乳酸片球菌L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

与其它微生物相比,用大肠杆菌进行发酵生产乳酸有许多优势,但大肠杆菌没有L乳酸脱氢酶基因,不能利用糖发酵生产L乳酸.本文采用PCR技术,以乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)基因组DNA为模板,克隆得到L乳酸脱氢酶(Llactatedehydrogenase)基因,将该基因的ORF连接到表达质粒pET22b(+),获得重组质粒pETldhL.将pETldhL质粒转化大肠杆菌BL21株,实现了ldhL基因的表达;对含有ldhL基因的重组菌株进行表达研究,在30℃以IPTG诱导8h后,SDSPAGE分析可见明显特异性条带,酶活力达到6.49u/mL,是野生菌酶活力(2.82u/mL)的2.3倍.对重组表达的L乳酸脱氢酶生物学特性研究显示,它们的最适反应温度为27～30℃,最适反应pH为5.0～5.3.

克雷伯氏菌甘油脱水酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

利用PCR技术从克雷伯氏菌 (KlebsiellapneumoniaeATCC4 9790 )总DNA中扩增得到甘油脱水酶 (glyceroldehydratase ,DHAB)基因的DNA片段 ,并将其连接到表达质粒 pSE380 ,携带有重组质粒 pSE dhaB的大肠杆菌JM 1 0 9实现了dhaB基因的表达 ;对含有dhaB工程菌进行表达研究 ,表明工程菌在 37℃ ,以 1 .0mmol LIPTG诱导 5h酶活力即达到 1 1 6 4.1 4U L ,比野生菌酶活力 (1 6 8.6 9U L)提高了 6 .9倍。

重组大肠杆菌的高密度发酵和甘油生产条件的初步研究

在摇瓶中进行重组大肠杆菌菌株BL21高密度发酵条件的研究,考察了葡萄糖浓度、盐离子浓度、温度、接种量、发酵时间等对该菌株生产甘油的影响。初步确定底物浓度为2.5%,盐离子浓度0.2%,温度为37℃,接种量为2%,经24h的摇瓶发酵,甘油产量最高达6.8g/L。在30L发酵罐实验中、按初步确定的优化条件发酵26h,甘油产量可达46.67g/L,是LB/葡萄糖培养基中甘油产量的2.06倍。

ADSRX在开发换热设备CAD软件中的应用

ADSRX是AutoCADR1 4二次开发平台的重要组成部分 ,它提供的许多工具使用户在AutoCADR1 4上开发换热设备CAD软件变得较为容易 .通过阐述ADSRX应用程序的基本结构 ,说明如何利用AD SRX环境开发换热设备CAD软件 .给出了利用VisualC + + 5 .0编译器建立ADSRX应用程序的步骤 ,提供了在AutoCADR1 4环境下调用和卸载ADSRX应用程序的方法 .

α-乙酰乳酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合型表达

α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒生产中能加快啤酒成熟,有重要的应用价值。本研究将枯草芽孢杆菌启动子P43克隆到质粒pUC19-ALDC中的α-乙酰乳酸脱羧酶基因之前,得到重组质粒pUC19-P43-ALDC。重组质粒pUC19-P43-ALDC与质粒pMLK83-BN同源重组,筛选得到枯草芽孢杆菌整合质粒pMLK83-ALDC。用此整合质粒转化枯草芽孢杆菌1A751,挑选出新霉素抗性且无淀粉酶活性的重组菌株。此菌株用LB培养基在37℃、220r/min摇瓶培养过夜,测得α-乙酰乳酸脱羧酶活力为15.6U/mL,说明整合的α-乙酰乳酸脱羧酶基因能够在重组菌株中稳定传代和表达。本研究首次在枯草芽孢杆菌中用整合型的方式重组表达了α-乙酰乳酸脱羧酶,提出了一种有潜力的生产α-乙酰乳酸脱羧酶的新方法。

耐放射异常球菌海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

利用生物信息学手段 ,在GenBank中进行氨基酸序列的同源性比较分析 ,检索到来自于耐放射异常球菌(Deinococcusradiodurans)基因组序列中一功能未确定的开放阅读框 (ORF) ,其氨基酸序列和已报道的海藻糖合成酶的氨基酸序列有约 6 0 %的同源性 .将这段ORF克隆到大肠杆菌进行表达 ,并进行功能鉴定 .实验表明这段ORF序列所编码的是一种海藻糖合成酶 ,它能将麦芽糖分子转化成海藻糖分子 ,以 30 %的麦芽糖为底物时能将约 6 5 %的麦芽糖转化成海藻糖 .重组酶性质初步研究表明 ,在 pH 7 0 ,最佳温度 30℃转化麦芽糖效率 最高 .

重组海藻糖合成酶工程菌的pH-stat高密度发酵工艺研究

重组海藻糖合成酶工程菌的分批补料发酵中,用氨水调节培养液的pH为6.78～6.80,初糖耗尽后按培养液的pH从6.80起每升高0.01即开始补充葡萄糖至0.7g·L-1。据此补料策略可将发酵过程的乙酸积累控制在6.26g·L-1以下;补料发酵12h后,即获得细胞干重为51.5g·L-1的细胞高密度,细胞密度是分批培养的7.5倍;诱导后重组海藻糖合成酶表达率为15.2%,单位体积内的表达量是分批培养的4.5倍。

Thermobifida fusca海藻糖合成酶的定点突变及其动力学性质研究

对Thermobifida fusca海藻糖合成酶(TreS)保守区域的氨基酸残基I224、N242、Q333、E352和N415进行定点突变,结果表明:位点I224、N242、N415突变后酶的活力与野生型TreS相近,E352位点突变后酶的比活力提高为野生型TreS的1.25倍。突变酶的最适温度、pH、Km和Kcat没有明显变化;突变Q333R则使TreS丧失了酶活力。

弗氏柠檬酸菌dhaT基因的克隆表达、序列分析、酶的纯化及特性研究

1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)是一种重要的化工原料,越来越受到广泛的关注。以弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)基因组DNA为模板,通过PCR得到1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol dehydrogenase,PDOR)的基因dhaT,序列显示与来源于C．freundii DSM 30040 (Genbank U09771)相应基因的相似性为78％。将此基因构建于表达载体pSE380,得到重组质粒pSE-dhaT。重组质粒转化到宿主菌E．coli JM109中进行了表达,重组酶通过镍柱及Sephacral S- 300进行纯化,重组酶SDS-PAGE结果显示有非常明显的单一的42kDa特异性蛋白条带出现。以丙醛为底物测定重组酶还原反应的最适温度为37℃、最适pH为8．0,对丙醛的Km值为10．05mmol／L,最大反应速度Vmax为37．27μmoL／min／mg;以1,3-PD为底物测定重组酶氧化反应的最适温度为25℃、最适pH为10．5,对1,3-PD的Km值为1．28mmob／L,最大反应速度Vmax为25．55μmol／min／mg。重组酶的还原反应比活为49．50U／mg,氧化反应比活为79．72U／mg。该酶同样具有假定的结合Fe2+的G-X-X-H-X-X-A-H-X-X-G-X-X-X-X-X-P-H-G模体保守结构。

酿酒酵母gpd1和hor2基因在大肠杆菌中的共表达

利用途径工程的方法,在大肠杆菌中构建一条新的产甘油的代谢途径。从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)克隆3_磷酸甘油脱氢酶基因(gpd1)和3_磷酸甘油酯酶基因(hor2 ) ,并将两个基因串连到启动子trc的下游,构建由trc启动子控制的能高效表达的多顺反子重组质粒pSE_gpd1_hor2 ,将重组质粒导入大肠杆菌BL2 1菌株中,构建得到的重组菌株GxB_gh能将葡萄糖转化为甘油。结果表明重组菌株GxB_gh以葡萄糖为底物进行发酵,甘油产量为4 6 6 7g L ,葡萄糖的转化率为4 2 87%。这为利用工程菌绿色生产甘油进行了前期的探索,也为进一步构建能生产1,3_丙二醇的工程菌打下了良好的基础。

产1,3-丙二醇基因工程菌发酵条件的研究

利用途径工程的方法,将来源于克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脱水酶基因dhaB和1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT构建成多顺反子重组质粒pSE-dhaB-dhaT并在大肠杆菌JM 109中进行表达,在大肠杆菌中构建一条新的产1,3-丙二醇代谢途径。研究表明,重组菌株JM 109/pSE-dhaB-dhaT在微好氧条件下,尝试用廉价的乳糖为诱导物、维生素B12为辅酶,可以将甘油转化为1,3-丙二醇,产量达15.34 g/L,甘油转化率为35.7%,对低成本生产1,3-丙二醇作了有益的探索。

谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

利用生物信息学手段,在GenBank数据库进行氨基酸的同源性检索分析,发现来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)一功能未确定的ORF序列被注释为假设的海藻糖酶(putative trehalose synthase),它与已报道的海藻糖合成酶的氨基酸序列有60%以上的同源性.本研究把这段ORF克隆到大肠杆菌进行表达及进行功能鉴定.实验表明这段ORF序列为一新的海藻糖合成酶基因,其表达产物能将麦芽糖分子转化成海藻糖分子.重组酶性质的初步研究表明重组酶在pH 7.0～7.5,30℃转化麦芽糖效率最高.

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶的定点突变及其酶学性质研究

以已知晶体结构的Pseudomonas mesoacidophila MX-45菌株海藻酮糖合成酶(MutB)的晶体结构为模板,在SWISS-MODEL模建立谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)海藻糖合成酶的立体结构,并对初始结构作能量优化,通过氨基酸序列比对,选择TreS-glu保守区内的氨基酸R245、D247、E289、F244和保守区外的氨基酸A288进行定点突变,并对突变酶F244C、F244L、F244W、F244Y、A288G、R245X、E289X、D247N、D247E进行纯化和酶学性质研究,比较突变子对酶活性和热稳定性的影响。结果表明,R245、E289突变为其它的19个氨基酸后酶活力全部丧失,D247E和D247N也丧失酶活,F244C、F244L、F244W、F244Y和A288G的比活力分别降低到TreS-glu的38%、24%、62%、64%和35%,A288突变成T288后没有酶活。与TreS-glu相比,F244C、F244W、A288G的Km值基本不变,F244L、F244Y对底物麦芽糖的亲和力降低,F244Y的最适反应温度和TreS-glu相同,均为27℃,而F244C、F244L、F244W和A288G的最适温度提高到32℃。与TreS-glu相比,突变酶的最适反应pH值均有所下降,其中F244C、F244Y和A288G的为7.5,比TreS-glu的8.0均下降了约0.5个单位,而F244L和F244W的为6.5,比TreS-glu的8.0均下降了近1.5个单位。与TreS-glu相比,突变酶的热稳定性均有不同程度提高,其中F244Y、F244W和A288G的Tm值比TreS-glu的提高约1℃,F244L提高约2℃,F244C提高了近4℃。

米曲霉AS3.800基因工程转化体系的构建

采用紫外突变结合砂芯漏斗过滤筛选,得到米曲霉双重营养缺陷型突变菌株AS3.800(niaD-,pyrG-)。应用生物信息学软件辅助分析米曲霉基因,了解转录调控元件。通过PCR技术成功地从米曲霉AS3.800总DNA中分别扩增niaD、pyrG基因表达框(expression cassette),构建筛选标记质粒pUCniaD和pUCpyrG,并尝试原生质体转化AS3.800(niaD-,pyrG-)。

玉米——四季豆高产栽培技术及效益分析

总结了玉米—四季豆高产栽培模式,分别介绍了该模式下玉米、四季豆的栽培技术,并分析了该种栽培模式的经济效益,以期为当地农户种植玉米和四季豆获得高产提供参考。

春马铃薯地膜高产栽培技术

介绍了春马铃薯高产栽培技术,包括种植地选择、品种选择及种薯选择、种薯催芽、适时播种、田间管理、适时采收等几个方面,为种植户提供参考。

丰两优香1号再生稻种植表现及关键技术

丰两优香一号在当阳作一季中稻表现为优质、高产、香型等优点。丰两优香一号作为再生稻,克服了种植一季中稻有余两季不足的问题。当阳市发展再生稻空间较大,丰两优香一号2017年3月25~27日播种,头季收获期为8月15~17日,再生季收获期为11月4~6日。头季收获与再生季收获间隔80d,两季全生育期222d。头季9180kg/hm^2,再生季2715kg/hm^2,全年合计11895kg/hm^2。再生稻比一季中稻纯收入高5115元/hm^2。关键栽培技术为适时施促芽肥和提苗肥、适当高留稻桩等。