A-PRF促进兔膝关节骨软骨损伤愈合的观察

目的·探讨改良型富血小板纤维蛋白(advanced platelet-rich fibrin,A-PRF)在骨软骨再生中的作用。方法·获取新西兰兔骨髓间充质干细胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和膝关节软骨细胞;通过低速离心兔心脏血液获得A-PRF。采用光学显微镜观察A-PRF的组织学结构;ELISA法检测A-PRF中生长因子,包括血小板衍生生长因子、转化生长因子-β、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子的释放;采用活/死细胞双染法及MTT法检测A-PRF对兔BMSCs细胞毒性及增殖情况的影响;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测A-PRF对兔BMSCsⅡ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖、碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN)基因表达的影响;使用transwell小室测定A-PRF对于兔BMSCs以及软骨细胞迁移能力的影响。建立兔膝关节骨软骨缺损模型,将18只兔随机分为3组:A-PRF组(n=6)在缺损处植入A-PRF;A-PRF+BMSCs组(n=6)植入接种兔BMSCs的A-PRF;对照组(n=6)不进行植入操作。术后12周处死兔,采用苏木精-伊红(H-E)、甲苯胺蓝和番红O-固绿染色进行膝关节标本的组织学观察,并根据膝关节的表面形态学与组织学情况,采用国际软骨修复协会(International Cartilage Repair Society,ICRS)评分系统进行宏观与组织学评分。结果·A-PRF具有松散的网络结构,可以缓慢释放生长因子。加入A-PRF后,未观察到其对兔BMSCs具有细胞毒性;在加入A-PRF后24、48和72 h,BMSCs的增殖能力均明显升高(均P<0.05),成软骨相关基因Ⅱ型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖,以及成骨相关基因ALP和OCN均显著上调(均P<0.05)。加入A-PRF后,兔BMSCs与软骨细胞的迁移能力均显著增强(均P<0.05),且兔BMSCs的迁移能力显著高于软骨细胞(P=0.025)。在兔膝关节缺损模型中,观察关节表面形态,可见A-PRF组和A-PRF+BMSCs组缺损均基本恢复,而对照组仅有软组织覆盖。在ICRS宏观评分方面,A-PRF组与A-PRF+BMSCs组的差异无统计学意义,但2组评分均显著高于对照组(均P<0.05)。组织学观察显示,A-PRF组和A-PRF+BMSCs组均产生骨软骨修复,但A-PRF组软骨更加成熟,对照组则形成纤维修复。在ICRS组织学评分方面,A-PRF组与A-PRF+BMSCs组的差异无统计学意义,但2组评分均显著高于对照组(均P<0.05)。结论·自体A-PRF具有良好的生物相容性和促进BMSCs增殖的能力,在体外和体内均可促进软骨和软骨下骨的修复。

含毛喉素的条件培养液诱导脂肪来源干细胞神经分化的体外实验研究

目的:利用神经诱导液体外诱导大鼠脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)神经分化,探索对ASCs体外成神经分化的最佳毛喉素浓度,并研究该浓度的培养液对ASCs体外成神经分化的作用。方法:酶消化法获得原代ASCs,通过流式细胞术和细胞染色鉴定ASCs的表型和多向分化能力。体外用含不同浓度毛喉素的神经诱导条件培养液进行神经诱导分化,采用免疫荧光染色技术筛选最佳浓度。采用含最佳浓度毛喉素的神经诱导条件培养液诱导ASCs,镜下观察诱导前后细胞的形态学特征,采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和免疫荧光检测诱导前后细胞中神经分化标志物的mRNA和蛋白表达变化情况。结果:神经诱导条件培养液中毛喉素的最佳浓度为10μmol/L,含该浓度毛喉素的神经诱导条件培养液诱导的细胞,能够迅速诱导ASCs向成神经方向分化。诱导后,细胞形态类似神经细胞,神经细胞标志物抗β-Ⅲ微管蛋白(classⅢβ-tubulin,Tuj1)、神经丝蛋白(neurofilament-M,NF-M)、巢蛋白(nestin)抗体和S100β的mRNA水平和蛋白水平均表达增加(P<0.05)。结论:含毛喉素浓度为10μmol/L的诱导培养液能诱导ASCs神经分化,诱导细胞有望成为周围神经种子细胞。

人乳牙牙髓干细胞的体外培养观察

目的:体外分离、培养人乳牙牙髓干细胞。方法:采用酶消化法将人乳牙牙髓分离培养,以获得人乳牙牙髓干细胞。有限稀释法分离纯化,测定细胞克隆形成率,细胞计数法测生长曲线,细胞爬片行HE染色、碱性磷酸酶染色、抗波形蛋白(vimentin)免疫组化染色。结果:通过有限稀释法获得了克隆形成率为11～24个/103,细胞群体倍增时间为39.84h,HE染色细胞形态为梭形、细胞体小、胞核大的干细胞。且碱性磷酸酶染色阳性,抗波形蛋白(vimentin)免疫组化染色阳性。结论:人乳牙牙髓中可分离培养出牙髓干细胞。

乳牙牙髓干细胞体外诱导成骨细胞的实验研究

目的:体外分离、培养人乳牙牙髓干细胞,并向成骨细胞诱导。方法:采用酶消化法分离获得人乳牙牙髓干细胞,有限稀释法分离纯化,测定细胞克隆形成率,细胞计数法测定生长曲线,细胞爬片行HE染色,抗波形蛋白(Vimentin)、CD44和STRO-1免疫组化染色,并向成骨细胞诱导,行HE染色、碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、Van Gieson染色和抗骨钙素免疫组化染色进行鉴定。结果:通过有限稀释法获得了人乳牙牙髓干细胞,并诱导成成骨细胞,表现出与典型成骨细胞相似的形态特征和生物学特征。结论:成功从人乳牙牙髓中分离出牙髓干细胞,并诱导为成骨细胞。

山羊乳牙牙髓细胞体外培养和绿色荧光转染的研究

目的:体外分离、培养山羊乳牙牙髓细胞,并转染绿色荧光蛋白。方法:采用组织块法获得山羊乳牙牙髓细胞,细胞计数法测定生长曲线,细胞爬片行HE染色、碱性磷酸酶染色、抗波形蛋白和角蛋白免疫组化染色。加入含GFP反转录病毒液转染山羊乳牙牙髓细胞。结果:通过组织块法获得了山羊乳牙牙髓细胞,细胞群体倍增时间为43.79h。HE染色显示细胞形态为梭形,细胞体小,胞核大。细胞碱性磷酸酶染色阳性,抗波形蛋白免疫组化染色阳性,抗角蛋白免疫组化染色阴性。转染绿色荧光蛋白后,细胞能持续表达绿色荧光。结论:山羊乳牙牙髓组织可分离培养出间叶来源的乳牙牙髓细胞,并成功使之表达绿色荧光。

石墨烯块体材料在再生医学中的应用

石墨烯块体材料能最佳模仿细胞外基质的理化特性和生物学性能,促使干细胞粘附、生长和定向分化。干细胞能和石墨烯相互作用,并向成骨细胞、神经细胞和心肌细胞等方向分化,具有口腔组织、骨组织、神经和心脏的再生潜能。

山羊乳牙牙髓细胞分离培养与矿化诱导的体外研究

目的:分离培养山羊乳牙牙髓细胞,研究其矿化诱导前、后生物学特性的改变。方法:采用改良酶解组织块法培养山羊乳牙牙髓细胞,应用免疫组化方法(SAB法)对第2代细胞进行来源检测,经矿化诱导培养的第4代细胞与常规培养细胞做对照,进行相关生物学特性检测,包括细胞增殖能力、矿化能力、细胞形态改变、蛋白OCN表达、相关成骨基因(ALP、COL-I、OCN、OPN)表达水平。结果:改良酶解组织块法可较快地培养出山羊乳牙牙髓细胞,细胞爬出时间为培养的第3～4天。第2代细胞抗波丝蛋白阳性,抗角蛋白阴性,证明其间充质来源。MTT法测定显示,未诱导细胞的增殖能力明显高于矿化诱导后的细胞。与未诱导细胞相比较,矿化诱导的细胞ALP染色、钙结节茜素红染色均呈强阳性,免疫组化OCN阳性表达。诱导14d后,定时定量PCR检测证实成骨基因OCN、ALP显著上调。结论:本实验采用改良酶解组织块法成功培养出山羊乳牙牙髓细胞;连续矿化诱导培养14d后,山羊乳牙牙髓细胞分泌矿化基质,具有向成骨细胞分化和形成骨组织的潜能。

富血小板血浆促进人牙髓细胞增殖的实验研究

目的探讨不同浓度富血小板血浆(Platelet rich plasma,PRP)对人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPCs)的增殖作用。方法两步离心法制备PRP,通过ELISA的方法测定PRP中两种主要生长因子血小板源性生长因子(PDGF-AB)和转化生长因子(TGF-β1)的浓度;用四唑盐比色法(MTT)观察5%、10%、20%PRP在2d、4d时对牙髓细胞的增殖作用,并探讨这种作用是否依赖于胎牛血清(FBS)的存在。结果所制备的PRP中血小板的浓度大于1000×109个/L,为全血中的4倍以上,经ELISA的方法测定PRP及贫血小板血浆(Platelet poor plasma,PPP)中PDGF-AB、TGF-β1的浓度分别增加4倍以上。MTT法测定不同浓度组的PRP对牙髓细胞均有增殖作用,以10%PRP增殖效应最明显,P值均<0.05;4d时PRP对细胞的增殖作用明显强于2d时,P值<0.05;10%PRP组较10%胎牛血清组增殖作用明显,P值<0.05。结论本实验制备的PRP含有较高浓度的PDGF-AB及TGF-β1,不同浓度的PRP均能有效促进牙髓细胞增殖,以10%PRP浓度增殖效应最明显;并且这种增殖作用并不依赖于胎牛血清的存在;随着时间延长,PRP对细胞增殖作用增加。

犬PRF复合BMSCs修复拔牙窝颊侧骨壁缺损的实验研究

目的:评价富血小板纤维蛋白(PRF)构建的组织工程骨,在颊侧骨壁缺损修复中的成骨作用。方法:体外将PRF作用于比格犬的骨髓间充质干细胞(BMSCs),第21天测定钙结节量;4、7、11 d时采用实时定量PCR法检测成骨相关基因。9只成年比格犬拔除上颌左右两侧的侧切牙,构建颊侧骨壁缺损的拔牙位点,并随机分为血凝块组、PRF组和组织工程骨组,在手术后即刻、6周及12周时评价各组的颊侧骨高度和拔牙窝的骨密度。结果:PRF在体外实验中能明显促进BMSCs的增殖,提高成骨分化以及钙化能力(P<0.05)。动物实验中,PRF表现出了促进早期伤口愈合的能力。在颊侧骨壁缺损的修复中,组织工程组在6周时骨高度和骨密度分别为(2.63±0.57)mm、(765.19±59.70)HU,较血凝块组[(5.65±2.91)mm、(599.08±53.88)HU]和PRF组[(4.14±1.16)mm、(644.76±65.39)HU]显著增高(P<0.05)。结论:PRF复合BMSCs构建的组织工程骨可以在早期有效地修复拔牙窝骨壁缺损。

自撑式石墨烯水凝胶诱导人脂肪干细胞成骨分化的体外研究

目的通过体外实验评价本课题组制备的自撑式石墨烯水凝胶(self-sustaining graphene hydrogel,SGH)的骨诱导性能。方法 (1)将人脂肪干细胞(hADSC)接种于SGH和玻片表面,采用荧光显微镜图像计数检测ADSC在材料表面粘附能力;通过扫描电镜观察材料本身的表征及细胞在SGH表面生长的形态;(2)SGH组加入普通培养液作为实验组,玻片组加入成骨培养基作为诱导组,玻片组加入普通培养液作为对照;通过实时定量荧光PCR、ALP活性检测和茜素红半定量测定钙沉积评价各组hADSC的分化及成骨能力。结果 hADSC能以等同于在玻片表面的粘附效率和正常的形态在SGH表面生长。实验组细胞在不同时间点成骨相关基因的表达水平、ALP活性以及钙盐沉积量均显著高于对照组而略低于诱导组(P<0.05)。结论自撑式石墨烯水凝胶作为一种生物相容性材料,具有较强的诱导人脂肪干细胞成骨分化的能力。

富血小板纤维蛋白对牙髓细胞增殖与分化的影响

目的:评估牙髓细胞在富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)存在下的体外增殖及成骨分化的能力,为PRF作为支架材料、牙髓细胞作为种子细胞构建组织工程骨,进行前期研究。方法:3月龄比格犬拔除乳磨牙获得乳牙牙髓细胞;恒牙牙髓细胞从16月龄成年比格犬磨牙获得。静脉取血离心10 min获得PRF。实验分4组:对照组(普通培养基不加入PRF);实验组A(普通培养基加入PRF);实验组B(成骨诱导培养基不加入PRF);实验组C(成骨诱导培养基加入PRF)。分别于1、4、7和11d测定细胞数量、MTT值、半定量碱性磷酸酶值、成骨相关基因Q-PCR值,并于21d测定钙结节吸光度值。结果:PRF是一种可以促进牙髓细胞增殖的,无毒性作用的纤维网状支架结构;细胞水平上PRF促进了两种细胞的成骨分化:钙结节以及碱性磷酸酶半定量数值都明显上调(P<0.05);基因水平上,4个时间点成骨相关基因的表达量都显著增加(P<0.05),且乳牙牙髓细胞的表现均优于恒牙牙髓细胞。结论:可使用PRF和牙髓细胞复合构建组织工程骨。

猪小肠黏膜下层作为盖髓剂的初步研究

目的探讨猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)的生物相容性及作为盖髓材料的可行性。方法用Abraham法制备的猪小肠黏膜下层,与人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPCs)在体外复合培养并进行矿化诱导,观察细胞生长情况,并分别在复合培养第7、14、21天检测牙髓细胞的碱性磷酸酶活性水平,无材料的牙髓细胞矿化诱导组作为对照组。结果牙髓细胞在猪小肠黏膜下层上生长良好,细胞表面有矿化晶体形成,说明其具有良好的生物相容性,其碱性磷酸酶活性水平在第7、14、21天均高于对照组。结论 Abraham方法制备的猪小肠黏膜下层有良好的生物相容性,在体外能促进牙髓细胞矿化,有望成为一种新型的盖髓剂。

国产ZDI种植体的长期临床效果分析

目的 观察和评价国产ZDI种植系统的长期临床效果。方法 通过观察随访35例种植病例,共计46枚ZDI种植体在修复完成后6年内生物和机械并发症的发生率、种植体周围骨吸收的程度以及患者对修复效果的满意度来评估ZDI种植系统的临床效果。结果 修复6年后,仅有两枚种植体发生种植体周围炎,一例牙冠脱落,无其他种植体及上部结构相关的机械并发症,累计成功率为95.7%、存留率为100%;患者总体满意度达(9.79±0.29)分。结论 只要规范种植操作,精确制作修复体,维持良好的口腔卫生,ZDI种植系统能获得良好的长期临床效果。

猪小肠黏膜下层复合支架修复兔下颌骨缺损

目的应用猪小肠黏膜下层(SIS)与纳米β-磷酸三钙(β-TCP)结合的复合支架材料,修复兔下颌骨缺损。方法13只新西兰大白兔于双侧下颌骨制备骨缺损,分别应用SIS(SIS组)、纳米β-TCP(β-TCP组)以及两者混合制备成的复合支架材料(复合支架组)进行骨缺损的修复,并设置空白对照(对照组)。术后12周时缺损处取材,分别进行大体和组织学观察、X线检查及骨密度测定。结果术后12周时,新生骨小梁占据大部分缺损区域。复合支架组和SIS组的修复材料已基本降解,β-TCP组残余少量材料。复合支架组骨密度较高,新生骨小梁形态较成熟;对照组新生骨小梁较其他各组数量少且不规则,而胶原成分较多。结论猪SIS与纳米β-TCP复合支架材料,具有良好的成骨特性和组织相容性,能够有效地修复下颌骨缺损。

山羊乳牙牙髓干细胞在肌袋内的异位成骨

目的:评价山羊乳牙牙髓干细胞复合多孔磷酸钙骨水泥在山羊肌袋模型内的异位成骨能力。方法:采用改良组织块法培养山羊乳牙牙髓干细胞。经成骨诱导条件培养的第3代细胞与多孔磷酸钙骨水泥复合后,植入山羊背部左侧肌袋,将多孔磷酸钙骨水泥空白支架植入右侧肌袋作为对照组。分别在植入后2、4、6、8周取材,进行组织学观察,采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果:术后各时间点未复合细胞的pCPC支架材料组织学检查未见类骨质形成。SGDs-pCPC组中,术后2、4、6、8周成骨率分别为(1.24±0.25)%、(1.59±0.23)%、(4.12±0.39)%和(5.68±0.58)%。术后2周和4周之间的成骨率无显著差异(P>0.05);术后8周的成骨率高于术后6周,且2者均显著高于2周和4周组的成骨率(P<0.05)。结论:多孔磷酸钙复合山羊乳牙牙髓干细胞在山羊体内具有异位成骨能力。

山羊乳牙牙髓细胞复合多孔磷酸钙骨水泥异位成骨研究

目的:观察山羊乳牙牙髓细胞(SGDs)与多孔磷酸钙骨水泥之间的生物相容性及其异位成骨能力。方法:流式细胞仪检测第1代SGDs的STRO-1表达情况;体外培养的第4代SGDs进行成骨诱导7d后,与多孔磷酸钙骨水泥复合培养,扫描电镜下观察SGDs黏附和生长情况;细胞材料复合物植入裸鼠皮下8周观察异位成骨能力。结果:SGDs与多孔磷酸钙骨水泥复合培养3d后,细胞与材料表面贴合,形态正常,可见细胞伸出伪足,分泌胞外基质;裸鼠体内植入8周后,HE染色显示骨样组织形成,免疫组化OC呈阳性表达。结论:SGDs可以向成骨细胞分化,并具有诱导成骨能力,与多孔磷酸钙骨水泥结合,可形成骨样组织。

小肠黏膜下层复合材料修复兔下颌骨缺损

目的探讨猪小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)与纳米β-磷酸三钙(nano meter crystalβ-tricalciumphosphate,nmβ-TCP)结合形成的复合支架材料修复骨组织缺损的作用。方法新西兰大白兔13只,在双侧下颌骨上制备骨缺损模型,随机分为4组,分别使用SIS、nmβ-TCP及两者混合制成的复合支架材料进行修复,并设置空白对照。12周时处死动物取材,进行组织学切片及扫描电镜观察,计算骨矿化沉积率(mineralapposition rate,MiAR)、骨小梁厚度(trabecular thichness,Tb.Th)和体积分数,并作统计学处理。结果 12周时新生骨小梁占据大部分缺损区域,材料已基本降解,nmβ-TCP组残余少量材料。复合支架组新生骨小梁形态较成熟,荧光双带距离较宽,MiAR、Tb.Th以及骨小梁体积分数均明显高于其他几组(P<0.05)。结论猪SIS与nmβ-TCP混合制成的复合支架材料,具有良好的成骨特性和组织相容性,能够有效地修复下颌骨缺损。

山羊乳牙牙髓干细胞构建组织工程骨的异位成骨研究

目的:评价山羊乳牙牙髓干细胞在体外的成骨分化能力,及复合多孔磷酸钙骨水泥在山羊肌袋模型内的异位成骨能力。方法:采用改良组织块法培养山羊乳牙牙髓干细胞,并且在成骨诱导条件下培养。经成骨条件培养的第3代细胞与多孔磷酸钙骨水泥复合后,植入山羊背部左侧肌袋;将多孔磷酸钙骨水泥空白支架植入右侧肌袋作为对照组。分别在植入后4、8周取材,进行组织学观察。结果:复合山羊乳牙牙髓干细胞的支架材料在4周后有类骨质形成;植入8周后,类骨质形成更多;未复合细胞的支架材料在组织学检查中未见有类骨质形成。结论:山羊乳牙牙髓干细胞在体外具有分化为成骨细胞的能力;多孔磷酸钙复合山羊乳牙牙髓干细胞在山羊体内具有异位成骨能力。

不同年龄2型糖尿病患者牙周健康流行病学调查

目的·调查不同年龄2型糖尿病人群的牙周整体健康水平,探讨年龄对糖尿病患者牙周炎患病率的影响及相关危险因素。方法·对2018年11月—2018年12月至上海交通大学附属第六人民医院内分泌科就诊的2型糖尿病患者进行牙周检查及问卷调查。对指数牙的相关牙周指标进行检查和计分,检查指标包括探诊深度、探诊出血、临床附着丧失(clinical attachment loss,CAL)、牙石指数(calculus index,CI)和菌斑指数(plaque index,PLI)。依据牙周炎的诊断标准,将调查对象分为牙周炎组和非牙周炎组。比较不同年龄段2型糖尿病患者牙周炎的患病率及相关牙周指标的差异。结果·完成调查的916名2型糖尿病患者中,牙周炎组和非牙周炎组患者之间年龄的差异有统计学意义(χ^(2)=100.1,P=0.001)。多因素Logistic回归分析提示,年龄是糖尿病牙周炎的高危因素(P=0.001,OR=2.13,95%CI 1.79~2.55)。相对于年龄较小的患者,高龄糖尿病患者更容易出现牙龈出血(χ^(2)=36.4,P=0.001)、牙齿松动(χ^(2)=25.9,P=0.002)、咀嚼无力(χ^(2)=12.3,P=0.006)等牙周炎症状。不同年龄人群PLI(χ^(2)=8.3,P=0.041)、CI(χ^(2)=12.8,P=0.005)和CAL(χ^(2)=32.5,P=0.001)的差异有统计学意义。在注意刷牙(χ^(2)=18.8,P=0.001)、清水漱口(χ^(2)=21.8,P=0.001)、刷牙频率(χ^(2)=24.0,P=0.001)等多项口腔保健措施上的差异有统计学意义。结论·糖尿病患者的年龄是影响牙周炎患病率和严重程度的危险因素,需要关注高龄糖尿病患者的牙周健康状况,并对该人群开展具有针对性的口腔预防保健工作。

口腔急诊医务工作者应对新型冠状病毒感染的防控管理规范

2019冠状病毒病(corona virus disease 2019,COVID-19)疫情期间,口腔医务人员因其诊疗操作的特殊性存在较大交叉感染的风险。目前多数地区的医院仅保留口腔急诊通道。本文依托本单位急性创伤急救中心,结合临床急救经验,从新型冠状病毒的流行病学特点、口腔科急诊诊疗感染的特点、医务人员的个人防护及诊室环境的防控管理等多个方面提出口腔急诊医务工作者的应急管理和防控规范,供口腔急诊医务人员参考。