分泌型蛋白质二硫键异构酶在肿瘤发生发展中的研究进展

蛋白质二硫键异构酶(PDIs)家族是一组主要定位在内质网的巯基二硫键氧化还原酶,PDIs参与蛋白质二硫键的形成、还原和异构化,在维持蛋白质结构稳定和内质网稳态中发挥重要作用。PDIs蛋白在细胞中除可定位于内质网中,还可分泌至细胞外,存在于细胞外基质以及循环血液中。PDIs可以由肿瘤细胞或者其他细胞直接分泌至肿瘤微环境中,影响肿瘤细胞的增殖和迁移。本文就分泌型PDIs的结构功能及其与肿瘤发生发展之间的关系进行综述。

pEGFP-BMI-1真核表达载体的构建、鉴定及其表达

本研究构建真核表达载体pEGFP-BMI-1并观察其在HeLa细胞中的表达。将BMI-1逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)产物克隆入pEGFP-N1,经酶切、PCR鉴定及测序分析,构建pEGFP-BMI-1真核表达载体;采用脂质体转染法,将融合基因pEGFP-BMI-1转入HeLa细胞,用荧光显微镜和Western blot检测其表达,SYBR Green I实时定量RT-PCR方法检测转染前后HeLa细胞中P16INK4a mRNA的表达变化。结果表明:重组后的pEGFP-N1质粒已成功载入BMI-1的全长编码基因,序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pEGFP-BMI-1的HeLa细胞中存在荧光分布;Western blot检测发现存在外源性融合蛋白BMI-1-EGFP的表达。在HeLa细胞中过表达BMI-1显著下调P16INK4a mRNA的表达为对照组的9.2%(P<0.01)。结论:成功构建了真核表达质粒pEGFPBMI-1,转染HeLa细胞后可表达融合蛋白BMI-1-EGFP。这为今后研究BMI-1在肿瘤发生发展中的机制奠定了基础。

过表达BMI-1对HeLa细胞中HOX基因表达和细胞周期的影响

目的:将构建成功的真核表达载体pEGFP-BMI-1转染宫颈癌细胞系HeLa,检测其对同源盒(HOX)基因表达和细胞周期的影响。方法:采用脂质体转染法,将质粒pEGFP-BMI-1DNA瞬时转染HeLa细胞,确定融合蛋白B细胞特异性莫洛尼氏白血病毒插入位点1-加强型绿色荧光蛋白(BMI-1-EGFP)表达后,实时荧光定量RT-PCR方法检测转染前后HeLa细胞中周期素依赖性激酶抑制剂P16INK4a、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)、同源盒A9(HOXA9)、同源盒B4(HOXB4)和同源盒C13(HOXC13)mRNA的表达变化,PI染色流式细胞仪检测细胞周期。结果:(1)在HeLa细胞中过表达BMI-1显著下调P16INK4a、HOXA9和HOXC13 mRNA的表达,分别平均降低为对照组的9.2%、10.9%和69.7%(P<0.01),而hTERT和HOXB4 mRNA的表达变化无显著差异(P>0.05)。(2)pEGFP-BMI-1转染HeLa细胞后,G1期细胞由65.68%减少至50.53%,S期细胞则由27.17%增加至39.59%(P<0.01)。结论:真核表达载体pEGFP-BMI-1转染HeLa细胞过表达外源性BMI-1,显著下调P16INK4a、HOXA9和HOXC13的表达,同时G1期细胞减少、S期细胞增加,这可能是BMI-1参与肿瘤发生发展的机制之一。

敲减BMI-1表达诱导HeLa细胞G_1期阻滞

B细胞特异性莫洛尼氏白血病毒插入位点1(B-cell specific moloney leukemia virus insertionsite1,BMI-1)在多种恶性肿瘤中高表达.为探索BMI-1在宫颈癌发生发展过程中的生物学作用,将构建成功并已鉴定为有效序列的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体BMI-1shRNA2和BMI-1shRNA4,转染人宫颈癌细胞系HeLa并筛选稳定转染细胞株,Western印迹检测BMI-1蛋白表达,实时荧光定量RT-PCR检测周期素依赖性激酶抑制剂p16INK4a(cyclin-dependentkinase inhibitor p16INK4a)、人类端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)、同源盒A9(homeoboxA9,HOXA9)、同源盒B4(homeoboxB4,HOXB4)和同源盒C13(homeoboxC13,HOXC13)基因mRNA的表达变化,PI染色流式细胞仪检测细胞周期变化.结果表明,在稳定转染BMI-1shRNA2、BMI-1shRNA4的HeLa细胞中,显著抑制BMI-1蛋白表达,上调p16INK4a、HOXA9和HOXC13三者mRNA表达,而hTERT和HOXB4两者mRNA的表达水平无明显改变,同时G1期细胞增加、S期细胞减少,提示敲减BMI-1表达诱导HeLa细胞G1期阻滞,BMI-1可能是宫颈癌基因治疗的靶分子.

血浆/血清中肿瘤相关mRNA的研究现状

mRNA存在于血浆 /血清中。现就血浆 /血清中肿瘤相关mRNA(包括病毒RNA和各种肿瘤相关基因编码的mRNA等 )的存在、稳定性、应用及其在肿瘤诊断和预后中的意义进行综述 ,并简要展望其应用前景以及其中尚待解决的问题。

SYBR Green I实时荧光定量PCR检测BMI-1 mRNA方法的建立

目的 建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人类BMI-1 mRNA的方法。方法 以含有目的基因BMI-1 cDNA的质粒pEGFP-BMI-1为阳性模板,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测BMI-1,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性。结果 该法检测的线性范围为6.4×10^1～6.4×10^7拷贝,相关系数r为-1.00,6.4×10^3拷贝/反应的标本批内变异系数（CV）和日间CV分别为1.6%和2.8%。熔解曲线分析显示单一的峰,Tm为（80.40±0.18）℃。结论 SYBR Green I实时荧光PCR定量检测BMI-1 mRNA是快速有效、灵敏度高、特异性好的方法,可为BMI-1的进一步研究奠定基础。

人类SUZ12基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的：建立SYBR GreenI实时荧光PCR定量检测人类SUZ12基因的方法．方法：将SUZ12RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM—T后，经测序鉴定正确后，进行纯化和定量及系列稀释，应用SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测Suz12，建立标准曲线，熔解曲线分析产物的特异性．结果：该法检测的最低拷贝数为14．2，线性范围为1．42× 10^-1．42× 10^8拷贝，相关系数7为-1．00，1．42× 10^7拷贝／L标本的批内变异系数（CV）和日间CV分别为1．8％和2．8％．熔解曲线分析显示单一的峰，熔解温度（meltingtemperature，Tm）为（81．37±0．16）℃．结论：实时荧光定量PCR方法检测SUZ12基因，快速有效、灵敏度高、特异性好．

AGL患者端粒酶亚单位hTERT、hTEP1的表达

目的 检测急性粒细胞性白血病 ( AGL)患者端粒酶亚单位 -人端粒酶逆转录酶 ( h TERT)和端粒酶相关蛋白1 ( h TEP1 )的表达情况 ,并观察不同的亚单位在 AGL发病中的作用。方法 采用 RT-PCR法检测 3 1例 AGL首治患者、2 4例 AGL复发患者、2 1例 AGL完全缓解期患者以及 1 8例健康体检者外周血白细胞端粒酶亚单位 h TERT,h TEP1 m R-NA。结果 AGL首治患者、AGL复发患者、AGL完全缓解期患者以及健康体检者 h TERT m RNA的阳性率分别为 80 .6%、83 .3 %、9.5 %和 5 .6%。所有标本 h TEP1 m RNA的阳性率为 1 0 0 .0 %。结论 与 h TEP1比较 ,h TERT表达的上调在AGL的发生与复发中具有更重要的作用 ,而且可用于监测治疗是否有效以及治疗后是否复发。

人T细胞免疫球蛋白粘蛋白-4基因真核表达载体的构建和生物信息学分析

目的:构建人T细胞免疫球蛋白粘蛋白-4(TIM-4)基因的真核表达载体,用生物信息学分析了解TIM-4蛋白的特性。方法:采用Trizol法从人外周血单个核细胞提取总mRNA,逆转录合成cDNA,以此为模版,两步法RT-PCR扩增TIM-4,将其克隆至表达载体pcDNA3.1(+)中,构建FTIM-4质粒,通过PCR及测序进行鉴定。同时,我们构建pEGFP-N1-TIM-4真核表达载体,并测序鉴定其准确性;将pEGFP-N1-TIM-4质粒转染CHO细胞,用RT-PCR和荧光显微镜证实其表达。应用生物信息学初步分析TIM-4蛋白的物理化学性质、结构域和功能。结果:从逆转录的cDNA扩增出TIM-4;经PCR、酶切鉴定、测序分析表明扩增产物与GenBank提供的序列完全相同。真核表达载体pEGFP-N1-TIM-4在CHO细胞中稳定表达,表达蛋白主要位于细胞质和细胞膜上。生物信息学分析表明TIM-4蛋白为不稳定亲水性蛋白,有1个跨膜螺旋结构,含约10.32%的α-螺旋,29.89%的延伸链,59.79%的不规则卷曲,有1段由24个氨基酸组成的信号肽。亚细胞主要定位于细胞质、细胞核、分泌系统的小囊泡、线粒体、内质网、高尔基体上。功能分析预测该蛋白具有受体和信号转导功能。结论:成功构建TIM-4基因真核表达载体,利用生物信息学分析洞察了TIM-4蛋白的性质,为进一步研究该基因的免疫调节机制奠定了基础。

人T细胞免疫球蛋白黏蛋白-4 cDNA全长真核表达载体的构建及其在16HBE细胞中的表达

目的克隆人T细胞免疫球蛋白黏蛋白-4(TIM-4)基因cDNA,构建其真核表达载体pEGFP-C2-TIM-4,并转染16HBE细胞。方法根据GeneBank中人TIM-4 cDNA序列(编号:NM-138379.2),设计出带有EcoRI和BamHI的上下游引物,应用RT-PCR技术,从人骨髓中扩增出TIM-4基因编码区序列,克隆到pMD18-T载体,形成pMD18-T-TIM-4重组质粒,经菌落PCR,双酶切,测序鉴定获得人TIM-4基因cDNA片段,然后将其亚克隆入pEGFP-C2绿色荧光载体中,并通过菌落PCR,双酶切,测序鉴定其重组体。将测序正确的pEGFP-C2-TIM-4质粒转染人气道上皮细胞(16HBE),用实时定量PCR检测目的基因的表达。结果成功扩增出人TIM-4 cDNA全长1134 bp,经T-A克隆构建的pMD18-T-TIM-4重组质粒经菌落PCR,双酶切,测序证实载体中含有正确的TIM-4编码区片段。由此构建的真核表达载体pEGFP-C2-TIM-4,经菌落PCR扩增出1134 bp左右的片段,经双酶切后产生4.7 kb和1134 bp左右的2条带,DNA测序显示与GeneBank中人TIM-4 cDNA序列一致。重组质粒转染16HBE细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光,经实时定量PCR分析,转染细胞TIM-4基因的表达显著增加。结论首次从人骨髓中扩增出TIM-4基因cDNA全长,构建了其真核表达载体pEGFP-C2-TIM-4,并在16HBE细胞内成功高表达,为进一步研究TIM-4的生物学功能奠定了基础。

社区高血压患者饮酒行为及影响因素分析

目的探讨社区高血压患者饮酒行为现状及影响因素,为进行具有针对性的心理健康教育提供依据。方法采用酒精依赖识别测验(AUDIT)问卷、生活质量综合量表(CQOLI-74)问卷和一般调查问卷对157例莆田黄石社区高血压患者进行调查分析。结果 157例高血压患者中饮酒者占42.03%,未饮酒者占57.97%。单因素分析显示,不同性别、不同职业、不正常的婚姻、负性情感强弱以及自尊强弱对高血压患者饮酒行为影响较大(P<0.05);通过二分类Logistic回归分析得出,性别、婚姻、自尊等因素对社区高血压患者饮酒行为有影响(OR=0.294,0.435,0.224,P均<0.05)。结论性别、婚姻及自尊对社区高血压患者饮酒行为有影响,应进行健康心理干预。

实时荧光RT-PCR检测喉鳞状细胞癌组织端粒酶逆转录酶mRNA

目的 建立一种实时荧光逆转录多聚酶链反应 (RT PCR) ,检测喉鳞状细胞癌组织人端粒酶逆转录酶 (hTERT)mRNA表达水平 ,并与传统的RT PCR进行比较。方法 采用TriZOL提取总RNA并将mRNA逆转录成cDNA ,然后利用TaqMan技术定量检测喉鳞状细胞癌组织hTERTmRNA。结果 实时荧光RT PCR检测癌组织的阳性率为 97.0 6 % ,癌旁组织的阳性率为 38.2 4 % ,差异显著 (χ2 =2 4 .2 5 ,P <0 .0 0 5 ) ,与癌旁组织比较 ,喉鳞状细胞癌组织hTERTmRNA表达水平平均上升 17.88倍 ;传统的RT PCR检测喉鳞状细胞癌组织和癌旁组织的阳性率分别为 73.5 3%和 11 77% ,均显著低于实时荧光RT PCR的阳性率 (P <0 .0 1)。结论 实时荧光RT PCR是检测喉癌组织hTERTmRNA水平的一种快速有效、灵敏度和特异性更高的方法 ,hTERTmRNA表达的上调可能是导致喉鳞状细胞癌发生的重要因素。

支气管哮喘易感区域5q31-33内Tim-3基因单体型分析

目的:探讨染色体上支气管哮喘易感区域5q31-33内Tim-3基因多态性与支气管哮喘的关系。方法:应用限制性片段长度多态性技术方法,分析了118个儿童变应性哮喘核心家系Tim-3基因4个SNPs(rs10053538、rs10515746、rs13170556和rs9313441)的基因型;采用基于家系传递不平衡检验(TDT),分析基因分型数据;应用TRANSMIT软件构建单体型并进行单体型关联分析。结果:①基于家系的TDT分析显示,Tim-3基因的4个SNPs由杂合子父母传递给患病子代的等位基因频率不比预期值高,与哮喘无关(P>0.05)。②Transmit多个位点单体型分析结果显示由Tim-3基因rs10053538、rs13170556、rs9313441构建的单体型与支气管哮喘有关联(Global 2=10.83,P<0.05)。父母传递给患病子女GGG单体型的观察值小于期望值,差异显著(2=8.24,P<0.01)。结论:中国汉族人群中,位于染色体5q31-33区域的Tim-3基因本身或其附近的基因可能与儿童变应性哮喘的易感性相关。

TaqMan实时PCR与SYBR Green Ⅰ实时PCR检测HLA-B*27的比较性分析

目的探讨TaqMan实时PCR与SYBR Green Ⅰ实时PCR检出中国汉族人群基因组标本中HLA-B*27等位基因能力的差异。方法首先采用SYBR Green Ⅰ实时PCR对243例人基因组标本中的HLA-B*27等位基因进行检测,随后采用TaqMan实时PCR对HLA-B*27进行再次检测。结果 SYBR Green Ⅰ实时PCR发现243例人基因组标本中,132例HLA-B*27阳性,111例HLA-B*27阴性,而TaqMan实时PCR检测结果显示131例HLA-B*27阳性,112例HLA-B*27阴性,两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论与SYBR Green Ⅰ实时PCR一样,TaqMan实时PCR也是一种快速有效的检测中国汉族人群HLA-B*27等位基因的方法。

核黄素光化学法病毒灭活对新鲜血浆活性影响的探讨

目的探讨核黄素光化学法病毒灭活对新鲜血浆活性的影响,为临床合理应用病毒灭活血浆提供理论参考依据。方法收集血液中心提供的健康献血者新鲜血浆样本100份。以核黄素光化学法对100份新鲜血浆进行病毒灭活,分别检测100份血浆样本在病毒灭活处理前后的APTT、FIB、总蛋白(Tg)和FⅧ含量。将数据进行对比分析。结果新鲜血浆在核黄素光化学法病毒灭活后与未作病毒灭活处理相比较,APTT时间延长14.93s,差异有统计学意义(P<0.05);FIB含量减少0.94 mg/m L,差异有统计学意义(P<0.05);Tg含量减少3.39 g/L,差异无统计学意义(P>0.05);FⅧ含量减少0.26 IU/m L,差异有统计学意义(P<0.05)。结论核黄素光化学法病毒灭活在灭活病毒、提高输血安全的同时导致血浆中活性成分有一定程度降低,临床上在应用灭活血浆时应注意适当增加血浆用量以提高血浆输注疗效。

实时荧光定量RT-PCR检测白血病细胞中BMI-1 mRNA的表达及其意义

目的:建立SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR方法检测白血病细胞中BMI-1 mRNA的表达并探讨其临床意义。方法:在TRIzol提取总RNA后,将mRNA逆转录成cDNA,再用SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法检测BMI-1 mRNA在白血病细胞系(K562、HL-60、Daudi、Jurkat、Molt-4、U937和THP-1)、56例AML初治患者的骨髓ACDA抗凝标本和30例健康体检者的外周血EDTA抗凝标本以及6例细胞形态学正常的骨髓ACDA抗凝标本中的表达,扩增产物的特异性通过熔解曲线和凝胶电泳双重确认,以ABL为内参照,采用2-△△ct法计算其相对表达量。结果:①BMI-1 mRNA在白血病细胞系(K562、HL-60、Daudi、Jurkat、Molt-4、U937和THP-1)均存在表达,其中U937表达最高,而HL-60表达最低。②与对照组相比,BMI-1 mRNA在白血病细胞中的表达显著升高(P<0.01)。结论:①SYBR GreenⅠ实时RT-PCR是一种快速有效、灵敏度高、特异性好的定量检测BMI-1 mRNA的方法。②BMI-1参与白血病的发生,可能是一种新的肿瘤分子标记物。

AML和喉鳞状细胞癌患者血浆中hTERT mRNA的定量检测及其临床意义

目的建立定量检测肿瘤患者血浆中hTERT mRNA水平的实时荧光RT-PCR方法,探讨其在急性髓细胞性白血病(AML)和喉鳞状细胞癌的诊断与疗效观察中的应用价值。方法采用TriZOLLS提取21例AML患者、23例喉鳞状细胞癌患者以及25例健康志愿者血浆总RNA,逆转录后利用Taqman技术对hTERT mRNA进行实时定量检测。结果健康志愿者血浆hTERT mRNA水平(NhTERT)为1.2±0.8,喉鳞状细胞癌患者手术前与手术后2天,NhTERT分别为11.8±8.3和8.0±5.7(P=0.03),AML首次治疗前与完全缓解患者分别为13.5±8.5和2.4±2.0(P<0.001)。与健康志愿者比较,AML首治患者与手术前喉鳞状细胞癌患者血浆hTERT mRNA水平显著升高。结论采用实时荧光RT-PCR能够有效地检测血浆中hTERT mRNA水平,为AML和喉鳞状细胞癌患者的诊断与疗效观察提供信息。

不同新型冠状病毒核酸检测试剂的临床性能评价

目的评价同一厂家新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测扩增时间长的试剂(试剂A)与扩增时间短的试剂(试剂B)的临床性能,分析试剂更换的可行性。方法用2019-nCoV阴性混合样本将商品化2019-nCoV RNA液体室内质控品(以ORF1ab浓度赋值17300 copies/mL)梯度稀释成1730、865、567.7、432.5、216.3、108.2 copies/mL 6个浓度,在连续3 d内每个浓度每天做7~8个复孔,共计23个复孔,进行磁珠法提取核酸和实时荧光RT-PCR扩增,以评价试剂A和B的分析灵敏度。用试剂A和B分别检测来自华中科技大学同济医学院附属协和医院2020年2月9日发热门诊的130例患者咽拭子样本核酸,进行临床检测性能评价,并将其中5例2019-nCoV强阳性核酸连续10倍梯度稀释作2种试剂的相对灵敏度评价。结果试剂A和B检测1730、865、567.7、432.5、216.3和108.2 copies/mL的质控品稀释液中ORF1ab基因的阳性率分别为100%和100%、95.65%和82.61%、95.65%和78.26%、91.30%和78.26%、65.22%和43.48%、34.78%和17.39%;试剂A和B的最低检测限分别为615.9(95%CI:446.0~1098.5)copies/mL和1249.1(95%CI:863.4~2378.8)copies/mL。5例2019-nCoV强阳性的临床样本核酸在1∶10和1∶100稀释时,试剂A和B对ORF1ab和N基因检出率均为100%;而1∶1000稀释时,对于ORF1ab和N基因,试剂A的检出率均为100%,试剂B的检出率分别为73.3%和80.0%。130例咽拭子样本中,试剂A 2019-nCoV RNA检测阳性率为43.85%,试剂B为33.08%,差异有统计学意义(P<0.05);2种试剂的检测结果一致性较好(kappa=0.7753),阳性符合率为75.44%(43/57),阴性符合率为100%(73/73),阳性预测值为100%(43/43),阴性预测值为83.91%(73/87),总符合率为89.23%(116/130)。结论2种2019-nCoV核酸检测试剂的临床性能之间存在差异。为保证2019-nCoV核酸的检测质量,不宜将该厂家扩增时间长的试剂更换为扩增时间短的试剂。