短杆菌肽A-DMPC通道内离子输运的分子动力学模拟

用最近提出的构建膜体系初始构象的有效方法 ,构建了在DMPC脂膜环境下短杆菌肽A通道模型 (GA -DMPC)。通过对Na +、Ca2 +、Cl-三种不同离子在GA -DMPC通道内不同位置的分子动力学模拟 ,研究离子在通道内输运过程中与通道及通道内水分子的相互作用 ,从分子动力学的角度阐明离子在通道内的输运机制。主要计算结果表明 :(1)离子在通道内的输运使GA的构象发生变化 ,GA的柔性是离子在通道内通透的重要因素 ;(2)Cl- 离子可扩大通道半径 ,Na+ 离子和Ca2 +离子则减小通道半径。Cl-离子不能在GA通道内通透 ;(3)离子的出现使通道内水分子的偶极方向发生变化。上述结果均与实验相符。

谷氨酰胺结合蛋白的分子动力学模拟和自由能计算

谷氨酰胺结合蛋白(Glutamine-bindingprotein,GlnBp)是大肠杆菌透性酶系统中一个细胞外液底物专一性结合蛋白,对于细胞外液中谷氨酰胺(Gln)的运输和传递至关重要.本文运用分子动力学(Moleculardynamics,MD)模拟采样,考察了GlnBp关键残基与底物Gln之间的相互作用和GlnBp两条铰链的功能差别;并采用MM-PBSA方法计算了GlnBp与底物Gln的结合自由能.结果表明:Ph13,Phe50,Thr118和Ile69与底物Gln的范德华相互作用和Arg75,Thr70,Asp157,Gly68,Lys115,Ala67,His156与底物Gln的静电相互作用是结合Gln的主要推动力;复合物的铰链区85～89柔性大,对构象开合提供了结构基础;而铰链区181～185柔性小,其作用更多是在功能上把底物Gln限制在口袋中;自由能预测值与实验值吻合.本研究很好地解释了GlnBp结构与功能的关系,为进一步了解GlnBp的开合及转运Gln的机制提供了重要的结构信息.

蛋白质-蛋白质分子对接中打分函数研究进展

分子对接是研究分子间相互作用与识别的有效方法.其中,用于近天然构象挑选的打分函数的合理设计对于对接中复合物结构的成功预测至关重要.本文回顾了蛋白质-蛋白质分子对接组合打分函数中一些主要打分项,包括几何互补项、界面接触面积、范德华相互作用能、静电相互作用能以及统计成对偏好势等打分项的计算方法.结合本研究小组的工作,介绍了目前普遍使用的打分方案以及利用与结合位点有关的信息进行结构筛选的几种策略,比较并总结了常用打分函数的特点.最后,分析并指出了当前蛋白质-蛋白质对接打分函数所存在的主要问题,并对未来的工作进行了展望.

用分子对接方法研究HIV-1整合酶与病毒DNA的结合模式

用分子对接方法研究了HIV-1整合酶(Integrase,IN)二聚体与3′端加工(3′Processing,3′-P)前的8bp及27bp病毒DNA的相互作用,并获得IN与27bp病毒DNA的特异性结合模式.模拟结果表明,IN有特异性DNA结合区和非特异性DNA结合区;IN二聚体B链的K14,R20,K156,K159,K160,K186,K188,R199和A链的K219,W243,K244,R262,R263是IN结合病毒DNA的关键残基;并从结构上解释了能使IN发挥活性的病毒DNA的最小长度是15bp.通过分析结合能发现,IN与DNA稳定结合的主要因素是非极性相互作用,而关键残基与病毒DNA相互识别主要依赖于极性相互作用.模拟结果与实验数据较吻合.

蛋白质-蛋白质分子对接方法研究进展

蛋白质分子间相互作用与识别是21世纪生命科学研究的前沿和热点.分子对接方法是研究这一课题有效的计算机模拟手段.通常,蛋白质-蛋白质分子对接包括四个阶段:搜索受体与配体分子间的结合模式,过滤对接结构以排除不合理的结合模式,优化结构,用精细的打分函数评价、排序对接模式并挑选近天然构象.结合国内外研究蛋白质-蛋白质分子对接方法进展和本研究小组的工作,对以上四个环节做了详细的综述.另外,还分析了目前存在的主要问题,并提出对未来工作的展望.

HIV-1病毒DNA与整合酶结合后的构象变化

用分子动力学(MD)模拟方法优化了HIV-1病毒DNA与整合酶(IN)二聚体(IN2)复合物模型结构,并分析了HIV-1病毒DNA结合IN2后的构象变化.结果表明,按照HIV-1病毒DNA与IN2结合能力的强度,病毒DNA可分为五个区域:非结合区、强结合区1、弱结合区、强结合区2和反应区,并用结合自由能计算验证了该分区的合理性.与未结合IN2的病毒DNA相比,复合物模型中病毒DNA除了非结合区碱基外,其它四个区域的碱基构象变化较大.复合物模型中病毒DNA主链较大程度地偏离标准B型DNA以及结合部位的小沟变宽都是识别IN的结构基础.模拟结果与实验数据吻合较好,为基于HIV-1IN的药物分子设计提供了一定的结构信息.

静电和疏水效应对胰岛素二聚体稳定性的影响

从猪胰岛素二聚体的结构出发 ,着重研究了胰岛素二聚体单体之间的静电和疏水相互作用 ,用连续介质模型的有限差分方法计算得到胰岛素二聚体的静电势 ,用溶剂可接近表面 (ASA)模型分析了分子表面积及疏水性 ,还考察了不同pH值对胰岛素二聚体静电和疏水相互作用的影响。结果分析表明 ,当pH值处于弱酸弱碱范围内时 (4.6 -8.5) ,静电相互作用能和疏水自由能都呈现出较小的值 ,当pH为6.2时 ,疏水性出现一个明显的峰值 ,这与猪胰岛素二聚体结晶的实验条件相吻合。

基于HNP三态模型及相对熵方法的蛋白质折叠研究

把20种氨基酸简化为3类:疏水氨基酸(hydrophobic,H)、亲水氨基酸(hydrophilic,P)及中性氨基酸(neutral,N),每个氨基酸简化为一个点,用其C!原子来代替.采用非格点模型,以相对熵作为优化函数,进行蛋白质三维结构预测.为了与基于相对熵方法的蛋白质设计工作进行统一,采用了新的接触强度函数.选用蛋白质数据库中的天然蛋白质作为测试靶蛋白,结果表明,采用该模型和方法取得了较好的结果,预测结构相对于天然结构的均方根偏差在0.30～0.70nm之间.该工作为基于相对熵及HNP模型的蛋白质设计研究打下了基础.

HIV-1整合酶核心区野生型和F185K突变型活性和溶解性的比较及分子动力学模拟分析

表达纯化了野生型(WT)及F185K突变型HIV-1整合酶核心区蛋白(INC),并对二者的溶解性和活性进行了比较.实验结果表明:F185K突变后INC溶解性显著提高,活性有一定程度降低.对WT和F185KINC体系进行了1800ps的分子动力学模拟.模拟结果表明:F185KINC功能loop区柔性和蛋白质整体运动性降低,使蛋白质活性降低,F185K突变后盐桥网络的变化驱动了INC局部构象改变,引起INC表面的部分疏水残基被包埋,亲水残基暴露,相对亲水溶剂可接近面积增大,同时,突变后INC与水之间形成氢键的数量增加,与水之间作用加强,以上变化使INC溶解性提高.分子动力学模拟与实验结果相吻合.为理解蛋白质溶解性和对蛋白质进行可溶性改造提供了一定的理论依据.

HIV-1整合酶蛋白的可溶性表达及功能研究

HIV-1整合酶是HIV病毒复制中一个重要的酶,也是治疗艾滋病药物的一个重要靶点。为了开展以整合酶蛋白为靶点的抑制剂筛选,构建HIV-1整合酶重组质粒,在原核细胞中进行可溶性表达和功能研究。通过重叠PCR技术引入F185K和C280S突变于HIV-1B亚型标准株的整合酶cDNA片段中,PCR扩增片段克隆到pET-28a(+)表达载体中,构建重组质粒,在E.coli中进行整合酶基因表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,亲和层析纯化蛋白,酶联免疫吸附实验方法测定整合酶的生物学活性。结果构建的重组质粒获得高效稳定的可溶性表达,ELISA实验证实该蛋白具有整合酶的3′切割DNA和5′链转移的活性。HIV-1整合酶蛋白的可溶性表达和活性研究为建立以整合酶为靶点的抗HIV药物筛选平台打下了基础。

基于MPI的分子对接并行算法

基于消息传递接口(Message Passing Interface,MPI),用两种不同的并行程序设计方法对Autodock程序进行修改.将修改后的程序应用于HIV-1蛋白酶(Protease)和小分子抑制剂XK263的对接体系,测试了并行程序的加速比和并行效率.结果表明,两种改进的并行Autodock程序都可以很好地完成计算,尤其是方案Ⅱ并行程序的加速比和并行效率更高.

阻断HIV-1进入细胞的抑制剂研究

为了解决HlV-1病毒耐药的难题，研究阻断病毒进入细胞的抑制剂是一个重要途径，通过对近年来国内外学者在阻断HIV-1病毒进入宿主细胞的抑制剂方面所发表的文献进行分析，概述了阻断HIV-1病毒进入宿主细胞的抑制剂的研究进展．阻断病毒进入细胞的抑制剂具有强大的抗逆转录病毒作用，它的优势在于可以对抗目前所有的HIV-1耐药毒株，它分为阻断病毒与细胞吸附的抑制剂、阻断病毒进入的抑制剂及阻断病毒与细胞融合的抑制剂．提出了研究抑制剂时可考虑的几个不同靶点．

HIV-1跨膜蛋白gp41螺旋结构的原核表达及功能研究

HIV-1跨膜蛋白gp41是HIV-1包膜与靶细胞膜的融合过程中的关键蛋白,是理想的HIV-1融合抑制剂靶点。为开展以gp41为靶点的抑制剂筛选,以HIV-1B亚型病毒基因为模板,通过PCR、酶切、连接等方法构建得到gp415-helix与6-helix重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,经变性和复性后亲和层析纯化蛋白。经SDS-PAGE鉴定,纯化后蛋白纯度较高。通过非变性凝胶电泳证明gp415-helix与C-多肽衍生物T-20存在相互作用,为下一步药物筛选模型的建立奠定了基础。

用两步MS-PCR结合ELISA检测HIV-1逆转录酶基因的耐药性突变

高效抗逆转录病毒治疗法(HAART)的推广使用有效地抑制了HIV-1病毒的传播和艾滋病(AIDS)的发病率、死亡率。近年来,HIV-1逆转录酶基因突变所导致的耐药性已成为HAART治疗失败的主要原因,耐药性突变的检测对于指导病人用药以及新药开发具有重要意义。发展了一种检测HIV-1逆转录酶基因耐药性突变的新方法。采用两步MS-PCR方法检测HIV-1B亚型野生型和耐药突变型逆转录酶基因突变,检测点包括M41L、K70R、K103N、Y181C和T215,并在两步MS-PCR基础上,设计比野生型引物长的突变型引物,结合微孔板杂交ELISA呈色技术检测各点突变。结果显示,简化的两步MS-PCR能保持灵敏度和特异性高的优点,ELISA的阳性结果与阴性结果的比值(P/N)达到要求,两步MS-PCR结合ELISA方法灵敏度高,操作简单、结果直观、成本低、相对耗时短且能进行高通量检测,使其无论在HIV-1耐药性突变及其它的点突变检测中都具有较好的临床应用前景。

人免疫缺陷病毒-1p66蛋白在大肠埃希菌中低温长时间诱导表达和活性鉴定

目的人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)-1逆转录酶是由p66和p51亚单位组成的异二聚体,抑制其活性可阻断HIV-1的复制,是治疗获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)的重要靶点。获得大量纯化的HIV-1 p66亚单位蛋白有助于研究其活性,为抗HIV-1药物研究提供药物筛选平台。文中构建HIV-1逆转录酶基因的原核表达系统,获取高纯度高活性的HIV-1 p66亚单位重组蛋白。方法用PCR从含HIV-1 HXB2标准株全基因的质粒中扩增出编码HIV逆转录酶p66亚单位的基因,通过酶切、连接等方法构建重组质粒pET-28a(+)-p66,并转化到宿主菌大肠埃希菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达。表达产物经镍柱亲和层析纯化后获得HIV逆转录酶p66亚单位蛋白。结果所构建了pET-28a(+)-p66质粒酶切片段为1680 bp,测序符合HIV逆转录酶p66亚单位编码基因序列。在IPTG诱导下表达相对分子质量为66 000的HIV逆转录酶p66亚单位蛋白。结论成功构建了pET-28a(+)-p66质粒,具有较高的HIV逆转录酶p66亚单位蛋白表达效率及活性。

蛋白质-蛋白质对接中打分函数的研究

通过分析蛋白质-蛋白质间的静电、疏水作用和熵效应与相对于晶体结构的蛋白质主链原子的均方根偏差(RMSD)的相关性,定量地考查了它们在蛋白质-蛋白质对接中作为打分函数评价近天然构象的能力。对7个蛋白质复合物体系的分析表明,就水化能而言,原子接触势模型(ACE)优于原子水化参数模型(ASP),且修正的ACE模型具有更好的评价近天然构象的能力;水化能与静电能结合对评价能力有进一步的提高。最后,我们将静电和修正的ACE水化能结合作为打分函数用于36个蛋白质复合物体系的对接研究,进一步证实了这两种能量项的组合能有效地将近天然结构从分子对接模式中区分出来。

磁珠分离DNA技术检测HIV-1逆转录酶基因耐药性突变

HIV-1逆转录酶基因突变导致的耐药性严重影响了药物对病人的治疗效果,耐药性突变的检测对于指导合理用药具有重要意义。发展了一种检测HIV-1逆转录酶基因耐药性突变的新方法,在两步MS-PCR方法的基础上,引入磁珠分离DNA技术并结合酶联免疫吸附检测方法(ELISA)检测逆转录酶基因耐药性突变T215F和Y181C。结果显示:MS-PCR结合磁珠分离技术和ELISA具有较高的灵敏度和特异性,阳性/阴性比值(P/N值)达到要求,突变型模板检测限为5%左右,耗时短且能进行高通量检测。无论在HIV-1耐药性突变还是其它的点突变检测中,该方法都具有较好的临床应用前景。

用荧光方法检测HIV-1整合酶的体外活性

HIV-1整合酶是抗艾滋病药物研究的一个重要靶点。整合酶催化两步反应使病毒cDNA整合到宿主细胞基因组中,该反应过程可以在体外利用重组蛋白和DNA底物实现。本研究构建了HIV-1整合酶表达载体,在大肠杆菌中诱导表达,亲和纯化得到重组整合酶蛋白,利用荧光染料标记DNA底物分子和荧光标记抗体,通过荧光信号检测整合酶对DNA的切割和连接两步反应,达到检测整合酶体外活性的效果。该方法具有灵敏度高、特异性好等优点,便于开展以整合酶为靶点的药物筛选等工作。

HIV-1辅助受体的研究进展

综述了HIV辅助受体研究的新进展,特别是有关细胞嗜性、CXCR4在介导病毒进入细胞中的作用、gp120与CXCR4的作用区域、CCR5的结构及其在介导病毒进入细胞中的作用、gp120与CCR5的作用区域。人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染细胞时,病毒先附着在细胞表面的CD4分子上,除CD4外,还需要辅助受体的帮助病毒才能进入细胞,其中两种主要的辅助受体是CXCR4和CCR5。通过对HIV辅助受体的研究可为研制抗艾滋病新药提供更多的理论依据。

HIV-1 gp41蛋白与其抑制剂NB-2的结合模式

为了设计以HIV-1跨膜蛋白gp41为靶点的抑制剂,采用分子对接、分子动力学模拟及自由能计算方法研究了gp41与其抑制剂NB-2的结合模式,利用从头药物设计方法,通过改造NB-2的结构,设计了有效的gp41选择性抑制剂,并用分子对接方法评价了这些新化合物的结合模式和能力.从分子对接结果得到2种主要的NB-2与gp41的结合模式.分子动力学模拟和自由能计算结果表明,结合模式1优于模式2,所以模式1是比较合理的结合模式.从结合模式1出发设计了103个新的化合物,这些化合物具有已知gp41抑制剂所没有的结构特征且大部分化合物比NB-2与gp41的结合自由能低.得到的结合模式合理解释了NB-2与gp41的相互作用.