肠结核实验室诊断技术的研究进展

肠结核是由结核分枝杆菌侵犯肠黏膜而引起的肠道特异性感染,本病最大的挑战是诊断的建立。传统诊断技术如结核分枝杆菌培养、抗酸染色、组织病理学检查和普通聚合酶链式反应的诊断敏感度很低。新应用的诊断方法,如γ干扰素释放试验和改良后的聚合酶链式反应弥补了传统诊断工具的缺点;同时潜在的生物标志物,如免疫标志物、铁代谢标志物有望为肠结核的诊断提供更多的临床证据。本文将系统综述这些肠结核诊断的实验室技术。

结核菌特异性IFN-γ Elispot检测在活动性结核病和结核感染诊断中的应用

目的评价早期建立的结核菌特异性IFN-γ Elispot检测在活动性结核病和结核感染诊断中的应用价值。方法应用Elispot技术对1 154例结核病患者,52例非结核病肺部疾病对照,384例新发痰菌阳性结核患者的密切接触者,422例健康对照进行外周血结核菌特异性IFN-γ水平检测。对健康对照和密切接触者同时还进行平行的PPD皮试。结果结核患者Elispot检测的阳性率显著高于对照人群及结核病密切接触者。其中,血行播散性结核、继发性肺结核、结核性胸膜炎、结核性脑膜炎和其他肺外结核患者Elispot阳性率分别为91.3%,81.7%,86.5%,66.2%,89.8%。非结核病肺部疾病对照、健康对照和新发结核病人密切接触者Elispot阳性率分别为13.5%,15.4%和35.4%。在密切接触者筛查中,发现活动性结核病人17例,其中Elispot阳性14例(82.4%),PPD强阳性5人(29.4%);两者阳性率差异有统计学意义。结论在结合结核病史、结核病接触史以及临床表现的基础上,结核菌特异性IFN-γ的检测对活动性结核病诊断有一定的辅助诊断价值。通过检测结核高危人群结核菌特异性IFN-γ的水平,对早期发现活动性结核患者具有重要的价值。

CD4^+CD25^+调节性T细胞对肺结核患者特异细胞免疫的调节作用

目的探讨调节性T细胞对结核患者特异性细胞免疫的调节作用及其在结核病发生中的意义。方法采用免疫磁珠从健康对照和结核患者外周血单个核细胞中分离CD4+CD25+调节性T细胞,观察其对结核患者外周血免疫反应,包括细胞增殖反应和细胞因子IFN-γ及IL-10分泌的影响。结果体外消除CD4+CD25+调节性T细胞没有显著影响健康对照PBMC对BCG抗原的增殖反应,但可以显著增强结核患者PBMC对BCG抗原的细胞增殖反应、细胞因子IFN-γ及IL-10的分泌。分离的CD4+CD25+调节性T细胞能显著抑制结核患者CD4+CD25-T细胞对BCG抗原及抗-CD3的细胞增殖和细胞因子IFN-γ分泌;CD4+CD25+调节性T细胞也抑制BCG刺激的CD4+CD25-T细胞IL-10的分泌,但不影响抗-CD3刺激的IL-10分泌。结论CD4+CD25+调节性T细胞可能通过抑制结核患者特异性细胞免疫应答促进肺结核病的发生发展。

严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒抗体的检测及其临床意义

To investigate the k inetics of antibody to SARS coronavirus in SARS patients and its clinical implication,ELISA was used to dete ct antibody to SARS coronavirus(SA RS CoV),RT-PCR was used to detect the SARS CoV RNA and,besides,the C D+4 and CD+8 T cells in peripheral blood of SARS patients and healthy controls were assayed by flowcytom etryThe results showed that SARS CoV IgM were first detected from da y 7 to day 47 after SARS onset,wit h average at day 193±101SARS Co V IgG were first detected from day 4 to day 47 after SARS onset,with average at day 207±101,and the p roduction of SARS CoV IgG was corr elated with CD+4 T cell number(P<005),but had no relationship with SARS CoV RNAMost SARS patients pr oduced SARS CoV antibody,IgM produ ced almost at the same time wit h IgGSARS CoV IgG is a protective antibody against SARS CoV and the titer of IgG may be used as an ind ex indicating the specific immunit y production in SARS

抗人隐孢子虫特异性单克隆抗体的制备

目的研制针对人隐孢子虫的特异性单克隆抗体。方法利用人隐孢子虫(C. hominis,)超声粉碎物免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,经3～5次有限稀释克隆化,获得7株持续分泌抗体的杂交瘤细胞株,经流式细胞术检测其反应性。结果获得7株单克隆抗体分别命名为JF1～JF7,对隐孢子虫胞内和胞外的检测无差异。结论所获得的单克隆抗体为临床对人隐孢子虫的诊断提供用力工具。

肺结核患者血清白介素18的定量检测

目的 探讨白介素 18( Interleukin- 18,IL- 18)在抗结核菌感染中的作用。方法 采用酶免疫技术 ( EL ISA)检测 4 0例肺结核患者和 2 0例健康人群血清中 IL - 18和 r干扰素 ( Interferon- r,IFN- r)。结果 肺结核患者血清中 IL - 18和 IFN- r水平均显著高于健康对照。 IL - 18水平和 IFN- r水平呈明显的相关性。结论 IL - 18可能在肺结核病人抗结核菌感染免疫中发挥重要作用。

PCR和原杂交技术检测鼻咽癌石蜡组织中HHV-6DNA

为了解人疱疹病毒６型（ＨＨＶ－６）与鼻咽癌（ＮＰＣ）的可能关系，检测了ＮＰＣ发生不同阶段的石蜡组织中ＨＨＶ－６ＤＮＡ的存在情况。方法：采用ＰＣＲ、斑点杂交和原位杂交技术，共检测了４２例鼻咽癌石蜡组织、２１例鼻咽癌前病变石蜡组织和２７例正常鼻咽石蜡组织ＨＨＶ－６ＤＮＡ的存在情况。结果：通过ＰＣＲ扩增，在４２例ＮＰＣ组织中检出１３例存在ＨＨＶ－６ＤＮＡ，占３１％；２１例鼻咽癌前病变组织中１例阳性（４７％），而２７例正常鼻咽组织中无一例阳性。斑点杂交的结果表明ＰＣＲ扩增是ＨＨＶ－６特异的。原位杂交发现，在１３例ＰＣＲＨＨＶ－６阳性的ＮＰＣ组织中１１例ＨＨＶ－６ＤＮＡ阳性。ＨＨＶ－６ＤＮＡ主要分布于癌巢的肿瘤细胞核内，少数亦可见于癌旁的异型细胞，但在淋巴细胞及正常上皮细胞内未发现阳性信号。结论：本实验用分子生物学技术首次证明，在中国ＮＰＣ患者的鼻咽石蜡组织中存在ＨＨＶ－６。ＨＨＶ－６与ＮＰ相关。

TT病毒ORF1基因在大肠杆菌中的表达

目的：表达TTVORF1蛋白，为免疫学检测TTV提供抗原。方法：以pE-30a为载体表达硫氧还蛋白与TTV第一开放读码框（ORF1）497－770aa段的融合蛋白。结果：得到分子量约为44Kda表达产物。以纯化的表达产物为抗原检测TTV DNA阳性和阴性血清表明所表达的融合蛋白具有TTV特异抗原性。结论：该TTVORF1融合蛋白可用做免疫学检测TTV感染的抗原。

传播菌DNA检测技术在肺外结核诊断中的应用

目的 建立结核菌DNA检测技术，探讨其在肺外结核诊断和治疗中的意义。方法 采用巢式PCR技术检测胸水、腹水、脑脊液和淋巴结穿刺物结核菌基因IS6110序列。结果 该技术的敏感度为70％，特异度为95．5％。结论 结果核菌DNA检测技术的应用可为肺外结核（结核性脑膜炎，结核性淋巴结炎，结核性腹膜炎和结核性胸膜炎）提供及时可靠的诊断依据，具有较好的临床应用价值。

TTV酶免疫方法的建立及其初步应用

目的：建立检测TTV的酶免疫技术，了解不同型炎患者血清中抗－TTV抗体的分布情况，并结合TTVDNA的检测，分析两者的关系。方法：以原核表达的TTV ORF1蛋白为抗原建立检测抗－TTV的ELISA方法，采用该方法检测不同肝炎患者中抗－TTV抗体；以套式PCR方法检测血清标本中TTVDNA。结果：所建立的检测TTV的ELISA方法具有较好的特异性，不同型别肝炎患者中抗－TTV抗体阳性率分别为：甲型肝炎患者10．5％（4／38），乙型肝炎患者12．5％（16／128）、丙型肝炎患者8．3％（7／84），丁型肝炎患者7．7％（1／78）。统计学分析表明，非甲－庚型肝炎患者抗－TTV阳性率显著高于其他型肝炎患者（P＜0．01），而正常人群则显著低于肝炎患者（P＜0．05）。抗－TTV阳性率与TTV DNA阳性率存在相关性（P＜0．05）。结论：在不同型肝炎患者中均可检出抗－TTV抗体，但以非甲－庚型肝炎患者阳性率高；TTV抗体可与基因同时存在于患者血清中，抗－TTV抗体可能类似抗－HCV是一传染性标志。

抗结核药物致急性肝功能衰竭死亡11例临床分析

目的 提高对抗结核药物治疗引起肝功能衰竭的认识 ,减少因抗结核治疗导致的肝衰竭和临床死亡的发生。方法 对 11例结核病抗结核治疗期发生急性肝衰竭死亡的病例和 2 2例严重肝功能损害经护肝治疗后恢复的病例的临床特点和实验室检查结果进行分析。结果 抗结核药物性所致急性肝衰竭多出现在抗结核治疗 3月以后 ,老年人多见 ,平均年龄 5 1.38± 14 .5 7岁 ,半数以上 (7/ 11)合并HBV感染 ,临床症状较明显 ,黄疸出现早而重 ,以黄疽指数升高为主的肝功能异常 ,晚期有明显的肝性脑病表现 ,腹膜炎腹水形成以及凝血酶原活动度显著降低。从症状出现到死亡时间为 6 6 .5±4 4.5d。结论 重视和监测结核病化疗引起的肝功能损害 ,对有肝功能损害尤其是以黄疸为主要表现者要及早停药进行综合护肝治疗。黄疸指数 (TBIL)比ALT及AST在指导临床治疗和判断预后更有意义。

高致病性H5N1亚型人禽流感病毒性肺炎的影像学表现特点

目的探讨高致病性H5N1亚型人禽流感病毒性肺炎的影像学检查方法及胸部X线与CT影像表现特点。方法回顾性分析2006年6月深圳接诊的首例由卫生部确诊,并经过抢救治疗痊愈的高致病性H5N1亚型人禽流感病毒性肺炎患者的相关临床及影像学资料。结果胸部影像学特点是:①磨玻璃样影、大小片状影及肺实变影是人禽流感病毒性肺炎较早出现的影像表现;②病灶侵犯肺组织广泛,表现为多叶多段的两肺广泛受累;③病灶蔓延变化迅速;④肺实质、肺间质及胸膜受累可同时存在;⑤病灶吸收慢、迁延时间长,恢复期有肺纤维化的影像表现。结论影像学检查与诊断仍然是人禽流感病毒性肺炎的临床诊断、鉴别诊断、疗效评价及预后分析的重要手段。动态观察人禽流感病毒性肺炎的影像学变化及影像学表现特点,监测ARDS和肺部继发感染等并发症的发生,利于指导临床及时有效地进行治疗。

结核分枝杆菌IFN-γ酶联免疫斑点检测的建立和初步应用

目的建立结核分枝杆菌特异性IFN-γ酶联免疫斑点(Elispot)检测技术,初步评价其在诊断结核分枝杆菌感染的敏感性和特异性。方法采用以早期分泌抗原靶6 kDa蛋白(ESAT-6)抗原为主的重组蛋白库、多肽库为抗原,建立结核分枝杆菌特异性IFN-γElispot检测技术(简称Elis-pot);应用该技术对32例肺结核病患者、205例健康对照者和18例肺部其他疾病对照的外周血结核菌特异性IFN-γ水平进行检测;结核病人和部分健康对照同时采用全血干扰素试剂(Quantiferon-TB-Gold,QFT-G)进行平行检测。结果采用Elispot检测,结核患者的阳性率最高(75.0%),显著高于健康对照(7.3%)和其他肺部疾病患者(11.1%),结核患者反应水平与其他两组比较均差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05)。采用QFT-G在结核病人中的IFN-γ应答阳性率为78.1%,与Elis-pot检测结果进行配对比较无显著性差别(χ2=1.6,P>0.05)。结论建立了结核菌特异性IFN-γElispot检测技术,该技术在诊断结核菌感染的初步应用显示出较好的特异性和敏感性,但仍需进一步扩大样本数观察。

某地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变特征分析

目的了解深圳地区结核分枝杆菌临床分离株利福平和异烟肼的耐药相关基因的突变特点。方法 60株结核分枝杆菌临床分离株通过全自动快速分枝杆菌培养鉴定系统(BACTEC-MGIT960)进行鉴定和药敏分析。在这60株菌株中,针对包括利福平耐药决定区(RRDR)在内的rpoB基因和异烟肼耐药相关位点katG315、inhA-15、kasA269、kasA312进行PCR扩增,并将扩增产物T-A克隆后进行测序。结果在60株结核分枝杆菌临床分离株中,检出利福平耐药株45株,敏感株15株;异烟肼耐药株41株,敏感株19株;利福平和异烟肼同时耐药的有14株。在45株利福平耐药株中,rpoB基因RRDR突变发生率为91.1%(41/45),共检测到12种突变形式,主要突变位点在531、526、516、533,以Ser531Leu突变最常见,占rpoB发生基因突变株的51.2%(21/45)。在41株异烟肼耐药株中,katG315位点有29株发生突变,包括28株katG315(AGC-ACC)和1株katG315(AGC-AAC)突变,突变发生率为70.7%(29/41);inhA-15位点有9株发生突变,均为(C-T)突变,突变发生率为21.95%(9/41)。kasA基因未发现常见突变形式。结论深圳地区结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药相关基因突变位点与国内外研究基本一致,但各位点频率有所不同。

肺结核患者疗程中外周血辅助性和调节性T细胞的动态研究

目的探讨辅助性T细胞17(Th17)和CD4+CD25+CD127low调节性T细胞与结核病的发病及抗结核治疗转归的关系。方法纳入对象包括32例活动性肺结核患者、25例Mtb潜伏感染者、45例健康对照者。流式细胞术检测外周血Th17细胞分泌细胞因子IL-17和CD4+CD25+CD127low调节性T细胞表达强度。结果以x±s表示,所有数据均使用Prism 4.0统计软件进行分析,两组间比较采用非配对t检验,多组间的比较采用ANOVA方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果肺结核患者组治疗前IL-17表达为(3.25±1.68)%,明显低于健康对照组[(4.62±1.46)%](F=6.633,P<0.0001)。比较活动性肺结核患者组IL-17表达在治疗前、治疗3个月[(4.17±2.27)%]、治疗6个月[(5.58±1.66)%]时的检测结果,发现治疗3个月时高于治疗前,但差异无统计学意义(F=12.244,P=0.057);而治疗6个月时明显高于治疗前(F=12.244,P<0.0001)和治疗3个月时(F=12.244,P=0.004)。健康对照组CD4+CD25+CD127low调节性T细胞表达为(4.97±1.60)%,与Mtb潜伏感染组[(5.00±1.08)%]比较,差异无统计学意义(F=11.986,P=0.937);活动性肺结核患者组治疗前表达为(6.59±1.73)%,显著高于健康对照组及Mtb潜伏感染组(F=11.986,P<0.0001)。比较活动性肺结核患者组治疗前、治疗3个月[(8.28±2.04)%]、治疗6个月[(7.46±1.87)%]时的CD4+CD25+CD127low调节性T细胞表达,发现治疗3个月时的表达明显高于治疗前(F=6.458,P=0.001);治疗6个月时的表达低于治疗3个月时(F=6.458,P=0.085),但差异无统计学意义;治疗6个月与治疗前的表达相比较,差异无统计学意义(F=6.458,P=0.068);治疗6个月CD4+CD25+CD127low调节性T细胞表达明显高于健康对照组(t=6.255,P<0.0001)。结论结核病患者外周血Th17细胞明显减少,经有效抗结核治疗后,Th17细胞逐渐增加,表明Th17细胞在抗结核免疫中起保护作用。结核病患者外周血CD4+CD25+CD127low调节性T细胞明显增多,经抗结核治疗后CD4+CD25+CD127low调节性T细胞逐渐减少,进一步说明CD4+CD25+CD127low调节性T细胞在抗结核免疫中起抑制作用。

γ干扰素释放试验在肺结核和非结核分枝杆菌肺病鉴别诊断中的应用价值

目的 探讨结核分枝杆菌特异性γ干扰素释放试验（interferon gamma release assays,IGRAs）在鉴别诊断肺结核和非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria,NTM）肺病中的应用价值.方法 选择深圳市第三人民医院2011年1月至2013年5月334例收住于肺科住院部感染了分枝杆菌的肺病患者.采用反向斑点杂交技术对334例分枝杆菌感染的肺病患者痰培养分离的分枝杆菌进行菌种鉴定;采用IGRAs测定患者外周血结核分枝杆菌抗原特异性γ干扰素（IFN-γ）应答;采用结核分枝杆菌特异性荧光定量PCR技术检测痰标本中结核分枝杆菌DNA.结果 在334例分枝杆菌感染的患者中,240例的菌株为结核分枝杆菌,94例为NTM; 240例肺结核患者中痰结核分枝杆菌DNA PCR检测阳性率为74.58％（179/240）,IGRAs检测阳性率为77.08％（185/240）;94例NTM肺病患者中,结核分枝杆菌DNA PCR检测阳性率为10.64％（10/94）,IGRAs检测阳性率为20.21％（19/94）.结核分枝杆菌DNA PCR和IGRAs检测鉴别诊断肺结核和NTM肺病的敏感度分别为74.58％（179/240）、77.08％（185/240）,特异度分别为89.36％（84/94）、79.79％（75/94）;两种方法联合检测肺结核的敏感度为%.75％（225/240）、特异度为77.66％（73/94）.结论 IGRAs对于鉴别肺结核和NTM肺病具有较好的应用价值,联合应用结核分枝杆菌DNA PCR和IGRAs可以显著增加鉴别诊断的准确性,对于早期抗结核药物的选择具有重要的指导意义.

成人H5N1亚型禽流感病毒性重症肺炎的CT表现与动态变化

目的探讨成人高致病性H5N1亚型禽流感病毒性重症肺炎的CT表现及动态变化。方法2006年6月所确诊的H5N1亚型禽流感病毒性重症肺炎成人男性患者于发病第7天、30天、40天、50天、65天及95天分别行螺旋CT及HRCT扫描。回顾性分析其CT资料并结合文献复习。结果病情严重时,CT显示肺叶或肺段大片状实变影伴支气管充气征、小淡片影及胸腔积液。病情稳定后,表现为多肺叶斑片状实变影、磨玻璃影,病灶内仍见支气管充气征。同时部分肺叶体积缩小,小叶间隔增厚、胸膜下细弧线影,相邻胸膜增厚。临床治愈出院以及近期复查时,大部分病灶消失,肺间质病灶吸收缓慢,以中叶、下叶为著。两肺散在多处条索状影,肺纹理聚集,胸膜下小叶间隔增厚,间隔旁小气肿,支气管扩张、扭曲。结论成人高致病性H5N1亚型禽流感病毒性重症肺炎的CT表现为早期肺叶实变影,逐渐发展肺实质与间质病变并存,恢复期则以肺间质病变为主。CT动态观察能较客观的反映本病的病理改变过程。

支气管动脉栓塞与结合局部应用立止血治疗肺结核咯血对照研究

目的 比较单纯支气管动脉栓塞与局部使用立止血 +栓塞治疗肺结核大咯血的疗效 ,以提高支气管动脉栓塞治疗肺结核大咯血的治愈率。方法 将 62例结核咯血病人 ,随机分成两组各 3 1例 ,分别用支气管动脉栓塞 (A组 )和支气管动脉局部用立止血 +栓塞 (B组 )的方法治疗。对两组的疗效 ,复发情况和并发症进行比较。结果 A组有效率为64 .5 % ,B组 87.1% ,两组有显著性差异 ( χ2 =4.3 0 9,P <0 .0 5 ) ;A组共行栓塞治疗 5 2次 ,B组 3 7次 ;两组均未发生脊髓梗塞 ,食管支气管瘘 ,误栓等严重并发症。结论 用立止血进行支气管动脉局部注射合并栓塞治疗能提高动脉栓塞治疗肺结核大咯血的疗效 ,局部用立止血安全、严重不良反应少。

HHV-6感染在鼻咽癌发病中的意义

目的:探讨鼻咽癌组织中人疱疹病毒6型(HHV-6)在鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma,NPC)发病中的意义。方法:PCR检测27例正常鼻咽组织、21例异型增生及42例鼻咽癌组织中HHV-6DNA和EB病毒(Epstein-barrvirus,EBV)DNA存在状况,用免疫组化检测36例NPC组织中EBVLMP1蛋白的表达及40例NPC组织中p53基因的表达。结果:异型增生和NPC组织中HHV-6DNA的阳性率分别为4.7%和26.2%,EBVDNA分别为66.6%和95.2%;正常鼻咽组织不存在HHV-6DNA,EBVDNA为25.9%。NPC组织中EBV-LMP1蛋白阳性率为47.2%,HHV-6阳性NPC中LMP1表达阳性率(81.8%)显著高于HHV-6阴性者(32.0%)。HHV-6阳性与阴性的NPC中p53表达的阳性率无显著性差异,但HHV-6阳性的NPC中p53表达强度显著性增高。结论:NPC组织中存在HHV-6的感染,与EBV-LMP1蛋白表达上调呈正相关。提示在NPC的发生中HHV-6可能直接参与和(或)通过上调EBV-LMP1的表达而起作用,并可能参与鼻咽癌发病中p53过表达的调控。