广东部分地区鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定和耐药性分析

【目的】了解广东部分地区鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)的流行、耐药及耐药基因携带情况。【方法】本试验于2020-2022年从广东地区采集101份疑似RA感染病死鸭、鹅的肝脏、心脏、脑等组织,对采集的组织进行细菌分离,通过革兰染色、生化试验及PCR鉴定分离株。对分离鉴定为RA的菌株进行血清型鉴定,并使用K-B纸片扩散法和PCR对分离株进行药敏试验和相应的耐药基因检测,采用统计学软件SPSS 22.0对分离株的耐药表型及耐药基因型进行统计,分析其相关性。【结果】分离菌在含5%新生牛血清的TSA平板培养后可见圆形、稍突、表面有光泽、乳脂状小菌落,革兰染色镜检为阴性短小杆菌。生化鉴定结果显示,分离株不发酵碳水化合物,氧化酶阳性,硝酸盐还原、西蒙氏枸椽酸盐、蛋白胨水、MR试验、VP试验、H_(2)S阴性,部分菌株能液化明胶和产生尿素酶。经PCR鉴定ompA基因阳性,本试验共分离得到51株RA。对分离株进行血清型鉴定,共检测到5种血清型,分别为血清1、2、4、11、18型,分析不同宿主来源的分离株血清型发现,血清18型仅在鹅上检测到。药敏试验结果显示,选择的25种药物中,RA对氟苯尼考、氧氟沙星、多西环素、大观霉素、头孢噻呋和头孢拉定6种药物敏感;对β-内酰胺类、氨基糖苷类耐药性最为严重,其中,对β-内酰胺类大部分药物耐药率在50.0%以上,对氨基糖苷类药物耐药率在80.0%以上。多重耐药统计结果显示,三重及以上耐药性菌株高达96.08%。分析不同宿主来源耐药性发现,鹅源RA分离株对青霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢唑啉4种药物的耐药率高于鸭源,其余药物鸭源和鹅源差异不明显。对15种耐药基因进行检测,其中blaCTX-M、aph(3′)Ⅱa、qnrB、qnrS、floR、tetM、ermF基因检出率较高,检出率分别为70.59%、68.63%、76.47%、96.08%、88.24%、82.35%和96.08%。耐药表型与耐药基因的相关性分析结果表明,耐药基因aph(3′)Ⅱa与新霉素、链霉素耐药株的产生具有显著相关性(P<0.05),耐药基因ermF与阿奇霉素耐药株的产生具有显著相关性(P<0.05),耐药基因tetX与多西环素耐药株的产生具有显著相关性(P<0.05)。【结论】本研究成功分离到51株RA,分离株对多种药物耐药,多重耐药现象严重。本试验结果可为指导广东地区制定RA感染的临床治疗用药方案提供参考。

广东鹅源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定、耐药表型和耐药基因的检测及相关性分析

为了解广东地区鹅源多杀性巴氏杆菌(Pm)的流行情况、药物敏感性、耐药基因的携带情况以及耐药表型与耐药基因的相关性,本实验对2019年~2022年从广东地区采集的193份疑似感染Pm病鹅的心脏血液和肝脏组织划线接种于不同的培养基分离细菌,对分离菌纯化后采用PCR扩增分离菌的KMT1基因并测序,采用多重PCR扩增分离菌的5个荚膜基因及8个脂多糖基因,分析分离菌的荚膜分型与脂多糖(LPS)分型。结果显示分离到83株鹅源Pm,其中82株为荚膜A型,1株无法通过荚膜定型;LPS分型为L1型。采用K-B纸片扩散法检测分离菌的药物敏感性;通过PCR检测分离菌7类药物的15种耐药基因,包括β-内酰胺类(bla_(CTX-M)、bla_(TEM)、bla_(OXA))、氨基糖苷类(aadA1、aph(3’)Ila)、喹诺酮类(qnrA、qnrB、qnrS)、酰胺醇类(floR)、四环素类(tetM、tetX)、大环内酯类(ermF、ereD)、磺胺类(sul1、sul3)耐药基因。采用统计学软件SPSS22中的完全随机设计两样本率的卡方检验分析分离菌的耐药表型和相应耐药基因的相关性。药敏试验结果显示,83株鹅源Pm对多种药物敏感性较高,其中对喹诺酮类的环丙沙星和氧氟沙星、氨基糖苷类的丁胺卡那和大观霉素、β-内酰胺类的头孢曲松、磺胺类的复方新诺明、大环内酯类的阿奇霉素敏感的菌株占比均在63%以上;对氨基糖苷类的链霉素和卡那霉素耐药的菌株占比高于50%,对氨基糖苷类的新霉素和四环素类的四环素耐药的菌株分别占49.40%(41/83)和46.99%(39/83)。耐药基因的检测结果显示,分离菌检出耐药基因qnrB、sul3、blaTEM、aadA1、aph(3’)Ila、ereD、ermF、tetM、floR,检出率分别为9.63%(8/94)、27.71%(23/83)、28.92%(24/83)、48.19%(40/83)、14.46%(12/83)、49.40%(41/83)、3.61%(3/83)、1.20%(1/83)、32.53%(27/83),未检出耐药基因qnrA、qnrS、sul1、tetX、bla_(CTX-M)、bla_(OXA)。相关性分析结果显示,aadA1基因与Pm对新霉素、链霉素、卡那霉素、大观霉素的耐药性具有极显著的相关性(P<0.001);bla_(CTX-M)基因、floR基因分别与Pm对头孢拉定、氟苯尼考的耐药性具有显著相关性(P<0.05)。上述结果表明,广东地区鹅源Pm主要为A∶L1基因型,对多种药物敏感,耐药基因携带率不高,部分药物的耐药表型与耐药基因具有相关性。本研究为广东地区鹅源Pm病的监测和防治提供参考依据,为Pm耐药机制的研究奠定基础。

鹅源鼠伤寒沙门菌crp、hfq基因缺失株的构建及生物学特性分析

为构建鹅鼠伤寒沙门菌单基因缺失株并鉴定其生物学特性,本研究以广东地区鹅源鼠伤寒沙门菌流行株A29为研究对象,采用λ-Red同源重组技术,分别构建crp、hfq基因缺失株(A29Δcrp和A29Δhfq)及相应基因回补株,并分别采用相应引物经PCR鉴定。通过细菌培养,对各菌株生物学特性进行比较;通过PCR鉴定各菌株的遗传稳定性;采用K-B纸片扩散法检测各菌株的药物敏感性;将各菌株纯培养物经腹腔注射4周龄小鼠,测定各菌株对小鼠的毒力,并观察感染后小鼠的临床症状及各组织剖检病变与组织病理变化。PCR和测序结果表明,正确构建各基因缺失株和相应回补株。生物学特性试验结果显示,与亲本株相比,A29Δcrp菌落直径极显著变小(P<0.001),不产酸、不产生H_(2)S,菌体极显著变短(P<0.001);A29Δhfq菌落边缘不整齐,不产生H_(2)S,菌体极显著变长(P<0.001),表明crp、hfq基因影响细菌的菌落形态、生化特性和形态特征。菌株遗传稳定试验结果显示,菌株传至60代时,基因缺失株仍能够稳定缺失。药敏试验结果显示,与亲本株比较,A29Δcrp对氨基糖苷类、碳青霉烯类、环丙沙星、甲氧苄啶、阿奇霉素等药物的敏感性降低,对四环素类药物的敏感性增强,A29Δhfq对除青霉素类、头孢唑啉以外的12种药物的敏感性增强。小鼠毒力试验结果显示,与亲本株的LD_(50)(2.479×10^(4)cfu)相比,A29Δcrp的LD_(50)(5.379×10^(5) cfu)和A29Δhfq的LD_(50)(5.012×106 cfu)均明显上升。各菌株感染小鼠后的临床症状及各组织剖检病变基本一致;组织病理变化观察显示,与亲本株相比,A29Δcrp组小鼠肝组织可见多量大小不一的坏死灶,脾组织红髓面积增大、白髓面积减小,A29Δhfq对小鼠脾脏、肝脏及脑组织损伤均较小。本研究为探究鼠伤寒沙门菌crp和hfq基因功能奠定了基础,同时也为进一步研发鹅沙门菌病疫苗提供了参考依据。

鹅源鸡毒支原体分离鉴定与致病性研究

为了解广东省部分地区鹅源鸡毒支原体流行情况,试验对50例鹅慢性呼吸道病病例进行鸡毒支原体检测,结果显示:鸡毒支原体mgc2基因PCR检测阳性21份,进一步纯化培养出8个分离株,经菌体染色镜检及16 SrRNA基因系统进化树分析,确定为鸡毒支原体,且与疫苗株同源性达97.8%以上;分离株1117经卵黄囊接种6日龄鹅胚和经气管接种50日龄乌鬃鹅,证明该分离株对鹅胚及鹅有一定的致病力。研究表明鸡毒支原体在广东部分地区鹅群中具有广泛流行性,并对鹅有致病性,该结果为广东地区鹅源鸡毒支原体流行病学监测提供参考。

鹅源产气荚膜梭菌的分离鉴定与药物敏感性试验

对2020年7月至2021年6月临床症状与病理剖检初步诊断为鹅坏死性肠炎疑似病例肠道内容物和肝脏进行细菌分离并纯化,获得52株菌。分离菌株经培养特性、生化试验、种特异性PCR鉴定,确定52株菌均为产气荚膜梭菌;采用PCR对分离株毒素基因鉴定,结果显示分离株均为毒素型A型,其中cpβ_(2)基因的检出率为61.5%,未检测到肠毒素cpe基因和netB毒素基因。药敏试验结果显示,分离株对头孢噻肟(100%)、头孢噻呋(100%)、氟苯尼考(100%)和多西环素(94%)表现为高度敏感,其次为恩诺沙星(88%)和氧氟沙星(88%);而耐药率最高的药物为磺胺类药物,其中磺胺甲恶唑耐药率为100%,其次是林可胺类药物,林可霉素与克林霉素耐药率分别为58%和46%;中药体外抑菌试验结果显示,单味中药黄连、黄柏、黄芩和复方中药乌梅散、白头翁汤、郁金散对产气荚膜梭菌均有一定的抑菌作用,其中黄连的MIC值为1.57 g/L,远低于其他试验中药的MIC值,具有较强的抑菌作用。本试验为广东省主要鹅养殖区域鹅产气荚膜梭菌病的有效防治提供了参考依据。