自噬在大鼠睾丸扭转致缺血再灌注损伤中的作用机制

目的探讨自噬在大鼠睾丸扭转所致缺血再灌注损伤(I/RI)中的作用机制。方法将40只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、I/RI组、I/RI+雷帕霉素(RAPA)组和I/RI+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,每组10只。后3组大鼠建立左侧睾丸扭转(720°,1 h)复位模型,I/RI+RAPA组和I/RI+3-MA组大鼠造模前分别给予自噬激动剂RAPA和自噬抑制剂3-MA干预。于睾丸复位12 h后取各组大鼠左侧睾丸和附睾,收集精子进行精子质量分析,采用H-E染色观察睾丸组织病理变化,采用试剂盒检测睾丸组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC),采用TUNEL染色检测睾丸组织细胞凋亡水平,通过蛋白质印迹法检测睾丸组织中自噬相关蛋白(Beclin1、p62)和凋亡相关蛋白(Bcl2、Bax、cleaved caspase 3)表达水平。结果与假手术组比较,I/RI组大鼠精子质量下降,睾丸曲细精管排列松散,生殖细胞减少、脱落,睾丸组织SOD活性、T-AOC降低(均P<0.05),MDA含量升高(P<0.05),p62和Bcl2蛋白表达水平降低(均P<0.05),Beclin1、Bax和cleaved caspase 3蛋白表达水平升高(均P<0.05),凋亡生殖细胞明显增多。与I/RI组比较,I/RI+RAPA组大鼠精子质量提高,睾丸曲细精管排列正常,睾丸组织SOD活性、T-AOC升高(均P<0.05),MDA含量降低(P<0.05),Beclin1和Bcl2蛋白表达水平升高(均P<0.05),p62、Bax和cleaved caspase 3蛋白表达水平降低(均P<0.05),凋亡生殖细胞减少;I/RI+3-MA组大鼠精子质量下降,睾丸曲细精管排列松散,睾丸组织SOD活性、T-AOC降低(均P<0.05),MDA含量升高(P<0.05),Beclin1和Bcl2蛋白表达水平降低(均P<0.05),p62、Bax和cleaved caspase 3蛋白表达水平升高(均P<0.05),凋亡生殖细胞增多。结论激活自噬可改善I/RI大鼠精子质量和睾丸组织病理损伤,缓解氧化应激,抑制生殖细胞凋亡。

自噬调控对小鼠精原细胞缺氧/复氧损伤的影响研究

目的研究自噬调控对小鼠精原细胞缺氧/复氧损伤(H/RI)的影响,探讨自噬对小鼠睾丸组织缺血再灌注损伤(IRI)的影响。方法以小鼠精原细胞系GC1 spg为研究对象构建H/RI模型,雷帕霉素(RAPA)和3-甲基腺嘌呤(3-MA)分别作为自噬激动剂和抑制剂,设置对照组、模型组(H/RI)、自噬激动剂干预组(H/RI+自噬激动剂)、自噬抑制剂干预组(H/RI+自噬抑制剂)。用噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测各组细胞活性氧(ROS)释放水平和凋亡水平,实时荧光定量PCR(qPCR)检测各组细胞自噬相关基因Beclin1和凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA的表达水平,Western blot检测各组细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1、p62和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表达水平。结果与对照组比较,模型组增殖能力、Beclin1和Bcl-2 mRNA表达水平明显下降(P<0.01),p62和Bcl-2蛋白表达水平明显下降(P<0.01),ROS水平、细胞凋亡率、Bax mRNA相对表达水平明显上升(P<0.01),Beclin1、Bax、caspase-3蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值明显上升(P<0.01)。与模型组比较,自噬激动剂干预组细胞增殖能力、Beclin1和Bcl-2 mRNA表达水平明显上升(P<0.01),Beclin1、Bcl-2蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值均明显上升(P<0.01),ROS水平、细胞凋亡率、Bax mRNA表达水平明显下降(P<0.01),p62、Bax、caspase-3蛋白表达水平明显下降(P<0.01)。与模型组比较,自噬抑制剂干预组细胞增殖能力、Beclin1和Bcl-2 mRNA表达水平明显下降(P<0.01),Beclin1、Bcl-2蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值明显下降(均P<0.01),ROS水平、细胞凋亡率、Bax mRNA表达水平明显上升(P<0.01),p62、Bax、caspase-3蛋白表达水平明显上升(P<0.01)。结论增强自噬能抑制小鼠精原细胞凋亡,修复H/RI,为治疗睾丸组织IRI提供了理论基础。

糖尿病膀胱病大鼠膀胱Cajal间质细胞丙酮酸激酶表达及活性改变

目的检测糖尿病膀胱病(DCP)大鼠膀胱Cajal间质细胞(ICCs)丙酮酸激酶(PKM)的表达和活性,探讨其在DCP发病机制中的作用。方法40只雌性SD大鼠,9只为正常对照组;31只以腹腔注射链脲佐菌素法建立糖尿病大鼠模型,18只建立成功;9只糖尿病大鼠继续饲养12周,建立DCP大鼠。对照组、糖尿病组、DCP组大鼠分别取膀胱肌层ICCs细胞培养,Western blot及定量PCR法检测PKM蛋白和mRNA,并进行PKM活性测定。结果DCP组大鼠膀胱ICCs细胞内PKM蛋白、mRNA、活性值分别为(0.537±0.015)、(0.624±0.026)、(0.098±0.010) U/g蛋白;而糖尿病和对照组大鼠分别为(0.722±0.026)、(0.739±0.045)、(0.178±0.017) U/g蛋白与(0.923±0.031)、(1.000±0.022)、(0.277±0.030) U/g蛋白;DCP大鼠ICCs细胞内PKM表达及活性值较糖尿病组及对照组明显下降(P<0.01)。结论膀胱ICCs细胞内PKM活性下降是DCP发生发展的重要机制之一。