利用RT-PCR的方法检测恶性疟原虫海南株FCC1/HN CT基因在红细胞内期的表达及CTP基因真核表达载体的构建(英文)

目的 利用反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）的方法检测ＣＴＰ基因是否在恶性疟原虫红内期表达，并构建ＣＴＰ因的真核表达载体，以便进一步研究其功能。方法 按常规方法体外培养红内期恶性疟原虫，用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取红内期疟原虫总ＲＮＡ．通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ珠ＣＴＰ Ｍ码基因并构建ＣＴＰ基因的真核表达载体。结果 获得了恶性疟原虫ＣＴＰｃＤＮＡ的全编码区序列并将其克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３。结论（ＣＴＰ基因在恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株红细胞内期表达并成功地构建了ＣＴＰ基因的重组表达质粒。

恶性疟原虫海南株CTP基因的克隆测序及序列分析

目的 测定恶性疟原虫 (P f)海南株CTP基因序列 ,了解该虫株CTP基因序列与其它种类的CTP基因序列的差异 ,用于药物靶位的筛选。方法 用PCR的方法特异性的扩增CTP基因 ,并将此基因克隆于测序载体 pUC19,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序。结果 我国海南株的CTP基因序列与其它的CTP基因有不同程度的差异。结论 P .

细粒棘球蚴生发细胞体外培养的实验观察

目的 :为培育人源细粒棘球蚴细胞系 (株 ) ,以供用于免疫预防研究。方法 :用外科方法从临床确诊的细粒棘球蚴患者的肝脏中取出包囊 ,以生发层和原头节为培养材料 ,采用RPMI1640、199和改良 DMEM培养液 ,用鼠尾胶原蛋白包被和不包被的培养瓶 ,对其进行初培养 ,并进行对比观察。结果 :以胶原蛋白作为支撑材料 ,应用改良 DMEM培养液培养的人源细粒棘球蚴生发层和原头节效果优于其他 ,已成功地培育了人源细粒棘球蚴细胞系 ,并传至第 2 0代。原代培养时间需 2 8d- 4 5d,3代以内细胞为多形态性。结论 :建立了适合人源细粒棘球蚴细胞体外培养的方法。

细粒棘球蚴细胞系培育及其免疫研究

从细粒棘球蚴病人体内获取生发层和原头节作为培养材料 ,采用改良DMEM培养液和鼠胶原蛋白包被的培养瓶进行细胞培养 ,建立了适合人源细粒棘球蚴细胞体外培养的方法 ,并探讨棘球蚴细胞培养的制约因素。首次成功培育出一株人源细粒棘球蚴细胞系 ( 13G 5 ) ,至 1997年 3月 1日为止该细胞系已培养了 140d ,其间传了 2 1代。该细胞系主要以成纤维型细胞为主 ,呈贴壁生长 ;用该细胞系细胞接种于昆明 (Km)小鼠腹腔内 ,能形成具包囊样结构的类似包囊 ;接种鼠产生对囊液抗原的特异性抗体 ;ELISA能够检测出细胞系细胞代谢物中特异性抗原 ;该细胞系细胞和E .granulosus原头节、包囊液具有相同的EST酶带 ;使用该细胞系细胞的代谢物作为粗制抗原进行免疫预防接种 ,能使 6 0 %的Km小鼠获得完全抵抗E .granulosus感染的能力 ;该抗原能使 43 33%～ 77 42 %的包虫病人诊断出来。此外 ,检定了人源细粒棘球蚴染色体 ,染色体数为 14～ 18条 ,并首次对其进行了G 、C

细粒棘球蚴细胞系13G-5培育

从１８例棘球蚴病人的包囊分离棘球蚴细胞，经３６批次体外培养获得１株细粒棘球蚴细胞系（１３Ｇ－５细胞系），已培养１４０ｄ，传２１代，并继续扩大增殖培养。测定了该细胞系第１３代细胞生长曲线和集落形成率（４％）。１３Ｇ－５细胞系５代以前为多形性细胞，后逐渐以成纤维型细胞占优势。探讨了棘球蚴细胞培养的制约因素。

细粒棘球蚴全长cDNA文库的构建及初步鉴定

目的 分离目的基因构建cDNA文库的经典方法繁琐且不易得到全长cDNA(3’和 5’端 ,尤其是基因的 5’非翻译区 )。本研究通过构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,筛选全长目的基因 ,研究其结构和功能。方法 采用TRIZOL试剂提取E .granulosus总RNA ,用ClonTech公司的SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建E .granulosus原头节全长cDNA文库 ,文库的包装使用EICENTERTECHNOLOGIES公司提供的包装蛋白。结果与结论 成功构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,文库滴度为 1.4× 10 7pfu/ml。文库的重组效率达到 99%以上 ,插入片段长度约为 1.1kb。

犬肝硬化模型的建立

于犬背部皮下多点注射60％四氯化碳菜籽油乳剂(1.5mL/kg）,每10d注射1次,共6次,并饮用10％乙醇,8周后肝硬化形成,饮乙醇犬肝硬化形成时间较饮常用水缩短10～15d,且病变明显。

流感病毒A HA(H3N2)基因真核表达载体的构建及序列分析

目的 获得血凝素基因 (HA)基因 ,将其克隆到真核表达载体 ,为研究流感DNA疫苗奠定基础。方法 从当年流感病人体内分离病毒 (A/Guangdong/ 4 4 8/ 2 0 0 1) ,鉴定型别 (H3N2 )后 ,提取RNA ,用特异引物进行RT PCR ,扩增HA ,并将其克隆到pMD18 TVector,进行序列测定和分析 ;然后将HA基因亚克隆到真核表达载体 (pCI neo) ,进行鉴定。结果 获得一个核苷酸长度为 16 98bp的基因 ,编码 5 6 5个氨基酸 ;与A/Beijing/ 32 / 92 (Genbank/NCBI:U2 6 830 )基因序列有 98%同源 ,有 15个碱基和 /或 10个氨基酸出现变异 ,且在 2 12缺失一个氨基酸V ;酶切和序列测定表明HA基因正确插入pCI neo载体 (HA pCIN)。结论 成功构建了HA基因真核表达载体 。

细粒棘球蚴细胞系(13G-5)细胞代谢抗原的免疫原性和反应原性

应用培育成功的人源细粒棘球蚴细胞系(13G-5)细胞的天然代谢抗原,接种昆明小鼠,于接种后第14天给免疫小鼠接种人源细粒棘球蚴原头节约1 000 个,于200 d 剖检观察有无包囊形成,病理切片鉴定;并用该抗原作为诊断抗原,使用间接血凝(IHA)、琼脂扩散(AGD)试验,检测临床确诊的细粒棘球蚴病人血清。以多房棘球蚴病人血清、细颈囊尾蚴羊血清及正常人血清作为对照。结果表明,该抗原能使60% 的小鼠获得完全抵抗细粒棘球蚴原头节攻击的能力,未完全获得保护的小鼠形成包囊的数量、大小较对照组明显减少,且为不育囊;使用该抗原IHA 检测31 份血清,阳性24 份,阳性率77.42% ,AGD检测30 份血清,阳性13 份,阳性率43.33% ,2 种方法对多房棘球蚴病人血清和细颈囊尾蚴羊血清及正常人血清不起反应。

酯酶同工酶鉴定细粒棘球蚴细胞系(13G-5)种属来源

目的 鉴定细粒棘球蚴细胞系细胞的种属来源。方法 应用SDS凝胶电泳测定细粒棘球蚴细胞系酯酶同工酶 (EST) ,并和E granulosus原头节、囊液及包虫病人血清作比较。结果 细粒棘球蚴细胞系、E granulosus原头节、囊液含有相同的酯酶同工酶谱 ,在同一位点出现相同的一条酶带。结论 实验结果表明从包虫病人培育的 13G - 5细胞确系来源于E granulosus细胞。

细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列分析

【目的】获得细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列 ,并进行序列分析。【方法】从包虫病羊体内获取细粒棘球蚴原头节 ,使用TRIZOL试剂提取总RNA ,逆转录成cDNA。根据E .granulosus抗原B亚单位基因的已知序列设计一对引物 ,采用RT PCR技术扩增出抗原B亚单位基因 ;将PCR产物纯化后用双脱氧链末端终止法进行序列测定 ,并进行序列分析。【结果】用RT PCR成功扩增出细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列 ,测序表明该基因ORF为 2 70bp ,和已发表基因核苷酸序列相比 ,缺失 3个碱基 ,同源性为 84 2 % ,推导编码氨基酸序列同源性为 77 8%。【结论】从E .granulosuscDNA扩增出抗原B亚单位基因 ,该基因编码 8ku亚单位前体蛋白。

绵羊进行性肺炎血清学调查

琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID)检查表明,新疆特克斯、昭苏、尼勒克、伊吾4个马场的绵羊均自然感染绵羊进行性肺炎(OPP),平均感染率为3.5％。倍比稀释试验表明,OPP琼扩抗原浓度对检出率影响极大(P<0.01)。

人源细粒棘球蚴染色体测定

为鉴定棘球地细胞系及棘球绦虫的遗传分类提供依据，本实验测定了人源细粒棘球拗染色体。从外科手术的包虫病人体内获取棘球蚴原头节和生发层细胞，按染色体的常规制备方法并加以改进，制备染色体标本。通过对141个分裂像的观察分析，结果表明细粒棘球蚴染色体组的染色体数在5～20条之间，14～18条占明显优势。每一核型有一对染色体呈大棒状，似呈中间或亚中着丝粒，其余染色体呈方点状，似呈端着丝粒。本实验建立了适合棘球蚴染色体制备的方法，在国内首次测定了人源细粒棘球蚴染色体。

细粒棘球蚴细胞系(13G-5)鉴定

:【目的】鉴定 13G 5细胞系细胞是否来源于细粒棘球蚴细胞。【方法】用不同代次的细胞系细胞接种Km小鼠腹腔 ,观察是否形成包囊或类似包囊 ,病理切片证实 ;用形成的包囊材料进行体外培养 ;测定接种小鼠的特异抗体效价 ;用酯酶同工酶鉴定细胞系。【结果】细胞系细胞在小鼠腹腔能形成包囊或类似包囊 ,病理切片观察包囊结构清楚 ,体外培养 ,未能见到细胞贴壁生长和活原头节 ,将培养悬液涂片 ,吉姆萨染色后镜检 ,只见到极少量细胞 (类似于生发层细胞 ) ,也未见到原头节。实验鼠抗体滴度的倒数为 32 0～ 5 12 0之间 ;酯酶同工酶检测结果 :细粒棘球蚴原头节、13G 5细胞系细胞、包囊液含有相同的酯酶同工酶谱 ,在同一位点出现相同的一条酶带。【结论】 13G 5细胞系来源于细粒棘球蚴细胞。

拉合尔钝缘蜱对小鼠免疫细胞的影响

被拉合尔钝缘蜱饥饿成虫叮咬饱血后的Ｋｍ小白鼠，于１４ｄ内三次测定成熟Ｔ淋巴细胞对ＰＨＡ的反应能力。结果显示：小白鼠的免疫功能受到高度抑制。从免疫学角度分析了该蜱的致病机理，为蜱媒病的防治提供了科学依据。

A型流感病毒HA(H1N1)基因真核表达载体的构建及序列分析

[目的]构建A型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因真核表达载体,研究其作为DNA疫苗的免疫效果。[方法]从流感病人体内分离流感病毒(A/Guangdong/376/2001/H1N1),提取RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增HA基因,先将其克隆到pMD18-T Vector,进行序列测定和分析;然后将HA基因亚克隆到真核表达载体(pCI-neo),进行鉴定。[结果]获得一个核苷酸长度为1698bp的基因,编码565个氨基酸;同源性比较结果表明:和A/Hong Kong/1131/98(GenBank/NCBI:AF386775)有98％同源,序列分析表明有10个氨基酸出现变异;酶切和序列测定表明HA基因正确插入pCI-neo载体(HA-pCIN)。[结论]HA基因真核表达载体的成功构建,可以进一步研究其免疫功能。

脾肺固定术治疗犬肝硬化—门脉高压症

脾肺固定术治疗犬肝硬化—门脉高压症陆家海，卢开柏，杜立智，杜宝昆，李新力，曹建书，员逢全，杨建民，张都民（兰州军区乌鲁木齐总医院，乌鲁木齐８３００００）脾肺固定术主要用于治疗儿童Ｂｕｄｄ－Ｃｈｉａｒｉ氏综合征［１］．实验证明，本法用在肝炎后肝硬变的门...

拉赫钝缘蜱对豚鼠免疫细胞的影响

本文报告用拉赫钝缘叮咬豚鼠后ａ－醋酸萘酯酶（ＡＮＡＥ）阳性率于第３天较对照组有明显降低，１４ｄ仍低于正常值水平。认为酯酶染色法测定Ｔ淋巴细胞ＡＮＡＥ阳性率的高低可作为判定细胞免疫功能的一项指标。

蜱的致病机理研究

以豚鼠和兔子为供血动物，探讨了实验室条件下拉合尔钝缘蜱和小亚璃眼蜱人工繁衍的技术，观察了它们的生活史、生理、生态特点。实验表明：在２６℃、ＲＨ６０％条件下，以豚鼠为供血动物时，拉合尔钝缘蜱自幼蜱吸血至第Ⅲ期若蜱饱血离体共需２４～４２天，平均３３天，每只雌蜱平均产卵３２０个左右，卵期２８～４０天。在２０℃、ＲＨ８０％条件下，以兔为供血动物时，小亚璃喂蜱饥饿成虫平均８天饱血离体，１８天开始产卵，从卵内孵出幼虫需６５天，幼虫和若虫叮咬吸血至离体需２０天，平均３５天蜕变为饥饿成虫，以豚鼠为供血动物时，该幼虫１５天饱血离体，１０天蜕变为饱血若虫，而饥饿成虫饱血远较在兔体缓慢，叮咬吸血１０天未见到饱血成蜱。其次，对１个和２个拉合尔钝缘蜱饥饿成虫叮咬ＫＭ小鼠后，于饱血后第４天，７天。１４天进行免疫、遗传毒理、病理形态学检查的结果表明：①该蜱叮咬可导致小鼠Ｔ淋巴细胞ＡＮＡＥ阳性率、骨髓和脾脏淋巴细胞转化率降好、降低程度与叮咬蜱的数量有关，说明该蜱叮咬可导致小鼠免疫功能高度抑制，这有利于蜱的寄生和蜱媒疾病的扩散，②该蜱的叮咬可导致小鼠染色体畸变细胞率、微该细胞率（ＭＮＦＣＥ）增高，染色体畸变类型有ｃｔｇ、ｃｔｂ、ｄｅｌ、ｐｖ?