信息学相结合的方法对差异表达蛋白点进行分析鉴定。结果25μmol/L的三羟异黄酮对MCF-7细胞具有明显的抑制作用,并在4d后观察到细胞凋亡现象的出现;双向电泳图谱分析表明无论是水溶性蛋白质还是疏水性蛋白都取得了很好的分离,并成功鉴定出24种差异表达蛋白,其中5种下调,19种上调。结论这些蛋白质的功能涉及了细胞的生长调节、应激反应、形态和凋亡等多个方面。

黑豆盐溶球蛋白的研究

对经凝胶过滤后的黑豆盐溶球蛋白进行Native-PAGE及双向SDS-PAGE电泳分析,结果表明黑豆7S球蛋白是由3个以非共价键相结合的亚基 MW:84.7kD,72.6kD和49.2kD 连接而成;黑豆11S球蛋白中则含有以共价键相结合的亚基,同时也可能存在非共价键结合的亚基.其在还原条件下,可分解出5个肽链 MW:38.4kD,35.4kD,34.5kD,21kD和20.6kD ,且在电泳图片上明显分为两个区域.

种子盐溶球蛋白的结构特征

种子球蛋白一直是人类食物的主要来源。随着对种子球蛋白药理作用认识的不断深入 ,近年来研究重点已从单纯的序列转向结构的研究。种子球蛋白二级结构 (如α-螺旋和β-折叠 )存在较大程度的相似性 ,具有较大的保守性且与蛋白质的特殊功能关系密切 ;而三级结构之间差异明显 ,属易变异区 。

种子蛋白质亚基结构快速测定双向电泳法

介绍了还原条件与非还原条件双向电泳法 ,并应用此方法研究了种子蛋白质亚基结构。实验结果表明 ,这种双向电泳法能快速而准确地测定种子蛋白质的亚基结构。

人肺腺癌细胞系A549细胞双向电泳-飞行时间质谱研究

目的初步分析人肺腺癌细胞系A549细胞蛋白质表达情况,从蛋白组水平探讨肺腺癌发病的分子机制。方法应用2-DE技术对人肺腺癌细胞系A549细胞总蛋白进行分离,获得蛋白质表达谱;应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)结合生物信息学进行蛋白质鉴定。结果3块胶平均蛋白斑点数为1 138±49,平均匹配点数为986±32,匹配率为85.8%。随机选取背景清晰、分辨清楚、蛋白含量较高的20个斑点进行MALDI-TOF-MS分析,共获得了18个肽质量指纹图谱(PMF)。将PMFs质量数据通过Aldente软件查询SWISS-PROT数据库,根据匹配片段及氨基酸序列覆盖率等,初步鉴定出15种蛋白质。根据功能,这些蛋白质可分为:①基本代谢相关的酶类:果糖2-磷酸醛缩酶、视网醛脱氢酶1(RALDH1)、吡多醛激酶;②细胞骨架类:蛋白细胞角蛋白8(CK8)、-β2链微管蛋白;③应激相关蛋白:蛋白二硫化物异构酶A3(PDIA3);④信号转导分子:膜联蛋白1(ANX1)、膜联蛋白4(ANX4);⑤分子伴侣:热休克蛋白60(HSP60)、热休克蛋白-β1、抑制素(PHB);⑥转录及翻译相关蛋白:不均一性核糖核蛋白H(hnRNP H);⑦杂类:Rgr protein、NPM、PCBP1。结论应用2-DE/MALDI-MS方法获得了较为理想的人肺腺癌细胞系A549细胞2-DE蛋白质表达谱,初步鉴定了15种蛋白质。

小细胞肺癌细胞系SBC-5蛋白质组双向凝胶电泳图谱的建立

目的:建立人小细胞肺癌细胞系SBC-5蛋白质组双向凝胶电泳图谱。方法:用固相pH梯度双向凝胶电泳技术分离SBC-5细胞总蛋白质,凝胶银染显色,PDQuest图像分析系统分析,从凝胶中选取1个分离较好的蛋白质点,应用基质辅助激光解析离子化-飞行时间-质谱技术(MALDI-TOF-MS)和数据库搜索鉴定蛋白质。结果:获得了背景清晰、分辨率和重复性较好的双向凝胶电泳图谱,三块胶平均蛋白质点数为1116±64,匹配率达84%。蛋白质点分布以PI 4-7、相对分子质量20000-80000范围内最多。1个蛋白点通过质谱分析和数据库检索得到了初步的鉴定。结论:建立了人小细胞肺癌细胞系SBC-5蛋白质组双向电泳参考图谱,为其蛋白质组学的进一步研究奠定了基础,也为人小细胞肺癌蛋白质组表达数据库的建立提供了有意义的数据。

小细胞肺癌及其配对的正常肺组织差异表达蛋白质的双相电泳-飞行时间质谱研究

目的应用比较蛋白质组学方法分析小细胞肺癌(SCLC)与其配对的正常肺组织差异表达蛋白质,为阐明SCLC发病机制、筛选其早期诊断标志物提供有益的思路。方法应用双相电泳(2-DE)分离6例SCLC及其配对的正常肺组织可溶性总蛋白;应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)获得差异蛋白点的肽质量指纹图谱(PMF);通过Mascot软件查询NCBI或SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。结果每张图谱约检测到800多个蛋白质点。经匹配分析,肺癌组织之间和正常肺组织之间凝胶图像的匹配率分别为75.5%和78.2%;选择14个背景清晰、重复性及分辨率较好、蛋白表达差异明显的点进行质谱分析,结合表观分子量及等电点(pI),初步鉴定了11种(六类)蛋白质:①与蛋白质降解通路有关的蛋白质:蛋白酶体α亚单位3型、蛋白酶体β亚单位2型及β亚单位5型;②自由基/抗氧化剂类:锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)和黄素还原酶(FR);③细胞骨架类:原肌球蛋白-3(Tpm-3);④与能量代谢有关的蛋白质:硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX1);⑤分子伴侣:抑制素(PHB),内质网蛋白ER29(Erp29);⑥其他:可溶性NSF黏附蛋白(alpha SNAP)。结论应用2-DE及MALDI-TOF-MS方法分离并初步鉴定了11种(六类)蛋白质;这些蛋白质与SCLC发生发展密切相关,部分可能成为SCLC诊断及治疗的分子靶点。

小麦低分子量麦谷蛋白亚基组成研究

利用改良的两步一向SDS-PAGE two-step one-dimensional SDS-PAGE 分析了几种小麦低分子量麦谷蛋白亚基 L MW-GS 组成. 70 %热乙醇提取总谷蛋白,1 1 %分离胶进行第一步SDS-PAGE分离,电泳1 h后切取顶端1 cm胶条并置于巯基乙醇溶液进行还原,还原后的胶条于1 1 %～1 6.5%的梯度胶进行第二步SDS-PAGE分离.结果显示,两步一向SDS-PAGE可以彻底除去清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白对L MW-GS分离的背景干扰,提高L MW-GS的分辨率.对几种小麦低分子量麦谷蛋白亚基分析表明:L MW-GS组合比HMW-GS更为丰富,每种小麦含有2～5种B亚基,2～4种C亚基,B。

肺癌骨转移相关分子的比较蛋白质组学研究

目的:分析比较人肺癌不同骨转移潜能细胞株的差异表达蛋白质图谱,筛选在肺癌骨转移中起重要作用的关键蛋白质分子。方法:利用双向凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解析离子化-飞行时间-质谱技术,分析人肺癌骨转移细胞株SBC-5和非骨转移细胞株SBC-3/DOX蛋白质图谱的差异表达,查询数据库筛选肺癌骨转移相关蛋白质。结果:PDQuest 8.0软件分析3次相同条件下的2-DE图谱,结果显示重复性、匹配性较好。SBC-5检测到(1116±64)个蛋白点,平均匹配率为84%;SBC-3/DOX检测到(1132±72)个蛋白点,平均匹配率为82%;蛋白质点分布以PI 4-7、相对分子质量20 000-80 000范围内最多。两种细胞株16个差异蛋白质点胰酶胶内酶解,质谱分析获得14张肽质量指纹谱,鉴定出Annexin A1,CaN,IGFBP-1,ADAM32等8种胶内差异蛋白质。结论:人肺癌不同骨转移潜能细胞株SBC-5和SBC-3/DOX的2-DE蛋白质图谱具有明显的差异表达,多种差异表达蛋白可能与肺癌骨转移相关。

破骨细胞形成过程中在牵张力下的差异蛋白分析

目的:应用比较蛋白质组学的方法分析破骨细胞在牵张应力作用下蛋白质的差异表达,为阐明牵张力对破骨细胞的形成机制提供分子基础。方法:利用人骨髓单核细胞,牵张应力加载培养体系诱导培养破骨细胞,分为加力组与对照组。应用双向电泳分离以上两组样本可溶性蛋白质。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱获得差异蛋白点的肽质量指纹图谱;通过SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。结果:得到两张2-DE图谱,初步筛选出在牵张力的作用下,有13个蛋白点的表达存在明显差异。其中新增蛋白点1个,缺失7个,2个蛋白点表达发生明显上调,3个蛋白点发生明显下调。经质谱分析,初步鉴定了2种蛋白质。结论:应用2-DE及MALDI-TOF-MS方法分离并初步鉴定了2种蛋白质,为研究牵张力在破骨细胞形成过程中的机制以及正畸骨改建的发生机理提供线索。

人源性表皮黑素细胞膜蛋白双向电泳技术初步建立及优化设计

目的:初步建立人源性表皮黑素细胞膜蛋白质组学研究中的双向电泳分离技术,优化膜蛋白提纯方法,以提高细胞膜蛋白的分辨率、敏感度和可重复性。方法:采用固相pH梯度(IPG)等电聚焦(IEF)为第一向、SDS-PAGE垂直电泳为第二向的双向电泳技术,对样品处理、水化等提取膜蛋白步骤进行了优化,与常规的提取膜蛋白的方法进行了比较。结果:经优化提纯方法所得样品经3次重复实验,获得了高分辨率的双向电泳图,可分离蛋白质斑点数达500多个,蛋白分布比较均匀、范围广,蛋白点没有脱尾现象,与常规提取膜蛋白的方法比较具有显著优势。结论:优化的蛋白提纯方法更适合细胞膜蛋白的蛋白组学研究。

静压力作用下人牙周膜细胞差异表达蛋白质的质谱分析

目的:观察人牙周膜细胞静压力下细胞内蛋白质表达的变化,为进一步探讨静压力与人牙周膜细胞代谢之间的关系奠定基础。方法:采用固相pH梯度/SDS-PAGE双向电泳和质谱分析技术,对人牙周膜细胞静压力干预组和未加力组细胞胞内总蛋白质进行分析,应用Image Master 2D Platinum Software 5.0分析软件,鉴定2组细胞的双向电泳图谱,差异表达的蛋白质点为30个,选择其中5个新出现的差异点进行质谱分析和数据库检索。结果:第3和第5个蛋白质点得到了鉴定,分别为早老蛋白(presenilin 2)和儿茶酚胺-O-甲基转移酶(catechol O-methyltransferase),2种蛋白质在加力组中新表达。结论:早老蛋白与Notch蛋白具有相关性,而Notch通路可能是参与牙周膜细胞生物力学改建的一条信号传导途径;儿茶酚胺-O-甲基转移酶与降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)有关,而CGRP在骨代谢中发挥重要作用。

牙齿发育早期间充质细胞的差异蛋白分析

目的:应用蛋白质组学方法分析间充质细胞在牙齿发育早期不同阶段的蛋白质差异表达情况,从蛋白水平进一步了解牙齿发育早期的分子机制。方法:制备C57胎鼠起始期(E11.5)、蕾状期(E13.5)冰冻切片,通过激光捕获显微切割技术(LCM)获取两个时期下颌第一磨牙牙胚间充质细胞,采用双向凝胶电泳方法分离蛋白质,比较分析凝胶图像,通过质谱及生物信息学分析鉴定差异蛋白。结果:激光捕获了较纯的目的细胞,得到双向凝胶电泳图谱,比较分析发现E13.5组8个蛋白点明显上调,E11.5组5个蛋白点发生明显上调。质谱分析初步鉴定了蛋白质种类。结论:LCM技术能较好地获取较为均一的目的细胞,并发现牙胚发育起始期与蕾状期间充质细胞蛋白质表达存在差异,为牙胚早期发生的分子机制研究提供一种新的方法。